方法論記事

HEK293T細胞における結合およびエンドサイトーシスを追跡するための量子ドット共役SARS-CoV-2スパイク三量体のハイスループット共焦点イメージング

DOI：

10.3791/63202

⸱

2022年4月21日

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1National Center for Advancing Translational Sciences, 2Optical Sciences Division, Code 5600, Naval Research Laboratory, 3Jacobs Corporation

この記事について

サマリー

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このプロトコルでは、組換えSARS-CoV-2スパイクにコンジュゲートした量子ドットは、細胞ベースのアッセイを可能にし、原形質膜でのhACE2へのスパイク結合およびその後の細胞質への結合タンパク質のエンドサイトーシスをモニターする。

要約

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細胞蛍光顕微鏡法の新技術の開発により、創薬のためのハイスループットスクリーニング方法が容易になりました。量子ドットは、明るく安定したフォトルミネッセンスと狭い発光帯を吹き込んだ優れた光物性を有する蛍光ナノ粒子である。量子ドットは球状の形状であり、表面化学を適切に修正して、細胞用途のために生体分子を共役するために使用することができる。これらの光学特性は、生体分子でそれらを機能化する能力と相まって、受容体 - リガンド相互作用および細胞輸送を調査するための優れたツールとなる。ここでは、量子ドットを使用してSARS-CoV-2スパイクタンパク質の結合およびエンドサイトーシスを追跡する方法を提示する。このプロトコルは、細胞生理学の文脈におけるタンパク質間相互作用およびトラッキングを研究するために量子ドットを利用しようとしている実験家のためのガイドとして使用することができる。

概要

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蛍光顕微鏡により、研究者は特殊な色素1、遺伝的にコードされた蛍光タンパク質2、および量子ドット(QD)3の形の蛍光ナノ粒子を使用して、細胞の内部の仕組みを覗くことができます。2019年の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(SARS-CoV-2)の世界的なパンデミックのために、研究者は蛍光顕微鏡法を使用して、ウイルスが原形質膜と細胞質の両方で細胞とどのように相互作用するかを理解しました。例えば、研究者らは、ビリオン表面のSARS-CoV-2スパイクタンパク質とヒト細胞表面のヒトアンジオテンシン変換酵素2(hACE2)との結合、その後の原形質膜での融合によるインターナリゼーション、およびスパイク:hACE2タンパク質複合体のエンドサイトーシスに関する洞察を得ることができました4,5。また、他の多くのウイルスと同様に、ゴルジ体から出芽する伝統的な小胞を介して発生すると考えられていたコロナウイルスのユニークな特徴である細胞蛍光イメージングを使用して、リソソームを介して細胞からSARS-CoV-2が出ることについても大きな洞察が得られました6。生物学的研究のほぼすべての側面の柱である....

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プロトコル

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本研究で用いたHEK293T細胞株は、不死化細胞株である。ヒトまたは動物の被験者は、この研究において使用されなかった。

1. 細胞の培養と播種

  1. 滅菌バイオセーフティキャビネット内で、個人用保護具(ラボグローブ、ラボコート、安全メガネを含む)を着用し、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)に10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)、および250μg/mL G418を補充して細胞培養培地を準備します。
    1. 500 mL の培地に、443.75 mL の DMEM、50 mL の FBS、5 mL の P/S、および 1.25 mL の G418 を加えます。
    2. 0.2μmのフィルターフラスコを通してろ過し、細菌汚染を避けるために無菌性を維持してください。
  2. 滅菌バイオセーフティキャビネットの内部に、黒色の透明底のポリD-リジンコーティングされた96ウェルプレートの内部60ウェルに、細胞培養培地1ウェルあたり100μLで20,000個の細胞を播種する。外側の36ウェルを1ウェルあたり100 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で満たします。
    1. 細胞を計数するために、2 μLのアクリジンオレンジおよびヨウ化プロピジウム染色剤を18 μLの細胞懸濁液に加える。
    2. この溶液10 μLを細胞計....

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結果

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治療すると、ナノ粒子が原形質膜上のACE2に結合し、エンドサイトーシスを誘導するため、QDは内在化される。ACE2-GFP発現細胞株を用いて、QDおよびACE2の両方の転座を蛍光顕微鏡を用いて可視化することができる。一旦内部化されると、2つのQDおよびACE2シグナルは強い共局在化を示す。これらの画像から、画像セグメンテーションおよびその後の分析を実行して、スポットカウントなどの関連パラメータを抽出することができる(図1、 図2B)。 図1A は、対照として異なる濃度のQD−スパイクまたは培地のみで処理した細胞のモンタージュである。デジタル位相コントラスト、FITCおよび405nmでの励起と608nmでの発光を備えたカスタムQDチャネルを含む3つのチャネルが使用された。DPC は、一般的なセル形状のイメージを提供します。DPC画像は、細胞形態全体のおおよその指標を提供する。関心領域はDPC信号と重なり合い、内部化されたQDを検出するのに十分です。FITCチャネ.......

