方法論記事

B群 連鎖球菌 (GBS)によって引き起こされる絨毛膜羊膜炎の前臨床動物モデルの帝王切開

DOI：

10.3791/63221

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2021年12月29日

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1Department of Pediatrics, McGill University, 2Department of Pharmacology, McGill University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルの目標は、グループ B 連鎖球菌 (GBS) 誘発性絨毛羊膜炎の前臨床動物モデルを説明することです。この研究は、メカニズムプロセス、発達障害との潜在的な因果関係を調査し、最終的に翻訳抗炎症胎盤および神経保護治療を開発するように設計されています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B群 連鎖球菌 (GBS)は、ヒトの妊娠中に分離される最も一般的な細菌の1つです。これは、絨毛膜羊膜炎と呼ばれる胎盤感染/炎症の主な原因です。絨毛膜羊膜炎は、発育中の胎児を臓器損傷、周産期の罹患率、死亡率、生涯にわたる神経行動障害、その他の非神経学的発達問題の高いリスクにさらします。母体および胎児組織からのGBS分離株の最も頻繁な2つのサブタイプは、血清型Ia(13%-23%)およびIII(25%-53%)である。当研究室では、GBS誘発性絨毛膜羊膜炎のラットモデルを開発し、その特徴を明らかにして、発育中の胎児の中枢神経系に対するその後の影響を研究し、その根底にあるメカニズムの側面を理解しています。この記事では、ヒトにおけるGBS誘発性絨毛膜羊膜炎の特徴を厳密に再現する前臨床ラットモデルの設計と使用方法について説明します。この記事は、科学者が実験計画を再現するのを支援するとともに、トラブルシューティングの例を通じてサポートを提供することを目的としています。現在のモデルは、絨毛膜羊膜炎から生じる多くの発達障害で未解決のままである原因、メカニズム、および新しい治療法を明らかにすることにより、潜在的な発見にも貢献する可能性があります。さらに、このモデルの使用は、例えば、網膜、腸、肺、腎臓に影響を与える周産期の非神経学的一般的で重度の罹患率の研究に拡張することができます。本研究の主な関心事は、脳性麻痺(CP)、注意欠陥多動性障害(ADHD)、自閉症スペクトラム障害(ASD)など、GBS誘発性胎児神経発達障害の分野にあります。この記事では、このモデルを支持する理論的根拠を示し、その後に手順と結果を示します。

概要

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母体の免疫活性化(MIA)は、早産、胎児死亡、および子孫の生涯にわたる認知および行動障害の最も重要な独立した危険因子の1つとして説明されています1,2,3,4。胎盤および発達転帰に対する妊娠炎症の役割に関する既存の前臨床研究の多くは、大腸菌由来のリポ多糖(LPS)やウイルス二本鎖RNAの合成類似体であるポリイノシン:ポリシチジル酸(Poly[I:C])などの病原体成分を使用しています。しかし、B群連鎖球菌(GBS)が周産期感染の最も頻繁な原因であるにもかかわらず、その役割を扱った動物モデルはほとんどありません 炎症メカニズムと結果5。

GBSは、妊婦の約15%〜30%で下部生殖管にコロニーを形成するカプセル化されたグラム陽性球菌です6。胎盤感染症/炎症を引き起こし、絨毛膜羊膜炎と呼ばれます7,8。10のGBS血清型のうち、最も頻度の高い2つの血清型IaとIIIは、母体胎児組織9,10の損傷の主要な感染決定因子である。GBS感染は、胎児の血液および胎盤欠損症の炎症反応を高めることが示されており、これらは脳性麻痺(CP)、注意欠陥多動性障害(ADHD)、自閉症スペクトラム障害(ASD)などの複数の神経発達障害に関与している可能性が非常に高いです5,11。

過去10年間で、私たちはGBS誘発性絨毛膜羊膜炎のラットモデルを開発しました これは、子孫にさまざまな発達障害をもたらします12。この前臨床モデルは、GBS誘発性胎盤炎症と子孫の性特異的な神経発達障害の範囲との間の因果関係を示しています13,14,15。この記事の目標は、妊娠末期感染とその結果としての子孫の神経行動障害の前臨床ラットモデルの設計に関する洞察を読者に提供することです。現在のプロトコルは、GBS 誘発性絨毛膜羊膜炎の臨床的現実を模倣することを目的としています。

