紙ベースのトーホールドスイッチ診断の開発と患者検証のための設計から実装までの研究

RT-qPCRは、その優れた感度と特異性により、臨床診断のゴールドスタンダード技術であり続けています。この方法は非常に堅牢ですが、温度制御された流通と保管を必要とする高価で特殊な機器と試薬に依存します。これは、特に病気の発生時や設備の整ったラボへのアクセスが制限されている地域では、世界的に質の高い診断へのアクセスに大きな障壁をもたらします^1,2。これは、ブラジルでの2015/2016年のジカウイルスの発生時に観察されました。RT-qPCR検査を提供できる集中検査室は5つしかないため、重大なボトルネックが発生し、診断へのアクセスが制限されていました。これは、発生によってより深刻な影響を受けた都市周辺の環境の個人にとって特に困難でした^3,4。診断へのアクセスを改善するために、このプロトコルは、低リソース設定で分散型、低コスト、大容量の診断を提供する可能性のあるプラットフォームを示しています。この一環として、等温増幅および合成RNAスイッチベースのセンサーを紙ベースの無細胞発現システムと結合する診断発見パイプラインが確立され^ました5,6。

無細胞タンパク質合成(CFPS)システム、特に大腸菌ベースの無細胞システムは、環境モニタリング^7,8から^{病原体診断5,6,9,10,11,12}まで、幅広いバイオセンシングアプリケーションにとって魅力的なプラットフォームです。.転写と翻訳に必要なコンポーネントで構成されるCFPSシステムは、全細胞バイオセンサーに比べて大きな利点があります。具体的には、センシングは細胞壁によって制限されず、一般に、それらはモジュール設計であり、バイオセーフで、安価であり、携帯用に凍結乾燥することができる。遺伝子回路ベースの反応を紙や繊維などの基質上で凍結乾燥する能力は、輸送、室温での長期保存⁵、さらにはウェアラブル技術への組み込みを可能にします¹³。

これまでの研究では、大腸菌無細胞システムを使用して、水銀などの有毒金属、テトラサイクリン7,14などの抗生物質、内分泌かく乱化学物質^15,16、馬尿酸17などのバイオマーカー、病原体関連クォーラムセンシング分子^9,18、コカイン¹⁷、ガンマヒドロキシ酪酸(GHB)^{19などの違法物質など、多数の分析物を検出できることが実証されています。}.核酸の配列特異的検出のための戦略は、ほとんどの場合、等温増幅技術に結合されたスイッチベースのバイオセンサーの使用に依存してきました。Toeholdスイッチは、リボソーム結合部位(RBS)と開始コドンを隔離することによって下流の翻訳をブロックするヘアピン構造を含む合成リボレギュレーター(テキストの残りの部分では単に「スイッチ」とも呼ばれます)です。それらの標的トリガーRNAと相互作用すると、ヘアピン構造が緩和され、レポーターオープンリーディングフレームの後続の翻訳が可能になる²⁰。

等温増幅は、分子診断としても使用できます²¹;ただし、これらの方法は非特異的増幅を起こしやすく、特異性を低下させ、それによって検査の精度をRT-qPCR ²²の精度以下に低下させる可能性があります。ここで報告された研究では、スイッチベースのセンサーの上流の等温増幅を使用して、核酸(フェムトモラーからアトモラー)の臨床的に関連する検出を可能にする複合信号増幅を提供しました。この2つの方法の組み合わせは、組み合わせて高レベルの特異性を提供する2つの配列特異的チェックポイントも提供します。このアプローチを使用して、以前の研究では、ジカ⁶、エボラ⁵、ノロウイルス¹⁰などのウイルス、および C.ディフィシル²³ や抗生物質耐性腸チフス¹²などの病原性細菌の検出が実証されています。最近では、COVID-19パンデミックにアクセス可能な診断を提供するために、SARS-CoV-2検出用のセルフリートーホールドスイッチが実証されています^11、12、13。

以下のプロトコルは、 インシリコ バイオセンサーの設計から組み立てと最適化のステップ、患者サンプルによるフィールドバリデーションまで、ジカウイルス検出のための無細胞紙ベースの合成トーホールドスイッチアッセイの開発と検証の概要を示しています。このプロトコルは、RNAトーホールドスイッチベースのセンサーとジカウイルスRNAに特異的な等温増幅プライマーの インシリコ 設計から始まります。多数の等温増幅法が存在するが、ここでは核酸配列ベースの増幅(NASBA)を使用して反応中に存在するウイルスRNA標的の濃度を増加させ、臨床的に有意な感度を可能にすることが実証された。実際には、等温増幅法は一定の温度で動作するという利点があり、一般的に集中的な場所に限定されているサーマルサイクラーなどの特殊な機器が不要になります。

次に、オーバーラップ伸長PCRを介してレポーターコード配列を備えた合成トーホールドスイッチセンサーを組み立て、合成RNAを使用して無細胞系で最適な性能が得られるように合成トーホールドスイッチセンサーをスクリーニングするプロセスについて説明します。このジカウイルスセンサーのセットでは、比色基質であるクロロフェノールレッド-β-D-ガラクトピラノシド(CPRG)を切断できるβ-ガラクトシダーゼ酵素をコードする lacZ 遺伝子を選択して、目またはプレートリーダーで検出できる黄色から紫色の色の変化を生成します。最高性能の合成スイッチが同定されたら、合成RNAを使用して対応する標的配列の核酸配列ベースの等温増幅のためのプライマーをスクリーニングし、最良の感度を提供するセットを見つけるためのプロセスが説明される。

