in vitroでのパラクリン非標準Wntシグナル伝達のモデリング

非標準的なWntシグナル伝達は、細胞フィラメントの構成と方向性の移動を調節する進化的に保存された経路です。この経路は、胚組織形態形成^1,2,3、リンパおよび血管血管新生4,5,6,7、および癌の成長および転移^8,9,10を含む複数の生物学的プロセスに関与しています。.細胞レベルでは、非標準的なWntシグナル伝達は、シグナル伝達細胞とシグナル受信細胞の間の協調的なパラクリン相互作用を介して行われます。これらの相互作用は、異なる系統またはタイプの細胞間で頻繁に起こり、最大19個のリガンドおよび複数の受容体、共受容体、および下流のシグナル伝達エフェクターを含む多様な分子ネットワークを含む¹¹。このシグナル伝達プロセスをさらに複雑にしているのは、リガンドと受容体の組み合わせが状況依存的および組織依存的に変化する可能性があることが以前の研究で示されている^12,13、およびシグナル受信細胞で非標準的なWntシグナル伝達を駆動する同じソースリガンドが複数のシグナル送信細胞タイプによって生成される可能性があることが示されています^14,15。.非標準的なWntシグナル伝達に関連する細胞および分子の複雑さを考えると、in vivoで個々の臨床的に関連するメカニズムを研究する能力は限られています。

インビトロでの細胞培養技術を用いて非標準的なWntシグナル伝達を研究する試みがなされている。例えば、細胞単層で実施される創傷治癒アッセイは、細胞指向性移動を機能的に評価するために使用されてきた⁴、^16、17、^18、19。免疫染色技術は、細胞形態7,10、構造、および非対称分極における非標準的なWnt誘発変化を評価するために、表面タンパク質発現の空間解析を実行するために使用されています^7,10,および非対称分極^18,19,20。 これらのアプローチは、シグナル受信細胞におけるWnt関連の表現型を特徴付けるための重要なツールを提供してきましたが、これらのプロトコルにシグナル送信コンポーネントがないため、in vivoで観察されるパラクリンシグナル伝達メカニズムを正確にモデル化する能力が制限されています。その結果、非標準的なWnt経路のシグナル送信細胞と受信細胞、特に異なる細胞タイプの細胞間のパラクリンシグナル伝達相互作用の堅牢で再現性のある評価を可能にするin vitroシステムを開発することが依然として重要です。

この目的のために、この研究の主な目的は、in vitroでパラクリン非標準的なWntシグナル伝達相互作用をモデル化するためのプロトコルを確立することでした。私たちは、これらの相互作用のシグナル送信およびシグナル受信成分を再現し、標準的な分子、遺伝、または薬理学的アプローチを使用して、非標準的なWnt経路における特定のリガンド受容体メカニズムを独立して研究できる非接触共培養システムを開発しました。NCCを介したWntシグナル伝達のメカニズムを、確立されたマウス細胞株を用いて筋芽細胞で調べました。原理の証明として、このモデルは、^NCCs21とSHF心筋芽細胞前駆細胞との間の関連する非標準的なWntシグナル伝達経路としてWnt5a-ROR2軸を関与させるマウスにおける以前のin vivo研究の所見を裏付けるために使用された3,22,23。

