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方法論記事

単離灌流マウス心臓における過分極[1-13 C]ピルビン酸および13C/31P NMR分光法による心臓代謝の調査(英語)

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DOI:

10.3791/63188

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2023年4月21日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

この記事について

サマリー

過分極した 13C標識代謝物を連続灌流モードで単離灌流マウス心臓に投与するための実験セットアップについて説明します。専用の 13C-NMR取得アプローチにより、代謝酵素活性をリアルタイムで定量でき、マルチパラメトリック 31P-NMR分析により、組織のATP含有量とpHを測定できました。

要約

代謝は細胞生活における重要なプロセスの基礎です。生体組織における代謝ネットワークの機能を評価することは、疾患のメカニズムを理解し、治療法を設計するための重要な情報を提供します。この研究では、逆行性灌流マウス心臓の細胞内代謝活動をリアルタイムで研究するための手順と方法論について説明します。心臓は、心筋虚血を最小限に抑えるために心停止と併せてその場で単離され、核磁気共鳴(NMR)分光計内で灌流されました。分光計内および連続灌流下で、過分極[1-13 C]ピルビン酸を心臓に投与し、その後の過分極[1-13C]乳酸および[13C]重炭酸塩産生速度は、乳酸デヒドロゲナーゼおよびピルビン酸デヒドロゲナーゼ産生の速度をリアルタイムで決定するのに役立ちました。この過分極[1-13C]ピルビン酸の代謝活性は、生成物選択的飽和励起獲得法を用いて、モデルフリー方式でNMR分光法で定量されました。31名P分光法は、心臓エネルギーとpHを監視するために、過分極取得の間に適用されました。このシステムは、健康なマウスと病気のマウスの心臓の代謝活性を研究するのにユニークに有用です。

概要

心臓代謝の変化は、さまざまな心筋症に関連しており、多くの場合、根底にある病態生理学的メカニズムの基礎を形成します1。しかし、ほとんどの生化学的アッセイでは組織の均質化と細胞溶解および/または放射性トレースが必要であるため、生体組織の代謝を研究するには多くの障害があります。したがって、生体組織における心筋代謝を調べるための新しいツールが急務となっています。過分極した 13C標識基質の磁気共鳴(MR)は、標識部位のMR信号対雑音比(SNR)を数桁3増加させることにより、電離放射線を使用せずに生体組織2の代謝のリアルタイム測定を可能にします。ここでは、単離されたマウス心臓の急速な代謝を研究するための実験セットアップ、獲得アプローチ、および分析アプローチについて説明し、並行して、一般的な組織エネルギーと酸性度の指標を提示します。心筋虚血、不適応肥大、心不全などの心臓病や状態の初期段階では酸塩基バランスが崩れるため、心臓のpHは貴重な指標です6。

過分極[1-13 C]ピルビン酸からの過分極[1-13C]乳酸および[13C]重炭酸塩の生産は、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)の産生速度を決定するのに役立ちます。単離されたげっ歯類の心臓で過分極基質を使用して行われた以前の研究のほとんどは、複雑な速度論モデルを使用してLDHとPDHの酵素活性を導き出すか、実際の酵素活性率を計算せずに過分極産物の基質に対するシグナル強度比を報告しました2,4,5,6,7,8,9,10、11,12,13,14。ここでは、モデルフリー様式での酵素活性のモニタリングを可能にする生成物選択的飽和励起アプローチ15、16を用いた。このようにして、絶対酵素速度(すなわち、単位時間当たりに生産される生成物のモル数)を決定した。31名P分光法を利用して、無機リン酸(Pi)、ホスホクレアチン(PCr)、およびアデノシン三リン酸(ATP)のシグナルを観察しました。マルチパラメトリック分析を使用して、組織のPi信号の不均一な化学シフトによって実証されるように、心臓のpH分布を特徴付けました。