最後に、診断プラットフォームの性能はラテンアメリカの現場で検証されます(図1)。臨床診断の精度を判断するために、患者からのジカウイルスサンプルを使用して紙ベースの無細胞アッセイが実行されます。並行して、比較のためにゴールドスタンダードのRT-qPCRアッセイが実行されます。比色無細胞アッセイをモニタリングするために、サーマルサイクラーが利用できない領域での結果のオンサイト定量を可能にします。ポータブル、低コスト、ユーザーフレンドリー、マルチモーダルと呼ばれる手作業で組み立てられたプレートリーダー(PLUM、以下、ポータブルプレートリーダーと呼びます)もここで紹介されています²⁴。当初は無細胞合成トーホールドスイッチ診断のコンパニオンデバイスとして開発されたポータブルプレートリーダーは、ハイスループットな方法で結果をインキュベートして読み取るためのアクセス可能な方法を提供し、統合されたコンピュータービジョンベースのソフトウェア分析をユーザーに提供します。

図1:紙ベースの無細胞トーホールドスイッチ反応を使用して患者サンプルをテストするためのワークフロー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

人間の参加者が関与するすべての手順は、ヘルシンキの世界医師会宣言によって確立されたヒトを対象とする医学研究の倫理原則を含む、倫理基準および関連するガイドラインに従って実施されます。この研究は、ライセンスプロトコル番号CAAE:80247417.4.0000.5190の下で人間の研究倫理委員会によって承認されました。この研究に含まれるすべての患者のインフォームドコンセントは、診断サンプルについてFiocruz-PE施設内審査委員会(IRB)によって放棄されました。

注意: PLUMデバイスは、以下、「ポータブルプレートリーダー」と呼びます。

1. 核酸配列に基づく増幅プライマーの計算設計

1. ジカゲノムをスキャンして、ゲノム配列をNCBI /ヌクレオチド^BLASTに入れることにより、長さが約200ヌクレオチド(nt)から300ntである増幅候補領域のセットを特定します^25,26。ゲノムをリファレンスRNA配列(refseq_rna)と比較し、高度に保存されたままでヒトゲノムと相同性を持たない部位を検索します(他のBLASTパラメーターは変更されません)。少なくとも2つのサイトを選択して、合成トーホールドスイッチを設計します。
2. Deiman et ^al.27 の選択基準を使用して、各候補増幅領域について、順方向および逆方向の核酸配列ベースの増幅プライマーのペアを生成します。簡単に言うと、プライマーを設計するためのこれらの基準に従ってください:(1)40%〜60%の間のGC含有量。(2)長さ20〜24 ntで、DNA融解温度が41°Cを超える。(3)4つ以上の同一ヌクレオチドのランなし;(4)最後の3'ヌクレオチドがA塩基であり;(5)プライマー二次構造および二量体形成確率が低い。各標的領域について8〜10個のプライマーペアをスクリーニングします(推奨)。
3. T7プロモーター配列を含む接頭辞配列AATTCTAATACGACTCACTATAGGG AGAAGGG(下線付きのT7プロモーター配列)をフォワードプライマーの5'末端に付加し、T7 RNAポリメラーゼ(RNAP)を使用したアンプリコンの転写を可能にします。プライマーをDNAオリゴとしてDNA合成会社に注文してください。