この前臨床モデルの結果は、GBS の妊娠末期腹腔内 (IP) 接種 (図 1) が (i) 胎盤感染と炎症を引き起こし、絨毛膜羊膜炎16 の診断基準を満たすことを示しています。(ii)胎盤内のIL-1βおよびIL-1-経路からの下流の炎症性分子の大規模なアップレギュレーション12;(iii)子孫の神経発達障害12;(iv)免疫応答の性差とその後の神経行動障害、例えば、女性の子孫が成人のADHDのような形質を示す一方で、男性の子孫は早期発症で長期にわたるASDのような形質を示す。(v) 絨毛膜羊膜炎を誘発するために使用される GBS 血清型に依存する子孫の異なる神経行動学的転帰14,15。これらの知見に沿って、このモデルを利用する主な次のステップは、まずGBS誘発性絨毛膜羊膜炎におけるアンドロゲンの役割、次に、特定の炎症経路を標的とする分子の胎盤および神経保護の役割をテストすることです。これらの分子の一部を治療臨床試験の閾値に引き上げることを期待しています。

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プロトコル

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すべての実験は、マギル大学ヘルスセンター研究所(RI-MUHC)によって承認されました。すべての実験は、カナダ動物管理協議会に従って行われました。

1.妊娠中のルイスラット

  1. 妊娠日(G)14に商用ソースからルイスラットを入手します。適切な動物施設(RI-MUHC動物施設)に収容し、20〜23°Cの制御された環境で、12時間の明暗サイクルを行い、水と食物を自由に利用できます17。
  2. G14(到着日)からG22(帝王切開の日)までの病気の行動を検出するために、毎日ダムの体重を量ります

2.細菌の増殖

  1. G18 で、5 mL の滅菌 Brain Heart Infusion (BHI) ブロスを含む 2 本の滅菌試験管を準備します。凍結細菌ストック(BHI中のβ溶血性被膜血清型Iaおよび15%グリセロール14)を-80°Cから少量取り出し、5 mLのBHIチューブに加えます(図2)。
  2. チューブをシェーカー(240 rpm)に37°Cで18時間置きます。
  3. G19では、インキュベート溶液1.5 mLを48.5 mLの滅菌BHIブロスに集めて、滅菌BHIブロスにGBSの3%溶液を調製します。
  4. 3% GBSとBHI溶液1.5 mLをキュベットに集めます。分光光度計を使用して、初期吸収をT0 (光学密度(OD)600 nm)として記録します。
    注:滅菌BHIブロスで作られたブランクを毎回使用して、分光光度計のバランスを取りました。
  5. 3%溶液をインキュベーターに37°Cで置き、240rpmで約2時間振とうします。2時間後に0.6〜0.8(OD600 nm)の吸光度に達するまで、20分ごとに吸収を確認してください。
  6. 目的の吸光度に達したら、3% GBSとBHI溶液を20 mLずつ採取し、50 mLチューブに加えます。
  7. サンプルを4°Cで13分間遠心分離(1792 x g)し、沈殿したGBSを20 mLの0.9%滅菌生理食塩水で2回洗浄します。
  8. 沈殿したGBSを2mLの0.9%滅菌生理食塩水に懸濁します。.このアリコートは注射時まで氷の上に置いてください。.
  9. 対照群には 100 μL の滅菌 0.9% 生理食塩水を注入し、GBS 群には 100 μL の β溶血性血清型 Ia GBS を滅菌 0.9% 生理食塩水に懸濁して (腹腔内) 注射します。
    注:注射された用量は、GBSまたは生理食塩水(コントロール用)の108 コロニー形成単位(CFU)でした。108 CFUの接種は、ヒト絨毛膜羊膜炎のモデルとして十分に確立されています。高用量のGBSを接種すると、ダムの死亡率が発生する可能性があります。言及された用量よりも少ない用量を注射しても、感染や炎症は模倣されません。
  10. 10-5から10-10の間で希釈し、BHI寒天プレートに希釈液を三重にプレートします。汚染を除外するには、BHI寒天プレートとCHROMID Strepto B寒天プレートの2つのネガティブコントロール(物質を添加せずに)を行います。調製した細菌をBHI寒天プレートとCHROMID Strepto B寒天プレートに播種することにより、2つのポジティブコントロールを作成します。すべてのプレートをインキュベーターに37°Cで一晩置きます(図3)。
    注:CHROMID Strepto B寒天培地は、GBSコロニーが赤色に見えるGBSをスクリーニングするための選択的培地です。