逆行性灌流マウス心臓(Langendorff heart)17,18,19は、無傷の拍動心臓のex vivoモデルです。このモデルでは、心臓の生存率とpHは少なくとも80分間保存され20、長期の虚血性損傷後の回復の可能性を示しています21,22。それにもかかわらず、顕微手術中の不注意な変動は、心臓全体の組織生存率の変動につながる可能性があります。以前の研究では、この心臓の経時的な劣化が報告されています19。例えば、1時間当たり5%〜10%の収縮機能の低下が観察されている18。アデノシン三リン酸(ATP)シグナルは、心筋のエネルギー状態および生存率について報告することが以前に示されている23。ここでは、灌流された心臓は、ATP含有量によって示されるように、中断のない灌流と酸素供給があったにもかかわらず、生存率レベルに意図しない変動を示すことがあることに注意しました。ここでは、LDHおよびPDH率を心臓のATP含有量に正規化すると、これらの率の心臓間変動が減少することを示しています。

以下のプロトコルでは、NMR分光計での心臓カニュレーション、分離、およびその結果としての灌流に使用される外科的処置について説明します。注目すべきことに、マウス心臓を単離し灌流することを目的とした他の外科的アプローチは、24,25より前に記載されている。

鼓動する心臓の酵素速度(13 C分光法と過分極[1-13C]ピルビン酸を使用)および心臓の生存率と酸性度(31P NMR分光法を使用)に関連するデータを取得するために使用される方法論についても説明します。最後に、代謝酵素活性と組織の生存率と酸性度を決定するための分析方法論について説明します。

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プロトコル

ヘブライ大学とハダサ医療センターの合同倫理委員会(IACUC)は、動物福祉の研究プロトコル(MD-19-15827-1)を承認しました。

1. クレブス・ヘンゼライトバッファー調製

  1. 実験の前日に、クレブスヘンゼライトバッファー(KHB)26の修正バージョンを準備します。最初に、118 mM NaCl、4.7 mM KCl、0.5 mM ピルビン酸、1.2 mM MgSO 4、25 mM NaHCO3、および1.2 mM KH 2 PO4を二重蒸留H2Oに溶解します。
  2. この混合物を95%/5%O2 / CO 2で20分間バブリングし、次に1.2 mM CaCl2を加えます。
  3. バッファーのpHをHClまたはNaOHで7.4に調整します。
  4. 実験当日、ステップ1.2で調製したKHBに10 mMグルコースと72 U/Lインスリンを加えます。
    注:インスリンは、Kolwiczらの研究26に記載されているように灌流バッファーに追加され、インスリンが収縮機能27と過分極[13C]重炭酸塩信号28の強度を増加させることを報告している以前の研究と一致しています。

2.灌流システムの準備

  1. 200 mLのKHBのリザーバーを40°Cの水浴に保ち、心臓灌流の前に95%/5%O2 / CO2を4 L / minの流速で1時間泡立てます。実験中、バッファーをこのガス混合物で継続的に泡立て続けます。
    1. まず、ウォーターバスを40°Cに設定します。 KHBリザーバーを挿入します。ペリスタルティックポンプ( 材料表を参照)と医療グレードの延長チューブを使用して、バッファーリザーバーと10 mm NMRチューブの間でKHBを7.5 mL/minの一定流量で再循環させます。
    2. 3本の白金硬化シリコーンチューブ(内径3 mm)をポンプに接続します(KHバッファー用の流入チューブ1本と流出チューブ2本)。流出ラインと流入ラインを加熱されたKHバッファーに挿入します。次に、加熱されたKHバッファーに酸素ラインを挿入します。
    3. 細いポリエーテルエーテルケトン(PEEK、 材料表を参照)ラインを使用して、バッファーと過分極剤が分光器のボア内のNMRチューブとの間で流れるようにします。
  2. 温度が37〜37.5°Cに維持されていることを確認してください。 以下の手順に従ってください。
  3. 流入ライン(バッファーリザーバーからNMRチューブまで)を42°Cに設定した加熱テープで包みます。
  4. 分光器内のNMRチューブを、分光器によって調節される温風で加熱します。
  5. NMR対応の温度センサー( 材料表参照)を使用して、NMRチューブ内の温度を測定します。温度は37〜37.5°Cに調整されます。