1.実験前の細胞の増殖と継代

1. C2C12細胞培養:
   1. ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)と10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを組み合わせて、500 mLのC2C12培地を調製します。
   2. C2C12細胞のバイアルを37°Cの水浴中で解凍する。C2C12細胞が解凍されている間に、5 mLのC2C12培地を15 mLのコニカルチューブに加えます。直ちにP1000ピペットを使用して、解凍した細胞を15 mLチューブに移します。
      注:C2C12細胞は、心筋芽細胞前駆細胞をモデル化するための初代細胞株として以前に使用および検証されているマウス筋芽細胞です。
   3. 血清学的ピペットを使用して、円錐管内のC2C12細胞を穏やかに混合します。次いで、融解した細胞の全量をC2C12培地(6mL)に^75cm2 フラスコに加える。
   4. 6 mLの新しいC2C12培地をフラスコに加え、総容量12 mLにします。細胞と培地溶液がフラスコの底全体を覆うようにフラスコをゆっくりと回転させます。フラスコを細胞培養インキュベーター(37°C、5%_CO2)に入れて、細胞を接着させた。
   5. 細胞が~60%のコンフルエントに達するまでインキュベーター内で増殖させます。
      注:これは、インキュベーターから細胞を定期的に取り出し、顕微鏡下でそれらのコンフルエント性をすばやく確認することによって決定できます。細胞がインキュベーターから取り除かれる時間を最小限に抑えるようにしてください。
2. 継代C2C12細胞:
   1. C2C12培地、500 mLの1x PBS、および0.25%トリプシン-EDTAを37°Cの水浴中で温めます。試薬を温めたら、すべての試薬を細胞培養フードに移します。
   2. C2C12細胞が入ったフラスコを細胞培養フードに入れます。C2C12細胞を含むフラスコを温かい1x PBSで2回静かにすすぎます。
      1. フラスコを45°の角度で傾け、真空吸引に接続されたガラスピペットでC2C12培地を吸引します。45°の角度を維持しながら、血清学的ピペットを使用してフラスコの角に10 mLの温かい1x PBSを慎重に加えます。フラスコを表面に平らに置き、フラスコを円を描くようにゆっくりと動かして、1x PBSが細胞の単層全体を洗浄するようにします。
         注意: 培地の吸引中にC2C12単層を破壊しないように注意してください。
   3. 2回目の洗浄後に1xPBSを取り外します。フラスコに1mLの0.25%トリプシン-EDTAを加え、上記のようにフラスコを静かに動かして、トリプシン-EDTA溶液をできるだけ多くの単層に広げ、フラスコをインキュベーターに2分間入れます。
   4. 2分間のインキュベーション後、フラスコをインキュベーターから取り出し、軽くたたいて残りの細胞を剥がします。
   5. 9 mLのC2C12培地を血清学的ピペットでフラスコに加え、トリプシンをクエンチします。血清学的ピペットを使用して、細胞を培地で穏やかにすすぎ、10 mLのトリプシン処理細胞懸濁液を回収します。10 mLの細胞懸濁液を新しい15 mLコニカルチューブに加え、100 × g で5分間遠心分離します。
   6. コニカルチューブを細胞培養フードに戻し、真空吸引に接続されたガラスピペットで上清を除去します。上清を吸引している間は、円錐管の底にある細胞ペレットを乱さないように注意してください。これを行うには、~0.2 mLの上清を円錐管に残します。細胞を10 mLの新しいC2C12培地に再懸濁します。
   7. 追加の継代のために、再懸濁した細胞1 mLを75 cm² フラスコに加えます。血清学的ピペットでフラスコに11 mLのC2C12培地を加え、フラスコをインキュベーターに入れます。
3. STO細胞培養:
   1. 7% FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、および 2 nM L-グルタミンを含む 500 mL の DMEM を作製して、STO培地を調製します。
   2. 500 mLのティッシュグレードまたはオートクレーブ水を入れたボトルに0.5 gのゼラチンパウダーを加えて、0.1%ゼラチンを調製します。7 mLの0.1%ゼラチン溶液を75 cm² フラスコに加えます。ゼラチン溶液がフラスコの底全体を覆うようにフラスコを回転させる。フラスコを細胞培養フード内で室温で30分間インキュベートします。
   3. 30分間のインキュベーション後、真空吸引に接続されたピペットを使用して余分なゼラチンを除去します。使用前にフラスコをさらに30分間インキュベーターに入れたままにします。
   4. STO細胞のバイアルを37°Cの水浴中で解凍する。P1000ピペットを使用して、解凍した細胞を、新たに調製したSTO培地5 mLを含む15 mLコニカルチューブに直ちに移します。
      注:STO細胞は、細胞培養プロトコルでフィーダー細胞として日常的に使用されるマウス胚性線維芽細胞です。
   5. 血清学的ピペットを使用して円錐管内の細胞を穏やかに混合する。細胞の全容量(6mL)をゼラチンコーティングされた^75cm2 フラスコに加える。フラスコを回転させて、細胞懸濁液がフラスコの底に沿って良好に分布していることを確認します。
   6. 6 mLの新しいSTO培地をフラスコに加え、総容量12 mLにします。上記のようにフラスコを回転させて、細胞と培地がフラスコの底に沿って十分に分布していることを確認します。フラスコを37°Cのインキュベーターに入れ、細胞を接着させます。細胞が~60-70%のコンフルエントに達するまでインキュベーター内で増殖させます。
4. STO細胞の継代:
   1. STO細胞培地、1xPBS、および0.25%トリプシン-EDTAを37°Cの水浴中で温めます。