3.インジェクション技術

  1. G19で、ラットをケージからそっと取り出し、平らな面に置きます。タオルを使用して頭と上半身を覆い、ラットを固定します。後ろ足を持ち上げて、注射部位に簡単にアクセスできるようにします。
    注:膀胱や盲腸などの臓器の穿刺を避けるために、注射の適切な解剖学的領域が腹部の右下象限にあることを確認してください(図1)。
  2. 29 G 1/2インチの針が付いたU-100インスリン注射器を使用します。 図1に示すように、針の斜角を頭に向けて上を向いて、水平に対して40〜45°の角度で挿入します。GBSインジェクションは、各ダムに1回ずつ行います。接種したダム間の時間的影響を避けるために、必ず1時間ごとに注射を行うようにしてください。
    注:注射は、1日に1回以上行われる日には、左側と右側で変化させる必要があります。

4. 用量決定

  1. G20 で、4 つのコントロール(ステップ 10.2)を確認し、各 BHI 寒天プレート上の細菌コロニーをカウントします。
  2. 各希釈係数(10-5 〜10-10)の平均GBSコロニーを計算して、GBSの正確な注入用量を決定します

5.帝王切開と組織採取

  1. G22 で帝王切開 (注射後 72 時間) を行い、その後、各ダムの接種時間に応じて 1 時間間隔で手術を行います。
  2. 全身麻酔のために、2%イソフルランと1.5%O2の安楽死チャンバーでダムを麻酔します。
  3. 適切な外科用包帯で覆われた加熱パッドにダムを置き、乾燥を避けるために眼科用軟膏を目に塗ります。.
  4. 下腹部の毛を刃物やメスで取り除き、手術部位を準備します。
  5. 消毒剤を染み込ませた滅菌ガーゼで手術部位を清掃します。
  6. 滅菌メスと先端の細いハサミを使用して、ラットの下腹部に水平切開を行います。腹部の両側に垂直に切開して、下にある臓器を明らかにします。
  7. 胎盤サンプルを胎児から分離します。胎児、胎盤、および胎児/胎盤の比率の体重を記録します。
  8. 滅菌メスを使用して、胎盤を半分に切ります。
    1. 2-メチルブタンを使用して胎盤の半分を急速凍結し、ELISAを使用したタンパク質レベルの測定に必要なまで-80°Cに保ちます。
    2. 胎盤の残りの半分を4%緩衝ホルムアルデヒドで固定し、免疫組織化学(IHC)による in situ 分析を行い、採取した胎盤におけるGBSおよび多形核細胞(PMN)の発現を研究します。
  9. 斬首して生きている胎児から血液を採取し、その血液をリチウムヘパリンゲルセパレーターチューブに移します。
  10. 血液サンプル(18,928 x g)を4°Cで遠心分離して血漿を分離し、血漿サンプルを-80°Cで保存して、さらなる分析を行います。
    注: 収集された胎児の血漿サンプルは、ELISA を使用して、胎児の血液中のさまざまなサイトカインのタンパク質レベルを確認します。
  11. 胎児の尾を収集して、SRY遺伝子内の配列を増幅することにより、胎児の性別を決定するために、前述の18と同様に、次のプライマー(フォワードプライマー:5'-TAC AGC CTG AGG ACA TAT TA3';リバースプライマー:5'-GCA CTT TAA CCC TTC GAT GA -3')を使用します18。
  12. 5mLの23G針を使用して、心臓穿刺によってダムから血液を採取し、ダムの血液中のさまざまなサイトカインのタンパク質レベルを胎児の血液と比較します。ダイヤフラム穿刺と斬首法によりダムを安楽死させます。
    注:動物間では、使用済みのすべての器具を滅菌ティッシュと滅菌生理食塩水で洗浄します。子孫の神経病理学的および行動学的研究を行うために、母はG23で自然に出産しました。出生後日(PN)80に子孫を安楽死させた後、分子学的および組織学的研究のために脳を採取した。