2. トーホールドスイッチの計算設計

1. ウェブサイト²⁹の指示に従って、NUPACK²⁸バージョン3.2(核酸設計スイート)をインストールします。プログラミング言語として UNIX オペレーティング システムと MATLAB (数値コンピューティング プラットフォーム) を使用します (推奨)。
2. ステップ1.1のように、トーホールドスイッチ設計の対象となる病原体に特異的な標的配列(ウイルスゲノムなど)を特定します。ステップ1.2で生成した核酸配列ベースのアンプリコンからZikaターゲット配列を選択します。
   注:実際には、ユーザーのニーズに応じて、核酸配列ベースの増幅プライマーまたは合成トーホールドスイッチのいずれかを最初に設計およびテストできます。関心のある特定の標的領域がすでに確立されている場合(例えば、既存の出版物または診断プロトコルから)、トーホールドスイッチの設計およびスクリーニングが最初に行われ、次に核酸配列ベースの増幅プライマーの設計およびスクリーニングが行われ得る。確立された標的領域がない場合は、まず核酸配列ベースの増幅プライマーを全ゲノムに対してスクリーニングし、プライマー増幅効率のために選択しながら、選択する標的を絞り込みます。病原体の複数の配列が利用可能な場合は、(ゲノム全体をスクリーニングするのではなく)高度に保存された領域に焦点を当てた核酸配列ベースの増幅プライマーを設計するのが最善です。
3. 必要なMATLABソフトウェアをコンピューターにダウンロードしてインストールします。
4. 環境変数を設定して、核酸設計スイート機能をソフトウェアで呼び出せるようにします。これを行うには、ソフトウェアを開き、既定の作業フォルダーにある startup.m ファイルを開く (または作成する) します。次に、次のコード行を startup.m ファイルにコピーし、最後に核酸設計スイートのバイナリを含むフォルダーを PATH に追加します。
   NUPACKINSTALL = '/Users/[user_name]/.../nupack3.2.2';
   setenv('NUPACKINSTALL',NUPACKINSTALL);
   setenv('PATH',[getenv('PATH'),sprintf(':%s/build/bin',NUPACKINSTALL)]);
5. 数値計算プラットフォームソフトウェアを開き、設計ソフトウェアフォルダに移動します。https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN でアクセス可能な設計アルゴリズムを実行します。
6. 入力サブフォルダーにあるdesign_input_file.csvにターゲットシーケンスを入力します。入力には、 表 1 で定義されている名前、外部シーケンス、内部シーケンス、温度、出力名、および出力シーケンスが含まれます。ターゲットのプライミングサイトがまだ決定されていない場合は、内部シーケンスと外部シーケンスを同じに保ちます。レポーターの最初の29 ntのみが設計プロセス中に考慮されます。完了したら、更新したスプレッドシートを保存して閉じます。
   注:出力配列は、アッセイに使用する予定のレポータータンパク質( lacZなど)の配列です。内側と外側のシーケンスを指定すると、アルゴリズムはどちらのプライマーとも重複する合成トーホールドスイッチを生成しなくなります。また、アッセイがジカゲノムの3つのユニークな部位を認識し、その特異性を向上させることを保証します。
7. 設計関数に使用するパラメータを選択します:toehold_switch_design_run(num_designs,input_file、オプション)。パラメーター値を次のように入力します。
   1. num_designs - ソフトウェアによって出力された各ターゲットの上位計画の数。デフォルトは 6 で、必要に応じて変更できます (ターゲットごとに最低 6 つのデザインを推奨)。
   2. input_file - このパラメーターは、入力シーケンス情報を提供するファイルの名前を指定します。デフォルト値は「design_input_file.csv」で、必要に応じて変更できます。
   3. 次のオプションから選択します-(1)シリーズAとシリーズB:コードが生成するtoeholdスイッチのバージョン。シリーズBを1に、シリーズAを0に設定して、ジカウイルス診断⁶で使用される形式であるシリーズBのトーホールドスイッチを生成します。(2)並列:複数のコアを利用してデザインを計算するには、1に設定します。それ以外の場合は、0 に設定します。(3)アンチセンス:ターゲット入力のアンチセンス配列(すなわち、逆補体)をハイブリダイズするトーホールドスイッチを生成するために1に設定され、それ以外の場合は、0 に設定します。
8. 選択したパラメータ toehold_switch_design_run(num_designs,input_file,オプション) を使用して設計関数を実行します。その後、アルゴリズムは、対象のターゲットのトーホールドスイッチ設計の生成を開始します。
9. デザインが完了したら、トップトーホールドスイッチのデザインシーケンスと対応するターゲットシーケンスを.csv形式のスプレッドシートの形式でfinal_designsフォルダーに配置します。アルゴリズムによって生成されたトーホールドスイッチDNA配列は、5'末端にT7プロモーター配列を含み、3'末端に保存された21ntリンカー配列AACCTGGCGGCAGCGCAAAAGを含む。
10. 得られたトップトーホールドスイッチの設計配列をNCBI-BLASTに装着し、配列の相同性をチェックすることで、他の一般的なウイルスと照合します。40%以下の相同性を有する配列を受け入れる。
11. トーホールドスイッチのヘアピン配列をDNAオリゴとして注文し、後でレポーター遺伝子と一緒に完全に機能するスイッチに組み立てます。選択したレポータータンパク質に応じて、後続のセンサーアセンブリに必要なPCRプライマーを注文してください。

表1:トーホールドスイッチ設計ソフトウェアで使用される各パラメータの定義。

3. PCRによるトーホールドスイッチの構築

注:これらのステップでは、オーバーラップ伸長PCRによるLacZトーホールドスイッチの構築について説明します。ここでは、DNAオリゴをフォワードプライマーとして使用し、T7ターミネーターをリバースプライマーとして使用します。 lacZ 遺伝子のテンプレートとしてpCOLADuet-LacZプラスミドを使用します(addgene:75006)。対応する配列を含む他のDNAテンプレートは、T7ターミネーターが最終構築物に含まれている限り、テンプレートとして使用できます。

1. 合成DNAオリゴを市販のプロバイダーから受け取ったら、合成DNAと逆増幅プライマーの溶液をヌクレアーゼフリー水中で10 μMの濃度で調製します。 表2に従って、氷上のPCRチューブで反応を組み立てます。
   注: PCR ボリュームは必要に応じてスケーリングできます。最小限の量(0.1-1 ng)のpCOLADuet-LacZ DNAテンプレートを使用して、追加のプラスミド除去ステップまたはバックグラウンドLacZシグナルの必要性を回避します。DNAテンプレートの量が多い場合は、DpnI制限酵素消化物を使用したPCRに従って、残留プラスミドテンプレートを除去します。
2. 表3にリストされているサイクル条件に従って、サーマルサイクラーに反応を置きます。アガロースゲル上のPCR産物を分析します(図2;補足プロトコルおよび³⁰を参照)。
3. スピンカラムベースのPCR精製キットを使用してPCR産物を精製し、製造元の指示に従って15〜30 μLのヌクレアーゼフリー水でDNAを溶出します。分光光度計を使用してDNAを定量します。

表2:トーホールドスイッチの構築に使用されるPCRコンポーネント。

表3:PCRによるトーホールドスイッチの構築中に使用したサイクリング条件。

4. 合成RNAターゲットの作製(トリガー)