   2. STO細胞を含むフラスコを、ステップ1.2.2.1の説明に従って、温かい1x PBSで2回静かにすすぎます。
   3. P1000ピペットを使用して、1 mLの0.25%トリプシン-EDTAをフラスコに加えます。フラスコを37°Cのインキュベーターに5分間入れます。
   4. 5分間のインキュベーション後、インキュベーターからフラスコを取り出します。フラスコを軽くたたいて、付着細胞を剥離します。
   5. フラスコに9 mLのSTO培地を加えてトリプシンをクエンチし、上記のようにトリプシン処理細胞懸濁液10 mLを回収します。10 mLの細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに加え、100 × g で5分間遠心分離します。
   6. 上清を除去し、上記のように10 mLのSTO培地に細胞を再懸濁します。追加の継代のために、再懸濁した細胞1 mLを75 cm² フラスコに加えます。11 mLのSTO培地を加え、フラスコを回転させてフラスコの底に沿って細胞と培地が均一に分布するようにし、フラスコをインキュベーターに入れます。
5. 不活性STO細胞培養およびO9-1細胞基礎培地調製:
   1. 500 mLのDMEMを15%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、2 nM L-グルタミン、0.1 mMの最小非必須アミノ酸、1 nMピルビン酸ナトリウム、および55 μMβ-メルカプトエタノールと混合することにより、O9-1細胞基礎培地を調製します。
   2. マイトマイシンCバイアルに直接1 mLの1x PBSを加えて、0.5 mg/mLの濃度で1x PBS中のマイトマイシンC溶液を調製します。P1000ピペットで溶液を複数回ピペットします。マイトマイシンCを1x PBSにさらに溶解するには、バイアルをボルテックスミキサーまたはベンチトップロッカーに45分から1時間置きます。
   3. 標準STO培地に添加した最終濃度0.01 mg/mLのマイトマイシンCでSTOプレートを処理して、STO細胞を不活性化します。STOプレートをインキュベーター内に2時間置き、インキュベーターの外で過ごす時間を最小限に抑えることにより、マイトマイシンCを含むフラスコを光から保護するように注意します。マイトマイシン処理に続いて、ステップ1.2.2.1に記載されているように、1x PBSで細胞を2回洗浄します。
      注:マイトマイシンCはSTO細胞の増殖を阻害するため、フラスコ内で過剰にコンフルエントになることなく、数日間にわたってコンディショニング培地を生成するために使用できます。
   4. 1x PBSを除去した後、不活化STO細胞培養液に12 mLのO9-1基礎培養液を加え、24時間インキュベートします。コンディショニングされた不活化STO + O9-1基礎培地を収集し、光から保護するためにホイルで包まれた50 mLコニカルチューブに入れます。
   5. 上記のように、不活化STO細胞培養物に12 mLの新鮮なO9-1基礎培養液を追加します。不活化STO細胞を含む同じ側面に新しいO9-1基礎培養培地を24時間ごとに添加して、この手順を繰り返します。
      注:マイトマイシンC治療後、不活性化されたSTO細胞は増殖できません。したがって、不活性化STO細胞を含むフラスコは、馴化培地を生成するために再利用することができる。
   6. コンディショニングされた不活化STO+O9-1基礎培地を含むホイルで包まれた50 mLコニカルチューブを、合計500 mLの培地が回収されるまで4°Cで保管します。
6. O9-1細胞培養:
   1. 500 mLのコンディショニングSTO+O9-1基礎培地を用いてO9-1細胞増殖培地を調製し、10³ 単位の白血病抑制因子(LIF)と25 ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子(塩基性FGF)を添加します。
   2. ステップ1.3.2〜1.3.3で説明されているように、0.1%ゼラチンコーティングフラスコを準備します。
   3. O9-1細胞のバイアルを37°Cの水浴中で解凍する。解凍した細胞を、新たに調製した5 mLのO9-1増殖培地を含む15 mLのコニカルチューブに直ちに移します。
      注:O9-1細胞株は、マウスから生成された唯一の安定した多能性神経堤細胞株です。この細胞株は、神経堤 のin vitro 実験で一般的に使用されます。
   4. 血清学的ピペットを使用して細胞を穏やかに混合します。6 mLの細胞全体をゼラチンコーティングした75 cm² フラスコに加えます。
   5. 6 mLのO9-1増殖培地をフラスコに加え、総容量12 mLにします。フラスコを37°Cのインキュベーターに入れ、細胞を接着させます。細胞が~60-70%のコンフルエントに達するまでインキュベーター内で増殖させます。
7. 継代O9-1細胞:
   1. O9-1増殖培地、1x PBS、および0.25%トリプシン-EDTAを37°Cの水浴中で温めます。
   2. O9-1細胞を含むプレートを、ステップ1.2.2.1の説明に従って、温かい1x PBSで2回静かにすすぎます。
   3. フラスコに0.25%トリプシン-EDTA1 mLを加え、37°Cのインキュベーターに5分間入れます。
   4. 5分間のインキュベーション後、フラスコをインキュベーターから取り出し、フラスコを軽くたたいて接着細胞を剥離します。
   5. 9 mLのO9-1増殖培地をフラスコに加え、トリプシンをクエンチします。10 mLのトリプシン処理細胞懸濁液を収集し、この細胞懸濁液10 mLを15 mLのコニカルチューブに加えます。チューブを100 × g で5分間遠心分離します。
   6. 上清を除去し、細胞を10 mLのO9-1増殖培地に再懸濁します。追加の継代のために、1 mLの再懸濁した細胞を75 cm² フラスコに加えます。11 mLのO9-1増殖培地を加え、細胞を含むフラスコを12 mLの培地に入れて37°Cのインキュベーターに入れます。