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結果

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GBSのIP接種は胎盤感染をもたらしました
免疫組織化学(IHC)(GBS血清型Iaを標的とするポリクローナル抗体を使用)染色により、GBS感染が胎盤の脱落膜コンパートメントに到達したことが示されました。感染はまた、落葉膜から迷路、絨毛膜板、場合によっては胎児に広がり、胎児の死亡につながります(GBSに曝露された5.8±0.8対制御(CTL)の子犬は9.3±0.6の子犬)18。したがって、GBSに曝露された胎児の出生時の同腹児数は、曝露されていない胎児と比較して減少しました18。胎盤感染に関して同腹仔内の不整合が観察されました。GBS感染は、新生児だけでなくすべての母母で自己限定的であったが、一部の母母はGBS菌血症/敗血症15を示した。このようなGBS感染の播種を発症した人々は、より高い炎症誘発性サイトカイン反応も発症しました13。P114の子犬では陽性のGB...

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ディスカッション

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プロトコルの重要なステップ
プロトコルのいくつかのステップは重要であり、いくつかの品質管理が必要です。例えば、GBSストックが他の病原体によって汚染されるリスクがあります。これは、BHI寒天培地上のコロニーアスペクト(サイズ、形状、色など)、コロンビア血液寒天培地にβ溶血性GBS用量を5%ヒツジ血液培地で二重にめっきし、GBSのスクリーニングのための選択的発色培地であるCHROMIDストレプトB寒天培地に播種するなど、GBS微生物同定の適切な技術を使用して迅速に同定できます。

もう一つの問題は、一部のダムがGBSの無症候性キャリアであることです。したがって、理論的には、GBSを接種していない制御ダムで偶発的な感染が発生する可能性があります。しかし、私たちの手では、対照動物の胎盤におけるGBS染色では、GBS誘発性絨毛膜羊膜炎は検出されませんでした。もしこのあり得ない事象が起こったとしても、私たちが提案する実験計画に大きな影響を与えることはありません。このため、病原体のない動物...

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開示事項

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著者には金銭的な利益相反はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、マギル大学ヘルスセンター研究所(RI-MUHC)、カナダ衛生研究所(CIHR)の支援を受けました。この研究は、Canadian Institute of Health Research(CIHR)、Foundation of Stars、Fonds de Recherche Québec-Sciences(FRQS)、McGill大学、Sherbrooke大学の資金提供機関、機関、財団によって可能になりました。GBSの寛大な贈り物について、フランスのドニ・ディドロ大学(パリ第7大学)のクレア・ポヤール博士とカナダのモントリオール大学のマリエラ・セグラ博士に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
5 mL滅菌チューブBD Biosciences
50 ml ファルコンチューブサーモフィッシャー339652
ブレードまたはメスBD メディカル371716
ブレイン 心臓注入ブロスクライテイン (ハーディ診断)C5141
CHROMID ストレプト B 寒天プレートBioMerieux, Saint-Laurent43461
コロンビア血液寒天 5% 羊の血液培地Thermo ScientificR01215
フォワードプライマー5' - TAC AGC CTG AGG ACA TAT TA3'Sigma
インスリン注射器ベクトン、ディキンソン、Co(BD)324702
ルイスラットチャールズリバーラボラトリーズ
メチルブタンシグマ アルドリッチM32631
マイクロテーナー採血管ベクトン、ディキンソン、Co(BD)365965
リバースプライマー5' - GCA CTT TAA CCC TTC GAT GA -3'Sigma
血清ピペット 1 MLサーモフィッシャー170353N
血清ピペット 10 MLサーモフィッシャー170356N
血清ピペット 25 MLサーモフィッシャー170357N
セロジカルピペット 5 MLサーモフィッシャー170355N
スーパーフロスト プラス マイクロスライド、プレミアムVWRCA48311-703

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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