1. 分子生物学設計ソフトウェアを使用して、合成トリガーRNAテンプレート(ステップ1.1で選択)を上流のT7プロモーター配列を含むように改変し、完全なテンプレートが短い(<200 bp)ままになるようにします。トリガー配列プライマーを増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーを設計します(オリゴ配列については 補足プロトコルを参照してください)。
2. 配列をDNAオリゴとして注文します。受け取ったら、合成トリガーDNAと増幅プライマーをヌクレアーゼフリー水中で10 μMに再構成します。 表2 に従って、対応するPCRを氷上の薄肉チューブに組み立て、0.5 μLのトリガーDNAウルトラマー(最終濃度0.1 μM)をテンプレートDNAとして使用します。
3. 反応物をサーマルサイクラーに入れ、 表3にリストされているサイクリング条件を使用します。15秒の延長時間を使用してください。品質を評価し、ステップ3.3および 補足プロトコルで説明されているようにトリガーPCR産物を精製します。
   注:プロセスを迅速化するために、カラム精製されたトリガーPCR産物を最初のトーホールドスイッチスクリーニングに直接使用することもできます。

5.選択したトリガー配列の in vitro 転写

1. 表4に従って反応成分を氷上で組み立てる。
2. インビトロ 転写(IVT)反応を37°Cで4時間インキュベートし、続いてDNase I処理を行って鋳型DNAを除去します。DNase Iステップでは、ヌクレアーゼフリー水70 μL、10 μLの10x DNase Iバッファー、および2 μLのDNase I(RNaseフリー)を加え、37°Cで15分間インキュベートします。すぐにステップ5.4に進まない場合は、50 mM EDTAを添加してDNase Iを不活化し、65°Cで10分間熱失活します。
3. オプションのステップ:IVT製品で変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(尿素-PAGEなど)分析を実行して、 補足プロトコルに記載されているようにRNA品質を評価します。
4. 製造元の指示に従ってカラムベースのRNAクリーンアップキットを使用してトリガーIVT製品を精製し、分光光度法を使用してRNA濃度と純度を定量します。RNAのモル濃度とコピー数/μLを決定する方法については、 補足プロトコル を参照してください。

表4:選択されたトリガー配列の インビトロ 転写(IVT)。

6. スイッチの初回審査

注意: このセクションでは、セルフリーの紙ベースのトーホールドスイッチ反応のセットアップに関連する手順と、高性能のトーホールドスイッチをスクリーニングする方法について説明します。ステップ6.10で使用されるBSAブロックろ紙は、 補足プロトコルに記載されているように事前に準備する必要があります。

1. 25 mgの粉末を1 mLのヌクレアーゼフリー水に溶解してCPRGストック溶液を調製します。溶液は常に氷上に保ち、長期間使用するために-20°Cで保管してください。
2. 設定する反応の数を決定します。評価する各トーホールドスイッチについて、マスターミックスから生じる可能性のあるバックグラウンドシグナルを説明するために、テンプレートなしコントロール(スイッチなし、ターゲットRNAなし、別名セルフリーアローンコントロール)を含めます。ターゲットRNAがない場合のバックグラウンドスイッチリーク性またはオフ率を評価するためのスイッチのみのコントロールを含めます。
3. 表5に記載されている標準プロトコルに従って、溶液A、溶液B、RNase阻害剤、およびCPRGの無細胞反応マスターミックスを氷上で組み立てます。
   注:ここで説明する手順は、ピペッティングエラーを考慮して10%の容量を加えた1.8 μLの反応のトリプリケートセットに十分なマスターミックス用です。マスターミックスの音量は、スクリーニングするトーホールドスイッチの数に応じて、必要に応じて調整する必要があります。
4. 3回の無細胞反応ごとに、マスターミックスをPCRチューブに分注し、すべてのチューブを氷上に保ちます。無細胞単独コントロールとして取っておいたチューブの場合は、ヌクレアーゼフリー水を最終容量5.84 μLまで加え、上下にピペッティングして混合し、短時間遠心分離します。残りのチューブには、PCR精製したトーホールドスイッチDNAを最終濃度33 nMまで加えます。
5. スイッチ単独コントロールとして取っておいたチューブの場合は、ヌクレアーゼフリーの水を加えて最終容量5.84 μLにします。トーホールドスイッチとターゲットRNAの組み合わせをテストするために取っておいたチューブの場合は、 in vitro で転写されたターゲットRNAを最終濃度1 μMまで追加します。次に、ヌクレアーゼフリーの水を最終容量5.84 μLまで加えます。 上下にピペッティングしてすべての反応を完全に混合し、短時間遠心分離します。
6. 384ウェルの黒色で透明な底板上の反応ウェルを囲むウェルに30 μLのヌクレアーゼフリー水を追加します。これにより、実験中の蒸発が最小限に抑えられ、再現性が向上します。
   注意: ポータブルプレートリーダーデバイスを使用する場合は、プレートの上にPCRフォイルを置き、精密ナイフを使用して、反応を目的としたウェルと4つのコーナーウェルのそれぞれを切り取ります。PCRフォイルは、ポータブルプレートリーダーカメラの空のウェルからの露出オーバーを防ぎます。
7. 2 mmの生検パンチとピンセットを使用して、BSAブロックろ紙ディスクを切断し、パンチを排出するかピンセットを使用して反応ウェルに配置します(BSAブロックろ紙の調製に関する 補足プロトコル を参照)。各反応チューブから384ウェルプレートのろ紙ディスクに1.8 μL容量を3回分注し、すべてのサンプルと384ウェルプレートを常に氷上に保ちます。
   注:ポータブルプレートリーダーデバイスを使用する場合は、384ウェルプレートの四隅のそれぞれに1.8 μLのCPRG(0.6 mg / mL)を追加します。CPRGの黄色は、画像分析におけるデジタルマルチウェルプレートテンプレートの位置合わせのために、ポータブルプレートリーダーにパターン認識を提供します。蒸発を防ぐために、プレートのウェルをPCRフィルムで覆います。
8. プレートをプレートリーダーに入れ、OD 570を₃₇ °Cで毎分130分間読み取ります。