2. 共培養系における細胞のプレーティング

1. C2C12セルチャンバーのめっき:
   1. トリプシン処理後(ステップ1.2に記載)、C2C12細胞ペレットを10 mLのC2C12培地に再懸濁します。再懸濁したC2C12細胞0.5 mLを除去し、9.5 mLの新鮮なC2C12培地を含む新しい15 mLコニカルチューブに加えることにより、C2C12培地で細胞を1:20の比率で希釈します。懸濁液を血清学的ピペットで穏やかに混合する。
   2. P1000ピペットを使用して、1:20希釈したC2C12細胞を新しい4室ウェルの各ウェルに1 mL加え、4室ウェルをインキュベーターに入れます。
2. O9-1セルインサートのめっき:
   1. トリプシン処理後、O9-1細胞ペレットを10 mLのO9-1増殖培地に再懸濁します。再懸濁したC2C12細胞0.5 mLを除去し、9.5 mLの新鮮なO9-1増殖培地を含む新しい15 mLコニカルチューブに加えることにより、O9-1増殖培地で細胞を1:20の比率で希釈します。懸濁液を血清学的ピペットで穏やかに混合する。
   2. 1 mLのO9-1増殖培地で満たされた新しい4チャンバーウェルの各ウェル内に単一の透過性インサート( 材料の表を参照)を配置します。
      注:この4チャンバーウェルは、ステップ2.1.3のC2C12セルを含むウェルとは異なる必要があります。
   3. P1000ピペットを使用して、希釈したO9-1細胞懸濁液を300 μLずつ各インサートに加えます。各インサートの底部が、1.3 mLのO9-1増殖培地で満たされたウェル内に沈んでいることを確認します。ウェルを37°Cのインキュベーターに入れます。
3. (オプション)。O9-1細胞またはC2C12細胞でsiRNAノックダウンを実行します。
   1. O9-1細胞インサートまたはC2C12細胞チャンバーウェルのいずれかをプレーティングしてから18〜24時間後にsiRNAによる遺伝子ノックダウンを実行します。
      1. siRNAとトランスフェクション試薬を還元血清培地( 材料表を参照)で、メーカーの推奨および実験に必要な濃度に従って希釈します。希釈したsiRNAとトランスフェクション試薬(1:1)を穏やかに混合し、室温で7分間インキュベートします。
         注:このプロトコルでは、このsiRNA濃度が標的遺伝子発現の十分なノックダウンをもたらすと決定されたため、50 nM濃度を使用しました。
      2. 実験デザインで決定されたように、siRNA-脂質複合体をO9-1細胞インサートまたはC2C12細胞チャンバーウェルのいずれかに追加し、細胞をsiRNA-脂質複合体とともに~36-48時間インキュベートします。