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ディスカッション

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この記事で説明する方法は、ハイスループット共焦点顕微鏡を使用してヒト細胞中の機能化QDをイメージングするために必要な手順を提供します。この方法は、SARS-CoV-2スパイクおよびhACE2エンドサイトーシスの研究を可能にするため、TMPRSS2の活性および膜融合ではなく、エンドサイトーシスがウイルス侵入の主な経路である細胞に最も適している。QDモデルの性質と市販のスパイク三量体上のC末端Hisタグのため、スパイクS1ドメインとS2ドメインのTMPRSS2切断は、QDをS2ドメインに結合したままにするだけです12。これは、RBD が S1 で見つかった場合、内部化を防ぐことができます。したがって、細胞表面での一連の事象が正確であった場合、hACE2が結合し、TMPRSS2がスパイクを切断する場合、インターナリゼーションのない負のシグナルが予想される。

このプロトコルは細胞プロセスのイメージングを扱うので、培養細胞はhACE2の発現を伴うウイルス感染に対して許容性でなければならない。hACE2は、細胞に一過性にトランスフェクトされ得るか.......

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開示事項

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著者らは、開示する利益相反はありません。

謝辞

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この研究は、NIHの国立トランスレーショナルサイエンス推進センターの学内研究プログラムによって部分的に支援されました。海軍研究所は、内部のナノサイエンス研究所 を通じて 資金を提供しました。試薬調製は、NRL COVID-19基本基金 を通じて 支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
32% パラホルムアルデヒド電子顕微鏡科学15714量子ドット処理後の細胞の固定に使用され、最終濃度 3.2%
Optimem I の QD の安定化に使用され、非特異的相互作用の防止、最終濃度 0.1%
7.5% ウシ血清アルブミンGibco15260-037カウントする蛍光細胞の細胞生存率色素として使用されます
Logos BiosystemsF23001細胞の播種とQD-Spikeのアッセイに使用されるマイクロウェルプレート
ブラッククリアボトム96ウェルコーティングプレートにポリD-リジンGreiner655946細胞培養、DMEMサプリメントのサポートに使用
特徴付けられたウシ胎児血清Cytiva/HyCloneSH30071.03クラウドベースのハイコンテント画像解析ソフトウェア。V2.9.1
コロンバスアナライザーパーキン・エルマーNA固定後の細胞核および細胞体の標識に使用、深赤色核色素
DRAQ5 (5 mM)サーモフィッシャーサイエンティフィック62252HEK293T細胞培養用基礎培地
ダルベッコのミニマルエッセンシャル培地、D-グルコース (4.5g/L)、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム (110 mg/L)、フェノールレッドGibco11995-065コロンバスからエクスポートした後のデータの整理に使用されます。V2110 Microsoft 365
ExcelMicrosoftNAhACE2-GFP陽性細胞の継続選択に使用、DMEMサプリメント
G418InvivoGenant-gn-5ヒト胚性腎臓細胞株は、GFP HEK293Tでタグ付けされたヒトアンジオテンシン変換酵素2を安定して発現
hACE2-GFPCodex BiosolutionsCB-97100-203自動セルカウンター
Luna自動セルカウンターLogos BiosystemsNA蛍光細胞計数に使用
Luna Cell Counting SlidesLogos BiosystemsL12001ハイコンテントイメージングプラットフォーム
Opera PhenixPerkin ElmerNA量子ドットで細胞をインキュベートするために使用されるイメージング培地
Opti-MEM I Reduced Serum MediumGibco11058-021カルシウムやマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水 継代中の細胞の洗浄とPBSのアッセイに使用されます
-/-Gibco10010-023細胞培養の細菌汚染を防ぐために使用され、DMEMサプリメント
ペニシリンストレプトマイシンGibco15140-122グラフ作成、データの視覚化、および統計分析に使用されます。V9.1.0
PrismGraphPadNASARS-Cov-2 Spike の hACE2 への結合のアッセイと Spike エンドサイトーシスのモニタリングに使用
Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)海軍研究所SARS-CoV-2 の阻害に使用 hACE2
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) へのスパイク結合 スパイク中和抗体、マウス MabSino Biological40592-MM57継代中にフラスコから細胞を解離するために使用
TrypLE ExpressGibco12605-010
アクリジンオレンジ/プロピジウムヨウ化物染色をコーティング 製カスタムメイド

参考文献

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  1. Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571(2011).
  2. Mehta, S., Zhang, J. Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors t....

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