表5:PURExpress無細胞転写翻訳反応成分。

7. 高性能トーホールドスイッチの特定

メモ: このセクションでは、手順6のデータを分析して、先に進むのに最適なパフォーマンスのトーホールドスイッチを選択する方法について説明します。

1. まずバックグラウンドOD₅₇₀の吸光度に正規化してデータ解析を開始します。これを行うには、スイッチまたはターゲットRNAを持たない反応(すなわち、無細胞単独ウェル)のOD 570測定値を他のOD₅₇₀測定値から差し引きます。
2. 3点移動平均を使用して正規化データを平滑化し、各ウェルの最小値をゼロに調整します。トーホールドスイッチ27B、33B、および47Bについて収集された正規化された時間経過データの例については、 図3 を参照してください。
3. この処理されたデータを使用して、トーホールドスイッチとターゲットおよびスイッチ単独ウェルとの間の色変化率(すなわち、経時的なOD₅₇₀ の変化)の差を決定することにより、フォールド変化(またはON/OFF比)を計算する(比率の計算については 補足プロトコル を参照)。 図4)。
4. さらなる特性評価のために、ON/OFFフォールドの変化が最も高いスイッチを選択します。フォールドの変化が最も小さいパフォーマンスの低いトーホールドスイッチを省略します。

8. 核酸配列ベースの増幅プライマースクリーニングと感度

注:次のステップでは、最初に機能的等温増幅プライマーのスクリーニングを行い、次に、所定のトーホールドスイッチが等温増幅と結合したときに確実に検出できる合成RNAのμLあたりの標的RNAコピー数を決定することによって、その感度を評価します。等温増幅に続いて、無細胞反応を実行して、成功した核酸配列ベースの増幅プライマーセットを特定します。ただし、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲルを核酸配列ベースの増幅反応で実行して、最初に候補プライマーセットのプールを絞り込む方が費用効果が高い場合があります。その場合、適切なアンプリコンサイズでゲル上にバンドを生成する核酸配列ベースの増幅プライマーセットを、その後の無細胞スクリーニングのために候補リストに載せることができる。

1. すべてのフォワードプライマーセットとリバースプライマーセットの25 μMストック溶液をヌクレアーゼフリーの水で作成します( 補足プロトコルを参照)。セットアップが必要な核酸配列ベースの増幅反応とその後の無細胞反応の数を決定します。これは、トーホールドスイッチの数とそれぞれのプライマーセットによって異なります。
   注:プライマーをスクリーニングする場合、プライマー関連の非特異的増幅によって発生する可能性のあるバックグラウンドアーティファクトを考慮するために、各プライマーセットにテンプレートなしコントロールを常に含めることが重要です。
2. 以下のように5 μLの反応を1つセットアップします(必要に応じてこれをスケーリングします)。すべての試薬を氷上で解凍します。 表6に従って、反応バッファー、ヌクレオチドミックス、およびRNase阻害剤の反応マスターミックスを組み立てます。白色沈殿物が可溶になるまで上下にピペッティングして十分に混合し、PCRチューブにアリコートを分注します。
   1. マスターミックスが核酸配列ベースの増幅プライマーをスクリーニングするためのものである場合は、最初にマスターミックスからプライマーを除外します(マスターミックスを2.55 μL分注します)。それ以外の場合、プライマー感度分析を行う場合、プライマーをマスターミックスに含めることができます(この場合、2.75 μLのアリコートを分注します)。変性および平衡化段階の後に酵素混合物を加える。
3. 核酸配列ベースの増幅プライマーをスクリーニングする場合は、フォワードプライマーとリバースプライマーを適切なチューブに追加します。サーマルサイクラーで、 表7の説明に従ってインキュベーションプロトコルを設定します。
4. ヌクレアーゼフリー水1 μLまたはターゲットトリガーRNA1 μLを2 pMまたは約10⁶ コピー/μLで添加し、それに応じてチューブに標識してください。穏やかなピペッティングで混合し、チューブを短時間回転させます。
   注:プライマーセットスクリーニングでは、等温増幅法の検出下限に影響を与えないほど十分に高いが、増幅が発生しない場合にトーホールドスイッチを活性化するのに十分な濃度ではないターゲットトリガーRNAの濃度を使用してください。
5. チューブをサーマルサイクラーに移動し、インキュベーションを開始します。12分後、チューブを取り外し、各チューブに1.25 μLの酵素ミックスを加えます。上下にピペッティングして混合し、チューブを短時間遠心分離します。
   注意: この時点で、チューブは室温に保つことができます。ただし、酵素混合物は、チューブに加えるまで氷上に保管する必要があります。
6. チューブをサーマルサイクラーに戻し、41°C保持ステップをスキップして1時間の反応インキュベーションを開始します。
   注:インキュベーション後、反応物を氷上に置いて同日処理するか、-20°Cで凍結して後で処理することができます。
7. 手順6.2〜6.7および 表8 に従って、紙ベースのセルフリートーホールドスイッチ反応を組み立て、プライマーの性能を評価します。手順 7.1 から 7.2 および 図 3 の説明に従ってデータを分析します。
   注意: 前述のコントロールに加えて、反応から生じる可能性のあるバックグラウンドシグナルを説明するために、ネガティブコントロールも含めることが重要です。さらに、NASBAなしの増幅コントロールとして、スイッチと2 pM(最終濃度)のターゲットRNAを備えたコントロールも含めることが重要です。
8. 感度解析を進めるための候補プライマーペアを特定します。プライマー対は、インキュベートされた反応の添加後にトーホールドスイッチ活性化が起こるかどうかに基づいて選択される。必要に応じて、より多くのプライマーの組み合わせでプライマースクリーニングを繰り返します。
9. RNAサンプルを常に氷上に保ち、ヌクレアーゼフリー水中でターゲットRNAの連続希釈セットを作成します:10⁴、10³、10²、10¹、および10^{0 RNA} コピー/μL。 選択したプライマーセットを使用して核酸配列ベースの増幅と無細胞反応を繰り返し(ステップ8.2〜8.7)、連続希釈シリーズをテストして、最高の感度を提供するプライマーセットを特定します。プライマーセット感度を決定するための結果の例については 図5 を参照されたい。
   注:理想的には、選択したトーホールドスイッチとプライマーペアは、RNAのμL(ストック溶液濃度)あたりわずか1〜100のターゲットRNAコピーを検出する必要があります。
10. 生物学的三重で核酸配列ベースの増幅感度実験を繰り返す。このステップは、患者サンプルを使用した実験に移る前に、結果の再現性を確認するのに役立ちます。
11. 随意： 長期使用および輸送のためのスイッチDNAの信頼できる供給源を得るには、従来のクローニング法を使用して、選択したスイッチ配列をプラスミドにクローニングします。同様に、標的トリガーRNA配列は、保存のために選択されたプラスミドにクローニングすることもできる。