3. 取得用NMR分光計の校正と準備

  1. 実験当日、1,4-ジオキサンを含む13C標準試料(材料表)を分光器に挿入し、NMRプローブを13°Cに調整して一致させます。次に、ナットレーション角90°の1,4-ジオキサンの熱平衡シグナルを示すスペクトルを取得します。
  2. 次に、13C標準サンプルを、D2O中に105 mMのATPを含む31P標準サンプル(材料表)と交換します。 NMRプローブを31Pに調整して一致させます。
    注:熱平衡リン酸信号を示すスペクトルは、ナットレーション角50°で得られます。
  3. 流入ライン、流出ライン、温度プローブを10mmNMRチューブに挿入し、磁気ボアに挿入します。加熱テープを42°Cに調整します。
  4. その実験で使用する循環KHバッファーの31P NMRスペクトルを、ナットレーション角度50°、TR1.1秒で30分間取得します(1,640回の取得)。

4.動物の準備、外科的処置、およびNMRチューブ内の心臓の灌流

  1. オスのHSD:ICR(CD-1)マウスを室内空気中の3.3%イソフルラン(材料表)で340 mL /分で5分間麻酔し、誘導チャンバー内のガス麻酔システム(材料表)を使用します。
  2. 2.9%イソフルランによる全身麻酔の維持に鼻麻酔を使用する。
    注:動物への痛みや不快感を最小限に抑えるように注意が払われています。
  3. 動物の手足をテープで固定し、負のペダル痛反射を確認してから、300IUのヘパリンナトリウムを腹腔内に注射します。
  4. マウスの胸壁と腹部を70%アルコールで完全に濡らして、清潔さを確保し、外科的処置中の髪の汚染や閉塞を防ぎます。
  5. ヘパリン注射の1分後に、小さなハサミで腹腔の皮膚と筋肉を切ります。
  6. 剣状突起と胸部皮膚の間に小さな湾曲した顎の止血剤ロック蚊取りを配置して、胸部を持ち上げ、横隔膜を露出させます。横隔膜の右葉を穿刺して切断します。
  7. 正中線を横切って胸を切り、側面に引っ込めてから取り外します。
  8. 血液凝固を防ぐために、心臓の左心室に200IUのヘパリンナトリウムを注射します。次に、前述のように、0.1 mLの氷冷0.5 mol / L KClを注入して心停止を達成します25。心停止は、心臓をカニューレできるようにするために不可欠です。
  9. 胸腺を特定し、ハサミを使用して胸腺を取り除き、大動脈を露出させます。残りの胸郭組織を取り除きます。
  10. 大動脈弓を特定し、湾曲した鉗子を使用して、上行大動脈の周りに3-0シルク縫合糸(材料表)で緩い結び目を配置します。3 mLのKHBを左心室に注入し、大動脈から血栓を取り除きます。
  11. 湾曲した鉗子を使用して心臓を下方に引っ込め、上行大動脈をよりよく視覚化します。
  12. 22 Gの静脈内カテーテルを使用して その場で カニューレ挿入を行います(材料表)。カニューレ領域にシアノアクリレート接着剤を塗布し、二重縫合結を行います。追加のKHバッファーを心臓に注入し、カニューレチューブを通って流れることを確認します。
  13. 湾曲した鉗子を取り外します。心臓を周囲の内臓から切り離し、静脈内カテーテルを通して氷冷KHB(4°C)で逆行的に灌流します。
  14. 心臓を静脈内カテーテル を介して 灌流システムの流入ラインに接続します。7.5 mL / minの温かいバッファー(37-37.5°C)による灌流を開始すると、心臓は自発的に鼓動し始めます。
  15. NMRチューブを鼓動する心臓、流出ライン、温度プローブで固定し、心臓がNMRプローブの中心にあることを確認しながら分光器のボアに挿入します。