3.創傷アッセイの実施と筋芽細胞遊走の定量的評価

1. 創傷アッセイ:
   1. O9-1細胞インサートとC2C12細胞チャンバーウェルをインキュベーター内で接着および増殖させて、両方の細胞が~70-80%のコンフルエンシーになるまでしてから、プロトコルのこの部分に進みます。細胞が>90%コンフルエントに成長した場合、細胞は単にウェルから剥離するため、スクラッチアッセイを続行しないでください。
   2. 1x PBSおよびC2C12培地を37°Cの水浴に入れて温めます。
   3. C2C12チャンバーから上清培地をよく取り出し、1x PBSで細胞を1回洗浄します。1x PBSを取り外し、滅菌P10ピペットチップで細胞をすぐに引っ掻きます。
      1. 滅菌P10ピペットチップを一方向にしっかりと通して、細胞単層の全長または幅(右から左、上から下など)に渡します。細胞を含む各ウェルを一度だけ引っ掻いてください。
         注:スクラッチ結果を最適化するには、同様のレベルのコンフルエンシーで異なる実験条件のスクラッチウェルをスクラッチします。これを行うには、各4チャンバーウェルに必要な各実験条件(例えば、ウェル#1ネガティブコントロール、ウェル#2ポジティブコントロール)の細胞があることを確認します。さらに、傷ごとに新しい滅菌P10ピペットを使用し、毎回ピペットに同じ量の力を加えます。各ウェルに複数のスクラッチを作成しないでください。
      2. 引っかき傷の後、P1000ピペットチップを使用して、1 mLの1x PBSをウェルにすばやく戻します。傷がつくウェルごとにこのプロセスを繰り返します。
         注:各引っかき傷に関連するばらつきを考えると、各実験条件で創傷の作成に複数のウェル(n = 3)を使用することをお勧めします。これらのステップ中にセルが1x PBSなしでいる期間を最小限に抑えることが重要であるため、迅速に作業してください。各ウェルから1x PBSを除去した後、各ウェルに創傷を発生させるのに5秒以上かかるべきではありません。
   4. 創傷を生成し、各ウェルに1x PBSを追加した後、明視野倒立顕微鏡を使用して傷を画像化し、この画像をベースライン創傷サイズ(時間0)として使用します。イメージを撮影するには、次の手順を実行します。
      1. 電源ボタンを押して、コンピュータと顕微鏡の電源を入れます( 材料の表を参照)。チャンバースライドをステージに置き、対物レンズダイヤルを5倍の倍率に回転させます。
      2. コンピュータのデスクトップにあるソフトウェアアイコンをダブルクリックして、イメージングソフトウェア( 材料の表を参照)を開きます。ソフトウェアのホーム画面の[ カメラ ]タブをクリックします。 ライブ ボタンをクリックして、 AxioCam IC タブのセルを視覚化します。
      3. 光がカメラとコンピューターの画面に通過できるように、ライトフィルターが完全に引き出されていることを確認します。チャンバースライドを手動で移動および/または回転させて、 AxioCam IC タブのライブ画像の中央に創傷領域を配置します。
      4. 画像を撮影するには、[スナップ]をクリックして、画像を含むAxioCam ICタブの横に新しいタブを開きます。
      5. この静止画を保存するには、ソフトウェアのホームページの左上にある ファイル をクリックして 保存|| 、ファイル名ボックスに ファイル名 を入力します。図をカールツァイス画像(*.czi)形式(デフォルト設定)で保存し、左側のバーで [デスクトップ ]を選択して、ファイルをZen lite 2012ソフトウェアプログラムでのみ開くことができる .czi ファイルとしてデスクトップに保存します。
      6. 画像を.tiffとして保存するには、[ファイル] | [名前を付けて保存] をクリックし| [ファイル名] ボックスにファイル名を入力します。[タイプとして保存]ボタンをクリックし、ドロップダウンメニューから[*.tiff]を選択して、フィギュアをタグ付き画像ファイル(*.tiff)として保存します。
         注:.tiff形式は、任意の画像処理ソフトウェアで開くことができます。
      7. チャンバースライドを手動で再配置して、同じウェル内の創傷の他のポイントでさらに2〜3枚の画像を撮影します。
         注:合計で、これにより、各ウェルの創傷の3〜4個の重複しない高倍率画像が得られます。
   5. 各ウェルから1x PBSを取り出し、1 mLのC2C12培地を加えます。
      注意: 創傷発生後にチャンバーウェルに溶液を除去または追加するときは、細胞がチャンバーから十分に剥がれる可能性があるため、積極的にピペットをかけすぎないように注意してください。さらに、チャンバーをよく傾けて、各ウェルの角で溶液の吸引と再導入を行い、細胞の単層の破壊を最小限に抑えます。
   6. O9-1細胞を含むインサートをチャンバーウェルの各ウェルに手動で配置して、ウェルインサート共存システムを組み立てます。インサートの底部が下にあるC2C12セルのすぐ上になるように、インサートをウェルにゆっくりと押し込みます。ウェルインサートコンストラクトをインキュベーターに戻します。
      注意: インサートの底部が下にあるC2C12セルに物理的に触れたり、機械的に破壊したりしないようにしてください。
   7. セルが合計9〜12時間移動できるようにします。最適な移動時間を決定するには、創傷作成後6時間で細胞を確認し、その後2〜3時間ごとに細胞を確認します。対照または陽性対照条件の細胞が創傷を完全に覆い始めたら、実験を終了する。
      注:コンストラクトの非接触性を考えると、間隔の移動の進行をチェックするときに、上にあるインサートをウェルから取り外す必要はありません。遊走性の変動性は、このアッセイで使用される細胞の種類、創傷生成時の細胞密度、作成された創傷の幅、および操作された細胞の実験条件(遺伝子ノックダウン、組換えタンパク質添加など)などの要因に応じて観察されます。これらの試薬の濃度は、メーカーの推奨事項からのガイダンスに従って実験的に決定する必要があります。