表6:NASBA反応成分。

表7:NASBAの反応条件。

表8:紙系無細胞反応成分。

9.患者サンプルの収集とウイルスRNA抽出

注:このセクションでは、患者サンプルを収集し、RNA精製キットを使用してRNAを抽出するためのプロトコルについて説明します。以下のプロトコルは、末梢血から血清を取得するために使用されます。この研究で使用されたサンプルは、ブラジルのペルナンブコ州で発熱、発疹、関節痛、またはその他のアルボウイルス感染に関連する症状を示す患者から収集されました。

1. アルボウイルス感染が疑われる患者から末梢血サンプルを収集します。標準的な無菌技術を使用して静脈穿刺(全血管)を実行します。サンプルチューブに匿名コードとサンプル収集日をラベル付けします。
2. 血液を遠心分離して、血清を2,300 x g で10分間分離します。ピペットを使用して、1.5 mLチューブでのRNA抽出に使用する血清(200 μL)のアリコートを調製します。
   注:サンプル採取直後にRNA抽出を実行できない場合は、血清サンプルを下流に塗布する前に-80°Cで保存する必要があります。
3. キャリアRNAを含む560 μLのバッファーAVL(ウイルス溶解バッファー)を1.5 mLチューブにピペットで入れます。140 μLの血清をチューブ内のバッファーAVL/キャリアRNA混合物に加えます。パルスボルテックスで15秒間混合します。
4. 室温で10分間インキュベートした後、サンプルを短時間遠心分離してチューブの底に内容物を回収します。560 μLのエタノール(96%-100%)をサンプルに加え、パルスボルテックスで15秒間混合します。混合後、サンプルを遠心分離してチューブの底に内容物を集めます。
5. ステップ9.4の溶液630 μLをリムを濡らさずにスピンカラムに慎重に加えます。このステップに続いて、キャップを閉め、6,000 x g で1分間遠心分離します。スピンカラムを清潔な2 mL収集チューブに入れ、ろ液を含む使用済みの収集チューブを廃棄します。
6. スピンカラムを慎重に開き、手順9.5を繰り返します。スピンカラムを慎重に開き、500 μLのバッファーAW1(洗浄バッファー1)を追加します。キャップを閉め、6,000 x g で1分間遠心分離します。スピンカラムを清潔な2 mL収集チューブに入れ、ろ液を含む使用済みの収集チューブを廃棄します。
7. スピンカラムを慎重に開き、500 μLのバッファーAW2(洗浄バッファー2)を追加します。キャップを閉め、20,000 x g で3分間遠心分離します。スピンカラムを清潔な2 mL収集チューブに入れ、ろ液を含む使用済みの収集チューブを廃棄します。
8. 下流の酵素反応で問題を引き起こす可能性のある残留バッファーAW2による汚染を避けるために、スピンカラムを清潔な2 mL収集チューブに入れ、使用済みの収集チューブをろ液とともに廃棄してください。20,000 x g で1分間遠心分離します。
9. スピンカラムを清潔な1.5 mLチューブに入れ、使用済みの回収チューブをろ液とともに廃棄します。スピンカラムを注意深く開き、室温に平衡化したバッファーAVE(溶出バッファー)を60 μL加えます。このステップに続いて、キャップを閉じ、室温で1分間インキュベートします。
10. 6,000 x g で1分間遠心分離します。溶出されたRNAは、NASBAおよびRT-qPCRの入力として並行して使用できます。
11. 手順8.3から8.11に従って、抽出した患者RNA1 μLを使用して核酸配列ベースの増幅と紙ベースの無細胞反応を実行し、陰性および陽性の対照反応を確実に含めます。反応後、384ウェル反応プレートを調製し、ポータブルプレートリーダー装置で37°Cでアッセイを実行します(詳細は 補足プロトコルを参照)。
    注:培養ジカウイルスから抽出された10⁴ および10 2^PFU /mLの2つのRNA濃度は、臨床検証中のすべての実験のポジティブコントロールとして使用されます。前述のコントロールに加えて、トリガー(10 ng / μL)もポジティブコントロールとして含めることが重要です。
12. すべての実験の最後に、プレー可能なプレートリーダーからの生データ(.csvファイル)をオンラインで安全なデータベースにアップロードできます。さらに、ポータブルプレートリーダーは、サンプルがジカウイルスに対して陽性か陰性かを示すレポートを生成します(図6)。インキュベーション中に得られたすべてのグラフの例については、代表的な結果のセクションを参照してください(図7)。
    注意: ユーザーは、USB 経由で ポータブルプレートリーダーから自分のコンピューターにファイルを転送することもできます。