5. 心臓エネルギーとpHのデータ取得

  1. 31Pスペクトルをフリップ角度50°、TR1.1秒で約1時間取得します。

6. DNPスピンの偏極と溶解

  1. [1-13C]ピルビン酸の28.5 mg製剤を調製します。.この製剤は、ニート酸中の11.1mM〜14.0mM OX063ラジカルからなる。
  2. 4 mLの溶解培地を調製します。溶解媒体は、11.2 mM NaH 2 PO 4、38.8 mM Na 2 HPO4、33 mM TRIS、および2mM HClを含むTRISリン酸バッファーで構成されています。この培地組成は、28.5 mgの[1-13C]ピルビン酸製剤をこのバッファー4 mL(溶解段階)に添加すると、得られる溶液のpHが7.4になるように調整されます。
  3. 溶解DNP(dDNP)スピン偏極装置でスピン偏極と高速溶解を製造元の指示に従って実行します(材料表)。[1-13 C]ピルビン酸製剤の偏光のために、94.110GHzの周波数でマイクロ波照射を適用します 1.45 K〜1.55 Kで約1.5時間。
  4. dDNPデバイスからの4 mLの過分極培地を、過分極溶解媒体を補完する十分に酸素化された溶液とすばやく混合して、灌流媒体に密接に一致する組成を得ます。
    注:14 mMの過分極[1-13C]ピルビン酸による過分極注射中に心臓に灌流する培地の最終容量は26mLです。.注入された培地の最終組成(混合後)は、4.7mM KCl、1.2mM MgSO4、70mM NaCl、25mM NaHCO3、1.2mM KH 2PO4、10mMグルコース、1.2mMCaCl2、および72U/Lインスリンを含有する。
  5. 過分極[1-13C]ピルビン酸含有培地を連続フローセットアップ29を用いて単離心臓に投与する。
    注:これは、実験中のどの時点でも心臓灌流が妨げられず、過分極培地が既知の速度と既知の期間投与されることを保証するために行われます。

7. 過分極 13°C分光法

  1. 前述のように、2.5msのカーディナルサイン(Sinc)パルスを適用することにより、製品選択的飽和励起パルス15を使用して過分極13Cデータを取得します15,16。[1-13 C]乳酸塩と[13C]重炭酸塩を6秒間隔で連続して選択的に励起し、各代謝物について12秒間隔を取得します。.
  2. [1-13 C]乳酸の検出では、選択的Sincパルスを[1-13C]ピルビン酸ハイドレート周波数(179.4 ppm)の中心に置き、[1-13 C]ピルビン酸と[1-13C]乳酸のC1シグナルの信号強度比(lac)は0.113になります。
  3. [13 C]重炭酸塩の検出では、[13C]重炭酸塩信号(161.1 ppm)の214 Hzダウンフィールドである157.7 ppmに選択的Sincパルスを中心とします。これにより、[1-13C]ピルビン酸のC1シグナルと[13 C]重炭酸塩の信号強度比(BIC)は0.139になります。

8.組織の湿重量と体積の決定

  1. 実験の最後に、心臓を灌流システムから切り離し、ティッシュペーパーでやさしく乾かします。続いて、心臓の重量を測定し、組織湿重量を得る。
  2. マウス心臓30について以前に決定したように、1.05g /cm3の密度係数を使用して心臓の体積を決定します。

9. ATP含有量の定量化

  1. ATP標準サンプルの1回の取得と、単離された心臓の30分間の取得(TR1.1秒および1,640の取得)のγ-ATPシグナルを統合します。
  2. 心臓のγ-ATP信号の積分を標準(材料表)の積分(後者の濃度が既知の105 mM)と比較し、取得数とリラクゼーション効果を補正することにより、心臓のATP含有量を定量化します。

10.心臓のPi信号を解決する

注:組織のpHを評価するには、まず心臓のPi信号を総Pi信号(Pit)のPi信号からデコンボリューションする必要があります。これは、KHB Pi (PiKH) の信号をPi t の信号から省略することによって行われます。

  1. 単一のPi信号を示すKHBの31Pスペクトル(Pi KH、図1A)で、Excelを使用してPiKH信号をローレンツ関数に適合させます(材料表)。
  2. NMRプローブから見える体積(Vp、1.375 mL)は、サンプル管に心臓が含まれていない場合により多くのKHBを含む。この充填効果を補正するには、式1Aを使用して減衰バッファ信号(Pib)を計算します。
    figure-protocol-1式 1A
    ここで、Vh は、ステップ8で決定された心臓の体積です。
  3. 式1Bに従ってPit からこの信号を差し引いて、灌流した心臓からのみ生じるPi信号を取得します(Pih、 図1B)。
    figure-protocol-2式 1B