4. 移動する筋芽細胞の免疫蛍光染色とイメージング

1. 移行アッセイを終了し、ウェルインサートシステムを分解する:
   1. 9〜1時間の移行期間(または実験条件で指定された代替時間)の後にO9-1セルインサートを取り外します。P1000ピペットを使用してC2C12培地を注意深く吸引します。チャンバーウェルに0.5 mLの1x PBSを加え、遊走後の細胞の最終画像を撮影します。
   2. 培地と混合した0.5 mLの1x PBSをすべて注意深く吸引し、キットの指示に従ってチャンバーウェルからプラスチックチャンバーを取り出し、下にあるスライドにC2C12細胞を入れたままにします。
      注意: チャンバーウェルを取り外すときは、スライドに付着しているC2C12細胞を破壊しないように注意してください。
2. 免疫染色の実施:
   1. すぐにスライドを4%パラホルムアルデヒド(PFA)を含むスライドホルダーに入れ、室温で10分間インキュベートします。4%PFAを注ぎ、0.1%Triton X-100含有1x PBS(1x PBST)をスライドホルダーに加えて、室温で15分間スライドを洗浄します。1x PBSTを注ぎ、スライドホルダーに1x PBSを加えて、室温で10分間スライドを洗浄します。この手順をもう一度繰り返して、合計2回の1x PBS洗浄を行います。
   2. スライドホルダーからスライドを取り外します。スライドの外縁を疎水性ペンでなぞり、スライドの周囲に疎水性の境界を作成し、スライドから溶液がこぼれるのを防ぎます。接着細胞を破壊しないように注意してください。
   3. 1%ウシ血清アルブミン(BSA)ブロッキング溶液(1x PBSで希釈)をスライドに加えます(スライドあたり~0.5 mL)。溶液がステップ 4.2.4 で作成した疎水性境界内に含まれていることを確認します。加湿したスライドチャンバー内で室温で1時間スライドをインキュベートします。
      注:ファロイジン免疫染色にはBSAブロッキングは必要ありませんが、プロトコルのこのステップでは、蛍光抗体染色とのカップリングが可能です。
   4. 1時間ブロッキングした後、スライドからブロッキング溶液を注ぎ、ファロイジン抗体(995 μLのBSA溶液に5 μLの抗体を加えて1%BSAブロッキング溶液で1:200に希釈)をスライドに加え、4°Cで一晩インキュベートします。ここでも、ステップ 4.2.4 で作成した疎水性境界内に溶液が含まれていることを確認します。ファロイジン抗体がAlexa Fluor-488色素に結合していることを考えると、スライドに添加する前後の抗体試薬の光曝露を最小限に抑えます。
   5. 翌日、光にさらされないように保護されたスライドホルダーにスライドを置きます(スライドホルダーをホイルで包むか、不透明なスライドホルダーを使用するなど)。スライドホルダー内の細胞を1x PBSで室温で10分間洗浄します。洗浄を繰り返して、合計3回の10分間の洗浄を行います。
   6. 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)含有封入剤を加え、スライドをガラスカバースリップで取り付けます。標準的な蛍光顕微鏡を使用して遊走した細胞を画像化します。