10.ポータブルプレートリーダーデバイス

1. 携帯型プレートリーダー装置(図8)は、従来のプレートリーダ²⁴の代替として使用することができる。プロトコルと代表的な結果については、 補足プロトコルを参照してください。

11. ジカウイルス検出のためのRT-qPCR

注:このセクションでは、患者サンプルからジカウイルスを検出するためのRT-qPCRを実行する手順の概要を説明します(補足プロトコルを参照)。

1. 汚染を避けるために、RT-qPCRコンポーネントは増幅プロセスから隔離された領域(クリーンフードなど)で組み立ててください。RT-qPCRバッファー、酵素、プライマー/プローブを氷上またはコールドブロック上に置きます。これに続いて、 表9に従って氷上の384ウェルプレートに反応物を加える。
   注:陰性(抽出対照および非テンプレート対照[NTC])および陽性対照(10⁴ PFU / mL)は、すべての実験に推奨されます。
2. 試薬を1.5 mLの微量遠心チューブに加えた後、上下にピペッティングして反応液を混合し(ボルテックスしないでください)、6.5 μLを各ウェルに分注します。各RNAテンプレートを3.5 μLずつ添加します。
3. プレートの上部にPCRフィルムを置きます。384ウェルプレートを600 x g で2分間遠心分離します。
4. 表10に概説されている以下のサイクリング条件を使用して、プレートをRT-qPCRマシンに置きます。結果を解析するには、RT-qPCRマシン設計および解析ソフトウェアを使用し、自動閾値とベースラインを検討します(補足プロトコルの詳細を参照)。

表9:患者サンプル³¹からジカウイルスを検出するための疾病管理予防センター−CDC USAプロトコルに基づいてジカウイルスRNAを増幅するためのRT−qPCR成分。

表10:RT-qPCRのサイクル条件。

計算設計パイプラインに続いて、3つのトーホールドスイッチの構築がPCRによって実行されました。PCR産物は、アガロースゲル電気泳動を用いて分析した(図2)。3,000 bp付近のクリアバンドの存在は、トーホールドスイッチに結合した lacZ 遺伝子とほぼ同じ大きさであり、典型的には反応が成功したことを示している。または、バンドのないレーン、複数のバンド、または正しくないサイズのバンドは、PCRが失敗したことを示します。PCRが失敗した場合は、反応条件やプライマー配列を最適化する必要があります。

組み立てられたトーホールドスイッチをスクリーニングして、それぞれの in vitro 転写トリガーRNAに対して各センサーを評価しました(図3)。3つのセンサーはすべてOD570 の吸光度の増加を示しましたが、スイッチ27B(図3A)は最も速いオンレートを示しました。スイッチ33Bおよび、程度は低いが47Bは、標的トリガーRNAの非存在下でOD570 吸光度の増加を示し、これらのスイッチが何らかのバックグラウンド活性またはリーク性を有することを示している(図3B、C)-特異性を低下させる可能性があるため、候補センサーには望まれない特性。ON/OFF信号比が最も高いセンサーをより明確に識別するために、OD570 吸光度の倍率変化を計算し(補足情報のセクション5を参照)、プロットしました(図4)。この分析から、スイッチ27BがON/OFF比約60で最高の性能を発揮するセンサであることが明らかである。

次に、最高性能のトーホールドスイッチ(27B)の感度を、NASBA反応と結合したときにトーホールドスイッチを活性化するのに必要な最低RNA濃度を決定することによって評価しました。このグラフは、最高性能のジカ熱センサーが、μLあたり1.24分子という低い濃度(~2 aMに相当)のRNAを検出できることを示しています。 図5)。

スイッチ27Bが特定され検証された後、センサー材料はブラジルのペルナンブコ州のレシフェのチームメンバーに配布されました。ブラジルでは、ジカウイルス診断プラットフォームの臨床診断精度を、比較のためにRT-qPCRと並行して、ジカウイルス患者サンプルを使用して評価しました。紙ベースのジカ熱診断プラットフォームを検証するために、紙ベースのセンサーの比色出力をインキュベートして読み取ることができるポータブルプレートリーダーを使用しました。黄色から紫への色の変化は陽性サンプルを識別するために使用されますが、陰性サンプルは黄色のままです(図6)。ポータブルプレートリーダー(図8)によって生成された結果を視覚化するための追加のオプションは、各紙ベースの反応の比色応答を経時的にプロットすることです。サンプルは3回でテストされ、しきい値を超えたサンプル(赤い線を1に設定)は陽性と見なされ、しきい値を下回るサンプルは陰性と見なされました(図6 および 図7)。