11. マルチパラメトリックpH分析

  1. 式2を用いてPCrの化学シフトを基準としたPih シグナルの化学シフト分布のpHへの変換を行う 式 231.
    figure-protocol-3式 2
    ここで、Δδは化学シフト差、pKaは6.72、遊離塩基δ 5.69、遊離酸δ 3.27であり、前述のように31である。
  2. Lutzら32に従って、PihケミカルシフトスケールとpHスケールの間の非線形性について、結果のpH分布曲線を修正します。この計算から得られる典型的なpH分布を図1Cに示します。
  3. Lutzらの研究に続く7つの統計パラメータを使用して、マルチパラメトリックアプローチで組織のpH分布を分析します。32.これらのパラメータのうち4つは、組織のpHを最も記述しているように見えるため、ここに示されています:1)グローバル最大pH;2)加重平均pH;3)加重中央値pH;4)pHプロットの歪度(図1C)。

12. LDHおよびPDH活動の計算

注:過分極代謝物[1-13 C]乳酸および[13C]重炭酸塩の生成速度は、それぞれLDHおよびPDH活性を計算するために使用されます。生成物選択的飽和励起アプローチ15では、新たに合成された過分極代謝産物のみが各選択的励起によって検出される。

  1. 過分極[1-13C]ピルビン酸シグナルを基準として使用して、対応する代謝物産生レベルを決定します。.
    1. 過分極培地との灌流中、NMRチューブ内の[1-13C]ピルビン酸濃度は増加し(ウォッシュイン)、次にプラトー(最大濃度14 mM)、その後減少します(ウォッシュアウト)。
    2. ピルビン酸濃度が一定のレベル(プラトー)に達した時点を特定するには、有効緩和定数Teffを使用して、T1緩和およびRF脈動に起因する信号減衰について[1-13C]ピルビン酸信号を補正します。
    3. 各注入について、[1-13C]ピルビン酸崩壊曲線を補正してこの流れのダイナミクスを示す能力に基づいてT effを定義します(式3)。
      figure-protocol-4式 3
      ここでfigure-protocol-5、[13 C]重炭酸塩の取得中に取得された[1-13C]ピルビン酸シグナルです。本明細書に記載の実験における平均Teffは、35.8秒±2.3秒(n=5ハート)であることが判明した。
    4. さらなる分析のために、濃度が最大補正された[1-13C]ピルビン酸シグナルの10%以内にあるデータポイントを選択します。
  2. 代謝物シグナルのSNRが2(分析のしきい値)より大きい場合、ステップ12.1で選択された時点の[1-13C]乳酸および[13C]重炭酸塩産生の対応するデータを使用して、式4Aおよび式4Bを使用した代謝産物産生率の計算を行います。.このような時間ポイントの選択の典型的な例を図2B(強調表示された時間ウィンドウ)に示します。
  3. 式4Aと式4Bを使用して、選択した各データポイントの生産率を計算します。
    figure-protocol-6式 4A
    figure-protocol-7式 4B
    ここでfigure-protocol-8、 はfigure-protocol-9、それぞれ各時点での[1-13 C]乳酸または[13 C]重炭酸塩の生成速度です。 はfigure-protocol-10、[1-13 C]ピルビン酸と生成物[1-13 C]乳酸または[13C]重炭酸塩の相対的励起を表す因子です。figure-protocol-11これらの因子は、それぞれ0.113および0.139であると以前に決定された29。VpはNMRプローブ(1.375 mL)によって検出される体積であり、TRは2つの連続した生成物選択的飽和励起間の時間間隔(各生成物について12秒) figure-protocol-12 figure-protocol-13を示し、それぞれ[1-13 C]乳酸および[13 C]重炭酸塩のシグナルであり、[figure-protocol-14figure-protocol-151-13C]乳酸および[13 ]乳酸の間に取得された[1-13C]ピルビン酸のシグナルである。C]重炭酸塩励起、それぞれ。[Pyr]は[1-13C]ピルビン酸濃度であり、プラトー期には14mMであった。
    1. 各ポイントのレートを決定し、次に過分極注入ごとの平均を決定します。

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結果

KHBを灌流したマウス心臓およびバッファーのみから記録した 31Pスペクトルを 図1Aに示します。α、β、およびγ ATP、PCr、およびPiのシグナルが心臓で観察されました。Pi信号は2つの主要な成分で構成されていました:より高いフィールド(信号の左側)では、Pi信号は主にpH7.4のKHBによるものでした。下のフィールド(信号の右側)では、Pi信号はより酸性の環境のためにより広く、均質ではありませんでした。後者のパターンは心臓組織から生じる。心臓組織のPi信号は、KHBのPi信号を差し引いて抽出され(図1B)、ppmスケールからpHスケールに変換されます(図1C)。pHは、加重平均、加重中央値、グローバル最大値、および歪度を計算することにより、組織Pi信号のマルチパラメトリック分析を使用して調査されます(図1C)。

