浸漬ビーズアッセイを用いたニワトリ胚発生時の細胞分化、形態形成、パターニングの解析

Summary

浸漬ビーズアッセイは、細胞分化および形態形成の調節を研究するために、任意の発生時点で試験試薬の標的送達を含む。任意の実験動物モデルに適用可能な、3つの異なるタイプの浸漬ビーズを調製し、これらをニワトリ胚の桁間に移植するための詳細なプロトコールが提示される。

Abstract

胚発生中に多数の遺伝子プログラムが活性化され、細胞分化を調整して、驚くほど多様な体細胞、組織、臓器を生み出します。これらの遺伝子プログラムの正確な活性化は、異なる閾値で細胞の運命を導く拡散性分子である形態原体によって調節される。遺伝的活性化が形態形成をどのように調整するかを理解するには、発生中に形態素によって引き起こされる局所相互作用の研究が必要である。胚の異なる領域に移植されたタンパク質または薬物に浸したビーズを使用することで、数字の確立および他の発生過程における特定の分子の役割を研究することができる。この実験技術は、細胞誘導、細胞運命、およびパターン形成の制御に関する情報を提供する。したがって、この浸漬ビーズアッセイは、他の胚モデルに適用可能な非常に強力で貴重な実験ツールです。

Introduction

胚発生中の遺伝子発現を制御する分子メカニズムのブレークスルーにより、細胞の運命がどのように決定されるかを理解することができました。異なる細胞系譜へのコミットメントは、細胞が転写因子の分子発現を開始すると起こる¹。この発現パターンは、空間および時間において高度に協調的であり、それによって、細胞、組織、および器官の整形、位置決め、およびパターニングを指示する¹、²、^3、4、5。胚性誘導は、細胞の潜在能力を制限する階層を確立することによって細胞が特定の系統にコミットされるプロセスであり、Spemannオーガナイ^ザー6,7で起こるような基本的なボディプランの生成も含まれる。この胚盤胞背唇は、宿主胚^8、9において第2胚軸を誘導する。今日、移植および分子アプローチと組み合わせた他の古典的な実験の助けを借りて、異なる転写因子および成長因子がSp....

Protocol

この研究は、メキシコ国立オートノーマ大学(UNAM、メキシコ、メキシコ)の実験動物の世話と使用のための治験審査委員会によってレビューされ、承認されました。

1. 卵子の孵化と胚の病期分類

注:受精鶏の卵は地元の農場から入手することができます。受精ホワイトレグホーン鶏の卵が最も一般的に使用されています。受精したばかりの鶏卵を15°Cで孵化前に最大1週間保管してください。

1. 受精した鶏の卵を、38°C、相対湿度70%の加湿インキュベーターで、28HH段階に達するまで尖った面を下にして垂直に孵化させる(Hamilton and Hamburger、1951によると約5.5日)²²。孵卵中に卵子を回転させて、胚が卵殻膜に付着するのを防ぎます。
   注:発達段階の選択は、実験目的によって知らされる。この場合、28HHステージは、異所性桁を誘導するか、または細胞死を促進するための桁間ビーズ移植に最適です。
2. インキュベーターから卵を取り出し、70%エタノールで拭き取り、風乾させます。作業領域、顕微鏡、器具を70%エタノールで消毒します。
3. 卵をキャンドルで固定して血管を識別し、胚を見つけます。胚を持たない卵子を捨てる。
4. 歯のない鉗子の端を使って、卵の鈍い端を叩いて約5個の卵で窓....

Results

浸したビーズを使用して、胚性のひよこの四肢の細胞挙動を評価する
このアッセイの有効性を保証するために、ビーズは一貫して正確に正しい位置に配置されなければならない。この場合、頂端外胚葉隆起の下にある第3桁間部の遠位最遠位がAER(図1A)となる。この位置決めにより、問題の分子はデジタル間組織全体に均等に広がることができます。さらに、AERの下のゾーンには、治療に容易に応答する未分化細胞が含まれています。細胞分化への影響を評価するために、胚をアルシアンブルーおよびアリザリンレッドで染色して、骨格要素の形成を証明できる(図1B)。浸漬ビーズアッセイは、ニュートラルレッドによる細胞死(図1C)および in situ ハイブリダイゼーションによる遺伝子調節(図1D)の評価にも適しています。スケールバーは250μmに設定されています。

Discussion

このプロトコールで詳述されている実験ツールの主な利点は、所与の実験分子に浸されたビーズへの曝露の時間と位置を制御できることである。正しい位置決めと正確な発生タイミングを組み合わせることで、細胞分化過程を研究する大きな可能性を秘めています。これらの実験を未分化組織で行うことで、細胞系譜における最初の重要な事象を調査することができます。例えば、TGFß浸漬ビーズを胚性四肢28HHのデジタル間組織に配置すると、マスター遺伝子 Sox9²⁵の遺伝子発現を誘導する分子カスケードがトリガーされる異所性桁の形成をもたらす。驚くべきことに、誘導された軟骨組織はまた、指骨形成を伴う数字に組織化される。

興味深いことに、RAは、未分化細胞の細胞運命を細胞死に向けて導く骨形成タンパク質の遺伝子発現を調節することによって、同じデジタル間領域における細胞死を誘発する¹⁰。したがって、細胞分化、細胞死、形態形成、およびパターニングは、胚の同じ領域において同時に調査することができ、関心のある任意の.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affi-Gel Blue Gel ビーズ	Bio-Rad	153-7302
AG1-X2 ビーズ	Bio-Rad	1400123
卵インキュベーター	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Fine surgical Forceps	Fine Science Tools	9115-10
Heparine Sepharose beads	Abcam	ab193268
ペトリ皿	Nest
実体顕微鏡	ツァイス	ステミ DV4
テープ	NA	NA
タングステン針	GoodFellow	E74-15096/01