マウス筋芽細胞の遊走能に及ぼすNCCの影響
このアッセイは、筋芽細胞の移動能力に対するNCCの影響を評価するために最初に適用されました。 図1 は、アッセイの概略モデルの概要を示す。この影響をテストするために、スクラッチアッセイは、インサートの存在下で増殖したものと比較して、分離して増殖した筋芽細胞(NCCインサートなし)で実施されました。ポジティブコントロールとして、500 ng/mLの組換えWnt5a(rWnt5a)をNCCインサートを備えたチャンバーウェルに加えました。このrWnt5aの濃度は、C2C12細胞において実施された用量反応分析によって決定された(補足図S1)。NCCインサートの代表的な画像を 補足図S2に示し、NCCが現時点で健康であることを示しています。免疫蛍光は、50 nMの Wnt5a siRNAとのインキュベーション後にタンパク質レベルでWnt5aの堅牢なノックダウンを示します(補足図S3)。9時間の遊走期間の後、NCCの存在は、NCCインサートがない場合にアッセイされた筋芽細胞と比較して筋芽細胞の移動能力を有意に増加させることがわかった(72.6%創傷再人口領域対59.1%創傷再人口領域、p = 0.033)。rWnt5aを共培養ウェルに添加すると筋芽細胞の移動が加速し、 図2に示すように、一部の創傷領域は9時間の時点で完全に回復しました。予想通り、3つの条件すべてにおいて、遊走筋芽細胞は、整形式および突出した糸状突起およびラメロポディアおよびアクチン細胞骨格突起の非対称分極を含む正常な遊走細胞形態を示した(図2C)。

筋芽細胞の分極移動に対するNCC由来Wnt5aの重要性
筋芽細胞遊走に対するNCC由来Wnt5aのパラクリン効果を評価するために、NCCにおける Wnt5a のsiRNA媒介ノックダウンに続いて筋芽細胞で創傷治癒アッセイを実施した。まず、 Wnt5a ノックダウン効率をNCCでリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応によって検証しました。 Wnt5a に対する50nM siRNAで処理すると、陰性対照(スクランブル)siRNAと比較して Wnt5a 遺伝子発現が64%減少することがわかった(図3A)。この濃度を用いて、O9-1細胞インサートを、共培養を組み立てる48時間前にコントロールsiRNAまたは Wnt5a siRNAのいずれかでトランスフェクトした。C2C12細胞を通常の条件下で増殖させ、適切なコンフルエントで創傷を作製した。創傷発生直後に、陰性対照または Wnt5a ノックダウンNCCインサートを各ウェルに添加した。10時間の遊走期間の後、NCCにおける Wnt5a のノックダウンは、対照NCCでアッセイされた筋芽細胞と比較して、基礎となる筋芽細胞遊走能力を有意に低下させることがわかった(39.1%創傷再人口領域対74.8%創傷再人口領域、p < 0.001)。さらに、 Wnt5a のノックダウンを伴うNCCの存在下でアッセイされた筋芽細胞は、細胞質領域の減少およびより少ないアクチン細胞骨格突起を含む、免疫染色による異常な細胞学的形態を示した(図3D)。筋芽細胞の移動を救済するために、500 ng/mLの外因性サプリメント rWnt5a を Wnt5a ノックダウンインサートを含む共存ウェルに添加しました。外因性rWnt5aの添加は、これらの筋芽細胞で観察された遊走性および形態学的欠陥を完全に救うことがわかった(図3C、D)。

分極移動のドライバーとしての筋芽細胞におけるROR2を介したWnt5aシグナル伝達
このパラクリンモデルにおけるシグナル受信細胞メカニズムをよりよく理解するために、筋芽細胞におけるROR2受容体のノックダウンに続いてアッセイを繰り返した。この実験では、筋芽細胞に創傷発生の40時間前~50 nMのROR2 siRNAをトランスフェクトしたところ、ROR2遺伝子発現を54%ノックダウンするのに十分であることが示されました(図4A)。この間、NCCインサートは通常の条件下で並行して成長しました。筋芽細胞が適切なコンフルエントに達した後、スクラッチアッセイを実施し、共存ウェルインサートを組み立てました。NCCインサートの存在下で10時間の遊走期間の後、ROR2ノックダウン筋芽細胞は、陰性対照siRNAで処理された筋芽細胞と比較して遊走能力の低下を示しました(48.1%創傷再移植領域対75.7%創傷再移植領域、p = 0.019)(図4B、C)。500 ng/mLのrWnt5aを添加しても、ROR2ノックダウン後の筋芽細胞遊走能を救出できず、ROR2の枯渇が筋芽細胞のWnt5aシグナルを受信する能力を阻害することを示唆しています(図4B、C)。ファロイジンの免疫染色は遊走データを裏付け、ROR2ノックダウン筋芽細胞におけるファロイジン陽性の層足および糸状足の減少が補足rWnt5aによって回復しなかったことを示しました(図4D)。