最後に、ジカトウホールドスイッチセンサーの臨床性能を、ジカウイルス感染を診断するための現在のゴールドスタンダードの方法と比較するために、すべての患者サンプルをRT-qPCRと並行してテストしました。2つの代表的な患者サンプルの増幅プロットを、RT-qPCRによるジカウイルスの検出についてトリプリケートでテストしました(図9)。サイクルしきい値(Ct)値が≤38の場合、サンプルは陽性と見なされます。赤い線は陽性サンプルを示し、青い線はジカウイルスの陰性サンプルを示します。

図2:PCR産物の品質を評価するためのアガロースゲル電気泳動。 PCR産物は、1X TAE中の1%アガロースゲルで分析され、80 Vで90分間実行されます。通常、単一のクリアバンドは反応が成功したことを示します。レーン1:1 kb DNAラダー;レーン2〜4:それぞれ27BスイッチDNA、33BトリガーDNA、および47BトリガーDNA。左側の数字はバンド サイズを bp で表しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:紙ベースのジカセンサー用の3つのトーホールドスイッチのプロトタイピング。 3つの紙ベースのRNAトーホールドスイッチセンサーの性能を37°Cで130分以上測定しました。各グラフには 2 つのトレースが含まれており、1 つはスイッチのみのコントロールを表し、もう 1 つはスイッチとトリガーを表します。3つのグラフは、トーホールドスイッチセンサ27B(A)、33B(B)、および47B(C)を用いて取得されたデータを表す。エラーバーは、3回の反復からの平均(SEM)の標準誤差を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:570 nmでの吸光度の倍率変化を計算することによって、最も高性能なセンサーを特定します。 フォールド変化(または最大ON/OFF比)は、スイッチのみのコントロールとスイッチプラストリガーCFPSアッセイの間の130分での吸光度(OD570)の比を測定することによって計算されます。エラーバーは、3回の反復からのSEMを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:最高性能のスイッチの感度評価。 インビトロ 転写されたジカRNAはNASBA反応に滴定されます。1時間のインキュベーション後、反応物を紙ディスク上の無細胞PURExpress反応に1:7の比率で添加しました。37°Cで130分後のフォールド変化をプロットした。このフィギュアは24から再現しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:キャプチャされた画像データがロードされたポータブルプレートリーダーキャプチャページ。 この図は、データ収集実行中にポータブルプレートリーダーによってキャプチャされた最終画像のサンプル画像を示しています。元の日付/タイムスタンプは、画像の上部に表示されます。黄色は対照反応または陰性反応を示し、紫色は陽性反応を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:データ分析モード。 左側で、ユーザーはプロットするデータセットを選択します。グラフは、サンプルまたはコントロールセットごとに一意の色で右側に表示されます。赤い破線は、陽性および陰性のサンプルを決定するためのしきい値として機能します。閾値を超える3連でテストされたサンプルは陽性と見なされ、閾値を下回るサンプルは陰性と見なされます。エラーバーは、3回の反復からの標準偏差(SD)を表します。Ctrl 1 から Ctrl 5 はコントロールを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 8.プラム、ポータブルプレートリーダー。 このポータブルプレートリーダーは、ラボインボックスとして機能し、比色反応をインキュベートおよび監視するための温度制御プレートリーダーとして機能します。このポータブルデバイスは、紙ベースのジカセンサーの定量的かつ高スループットな測定を現場で提供できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図9:ジカウイルスの検出のために3連でテストされた2つの患者サンプルの増幅のRT-qPCRプロット。 サイクル閾値(Ct)値が≤38の場合、サンプルは陽性と見なされます。赤い点線は、陽性および陰性のサンプルを決定するためのしきい値として機能します。赤いトレースは陽性サンプルを示し、青いトレースは陰性サンプルを示します。ΔRn(デルタRn)値は、試験したすべてのサンプルについてRT-qPCR装置によって検出された蛍光シグナルの正規化された大きさを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足プロトコル ファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図。 これらの図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

K.P.とA.A.G.は、紙ベースのトーホールドセンサー関連技術の共同発明者です。Y.G.、S.C.、K.P.はLSK Technologies, Inc.の共同設立者であり、PLUM関連技術の共同発明者です。M.K.、K.P.、A.A.G.は、En Carta Diagnostics Ltd.の共同設立者です。他の著者には利益相反はありません。特許:PLUMデバイス:Y.G.、S.C.、およびK.P.特許出願はトロント大学によって提出され、LSKテクノロジーズ社に割り当てられました。 2020年2月27日に出願された米国仮特許出願第62/982,323号。Toeholdスイッチ特許:A.A.G.、P.Y.、およびJ.J.C.「リボレギュレーター組成物および使用方法」、特許。WO2014074648A3 2012年11月6日出願;紙ベースの診断特許:K.P.およびJ.J.C.「紙ベースの合成遺伝子ネットワーク」米国特許出願中No.US15 / 963,831 2013年12月6日出願;ジカ特許1:K.P.、A.A.G.、M.K.T.、D.B.、G.L.、T.F.、およびJ.J.C.、「Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform」、2016年10月4日出願の米国仮特許出願第62/403,778号;ジカ特許2:K.P.、A.A.G.、M.K.T.、D.B.、G.L.、T.F.、およびJ.J.C.、「Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform」、2016年5月25日出願の米国仮特許出願第62/341,221号。