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ディスカッション

分離されたマウス心臓モデルで過分極[1-13C]ピルビン酸代謝、組織エネルギー、およびpHを調査するように設計された実験セットアップを示します。

プロトコル内の重要なステップは次のとおりです:1)バッファーのpHが7.4であることを確認する。2)バッファのすべてのコンポーネントが含まれていることを確認する。3)ヘパリン注射による心臓血管内の血液凝固の回避;4)代謝活性を低下させることによって心臓への虚血性損傷を回避する(KCl注射および氷冷緩衝液);5)処置の任意の時点で心臓への気泡の導入を避ける。6)濃い赤から薄いピンクに変化する組織の色による大動脈のカニュレーションの成功を検証する。7)心臓が温かい緩衝液に移動した後、灌流が連続的であることを確認する。8)心臓の隣の分光器でNMRチューブ内の温度を注意深く監視し、37°Cに保ちます。9)測定中の磁場の均一性をチェックする。10)RFパルスの正確で更新されたキャリブレーションを使用します。

技術の変更とトラブルシューティング

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謝辞

このプロジェクトは、助成金契約番号1379/18に基づいてイスラエル科学財団から資金提供を受けました。イスラエル科学技術省の応用工学科学省のジャボチンスキー奨学金は、D.S.の直接博士課程の学生番号3-15892です。助成金契約第858149号(AlternativesToGd)に基づく欧州連合のホライズン2020研究およびイノベーションプログラム。

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材料

31
この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Equipment
HyperSense DNP 偏光器Oxford Instruments52-ZNP91000HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer RS2DNMR Cube、5.8 T、10 mm広帯域プローブ
ペリスタルティックポンプを装備 コールパーマー07554-95
プローブOsensaFTX-100-LUX +NMR互換温度プローブ
Somnosuite低流量麻酔システムケントサイエンティフィック
<ストロング>ライン、チューブ、縫合糸
プラチナ硬化シリコーンチューブコールパーマーHV-96119-16L / S 16 ID、3.1 mm 
薄いポリエーテルエーテルケトン(PEEK)ラインチャーチサイエンティフィックid.0.040 "
静脈カテーテル BDの医学38132322 G
の絹の縫合EthiconW577H3-0
Chemicalsおよびpharmaceuticals
[1-13C]ピルビン酸ケンブリッジ同位体研究所CLM-8077-1
カルシウムΣAldrich21074CAS:10043-52-4
D-(+)-グルコースSigma-AldrichG7528CAS: 50-99-77
ヘパリンナトリウム RotexmedicaHEP5A0130C0160
塩酸 37%Sigma-Aldrich258148CAS: 7647-01-0
インスリンアスパルト (NovoLog)ノボ ノルディスク
イソフルランテレル
マグネシウム硫酸塩Sigma-Aldrich793612CAS:7487-88-9
カリウムSigma-AldrichP4504CAS:7447-40-7
リン酸カリウム一塩基性Sigma-AldrichP9791CAS:7778-77-0
重炭酸GadotグループCAS:144-55-8
塩化ナトリウムSigma-AldrichS9625CAS:7647-14-5
ナトリウム水酸化物Sigma-Aldrich655104CAS:1310-73-2
ナトリウム二塩基性Sigma-AldrichS7907CAS:7558-79-4
ナトリウム一塩基性二水和物ク6345CAS:13472-35-0
TRIS(バイオテクノロジーグレード)Amresco0826CAS:77-86-1
Trityl radical OX063GE Healthcare ASNC100136OX063
NMR標準試料
13C標準試料ケンブリッジ同位体研究所DLM-72A40%p-ジオキサン
標準試料自社105 mM ATPおよび120 mM フェニルホスホン酸をD2O
ソフトウェア
Excel 2016マイクロソフト
MNovaMestrelab Research
温度アップ糸の塩化塩化ナトリウム リン酸リン酸メル ベンゼン-D6P中の製

参考文献

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