図1:アッセイの模式モデル。 ステップ1は、STOフィーダー細胞を用いたC2C12筋芽細胞およびNCCの インビトロ 増殖を含む。ステップ2では、共存システム内のNCCおよびC2C12細胞のプレーティングを行います。ステップ3は、細胞遊走能を評価するために基礎となるC2C12細胞において実施される創傷アッセイを含む。ステップ4では、ファロイジンの免疫染色を行い、遊走細胞の細胞学的構造と形態を評価します。略語:NCC =神経堤細胞;Ab =抗体。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:神経堤細胞の存在は筋芽細胞遊走能力を増加させる。 (A)創傷発生時の神経堤細胞(NCC)インサートの存在は、筋芽細胞遊走の改善をもたらす。NCC-C2C12共培養への外因性組換えWnt5a(rWnt5a)の添加は、筋芽細胞遊走に対して最も強いプラスの効果を有する。(B)創傷発生後9時間における平均筋芽細胞再増殖面積の定量化(エラーバーは標準偏差を示す)。(C)創傷発生後9時間の創傷境界における筋芽細胞のファロイジン染色。破線の長方形は、遊走前線のファロイジン染色された筋芽細胞を示しています。Bで定量した各実験条件について合計n=3サンプルを用いた。スケールバー= 200 μm(AおよびCの場合)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:神経堤細胞由来のWnt5aは筋芽細胞遊走に必要である。 (A)NCCにおけるsiRNA媒介ノックダウンを検証するためのWnt5aの相対mRNA発現。 (B)NCCにおけるWnt5aノックダウン後、C2C12筋芽細胞の遊走は有意に減少する。 外因性rWnt5aの添加は、筋芽細胞におけるこの遊走欠損を救済するのに十分である。(C)創傷発生後10時間における平均筋芽細胞再人口面積の定量化(エラーバーは標準偏差を示す)。(D)創傷発生後10時間の創傷境界における筋芽細胞のファロイジン染色。破線の長方形は、遊走前線のファロイジン染色された筋芽細胞を示しています。Cで定量した各実験条件について合計n=3サンプルを用いた。スケールバー= 200 μm(BおよびDの場合)。略語:NCC =神経堤細胞;siRNA = 低分子干渉RNA。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:Wnt5aは筋芽細胞のROR2受容体を介して移動を促進するシグナル を伝達します。 (A)C2C12細胞におけるsiRNA媒介ノックダウンを検証するための ROR2 の相対mRNA発現。(B)筋芽細胞における ROR2 のノックダウンは、NCCの存在にもかかわらず、それらの移動能力を低下させる。 外因性rWnt5aは、 ROR2 ノックダウン後の筋芽細胞遊走を救出できない。(C)創傷発生後10時間における平均筋芽細胞再人口面積の定量化(エラーバーは標準偏差を示す)。(D)創傷発生後10時間の創傷境界における筋芽細胞のファロイジン染色。破線の長方形は、遊走前線のファロイジン染色された筋芽細胞を示しています。 Cで定量した各実験条件について合計n=3サンプルを用いた。スケールバー= 200μm。略語:NCC =神経堤細胞;siRNA = 低分子干渉RNA。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図S1:組換えWnt5a補給のための用量依存的分析。 0 ng / mL、100 ng / mL、および500 ng / mLの組換えWnt5a補給試験の用量依存分析では、500 ng / mLの外因性rWnt5aが、 in vitro での12時間の遊走期間中に筋芽細胞の移動とファロイジン細胞構造の変化を促進するのに最適な濃度であることがわかりました。スケールバー = 200 μm。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S2:坑井インサートの代表的な画像。 (A)50 nM ネガティブコントロールsiRNAおよび(B)50 nM Wnt5a siRNAで処理したO9-1神経堤細胞を含むウェルインサートの明視野画像。スケールバー= 200μm。略称:siRNA = 低分子干渉RNA。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S3:siRNA媒介Wnt5aノックダウン後のO9-1細胞におけるWnt5aタンパク質発現の代表的な画像。 (A)50 nM ネガティブコントロールsiRNAおよび(B)50 nM Wnt5a siRNAで処理したO9-1神経堤細胞を含む細胞培養ウェルにおける Wnt5a タンパク質の免疫蛍光染色。スケールバー = 20 μM. 略語: siRNA = 低分子干渉RNA;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係がない状態で実施されたと宣言しています。