Method Article

顆粒細胞前駆体における原発性シリウム依存シグナル伝達経路を研究するための効率的で費用対効果の高いエレクトロポレーション法

DOI:

10.3791/63283

⸱

November 30th, 2021

 ,  , 
1Department of Chemistry, Faculty of Science, Hong Kong Baptist University

In This Article

Summary

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ここでは、費用対効果が高く、効率的で実行可能な一次小脳顆粒細胞前駆体(GCP)の遺伝子操作のための再現性のある インビトロ エレクトロポレーションプロトコルを提示する。さらに、このプロトコルはまた、一次GCP細胞における一次シリウム依存性ヘッジホッグシグナル伝達経路の分子的研究のための簡単な方法を示す。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一次シリウムは、ヘッジホッグ(Hh)シグナル伝達刺激を細胞表面から伝達するほぼすべての細胞に見られる重要なシグナル伝達オルガネラである。顆粒細胞前駆体(GCP)において、一次シリウムはHhシグナル伝達経路を調節することによって前駆細胞増殖を調整する極めて重要なシグナル伝達センターとして機能する。一次シリウム依存性Hhシグナル伝達機械の調査は、経路成分の インビトロ 遺伝子操作によって促進され、一次シリウムへの動的局在化を可視化する。しかし、現在知られているエレクトロポレーション法を用いたGCPの一次培養におけるトランスフェインのトランスフェクションは、一般にコストがかかり、しばしば低い細胞生存率および望ましくないトランスフェクション効率をもたらす。この論文では、高いトランスフェクション効率が80~90%、最適な細胞生存率を実証する、効率的で費用対効果の高いシンプルなエレクトロポレーションプロトコルを紹介します。これは、一次GCP培養における主要なシリウム依存性ヘッジホッグシグナル伝達経路の研究に適用可能な、単純で再現性のある効率的な遺伝子改変方法である。

Introduction

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小脳GCPは、生体内のHhシグナル伝達経路に対する高い存在量と高感度性のために、ニューロン前駆細胞型におけるHhシグナル伝達経路の機械を研究するために広く使用されています。GCPにおいて、一次シリウムは、前駆細胞6,7,8の増殖を調整する極めて重要なHhシグナル伝達ハブ5として機能する。一次シリウム上のHhシグナル伝達成分のインビジュアライゼーションは、内因性の基底レベルが低いため、しばしば困難です。したがって、目的の遺伝子のタンパク質発現レベルおよびフルオロフォアタグ付けの遺伝子導入修飾は、分子分解能で経路を研究するのに有用なアプローチである。しかし、リポソームベースのトランスフェクションアプローチを用いたGCP一次培養の遺伝子操作は、トランスフェクション効率が低いことが多く、さらなる分子調査を妨げる9。エレクトロポレーションは効率を高めるが、一般的には法外なベ....

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Protocol

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すべての動物関連の手順は、動物の取り扱いガイドラインと香港保健省によって承認されたプロトコルに従って行われました。動物実験免許(実験管理)条例(キャップ340)は、香港保健省から取得した。動物の仕事はHKBUの調査事務所および実験室安全委員会によって承認された動物の安全倫理に従って行われた。このプロトコルで使用されるすべての材料の詳細については、 資料表 を参照してください。

1. 実験前準備

  1. 培養メディアとバッファーの調製
    1. 無血清培地(SFM)
      1. SFMの50 mLを調製するには、100x L-グルタミン置換物500μL、ペニシリンストレプトマイシン500μL、ピルビン酸ナトリウム1mM、1MLの1ML(最終250μM)から49mLの神経基底培地を加えます。
      2. SFMを50 mL円錐形チューブで10mLと40mLの2つのアリコートに分割し、4°Cで最大1ヶ月間保管します。
    2. 消化遮断媒体:SFMで10%FBS
      1. 1.1 mLの熱不活化FBSをSFMの10 mLアリコートに加え、消化遮断培地を調製する。
    3. GCP培地:B27を用いてSFM
      1. GCP培地を調製するには、800 μLの無血清B-27サプリメントをSFMの....

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Results

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この提案されたエレクトロポレーション方法論は、オプティ-MEM( 材料表参照)を汎用試薬として用い、一貫して80~90%で高いエレクトロポレーション効率を達成できる(図1)。Smo-EGFPベクターのエレクトロポレーション効率は、全てのペアドボックスタンパク質-6(Pax6)発現GCP細胞における緑色蛍光陽性細胞の割合を定量することにより、DIV2ポストエレクトロポレーションで求めた。DMSOとSAG処理された群のエレクトロポレーション効率は同等に見えた(図1 および 表2)。

さらに、一次シリウムマーカーArl13bの免疫染色は、DIV2培養におけるGCPの毛素化率が、車両およびSAG処理群の両方で〜18%であったことを示している(DMSO:17.35%±0.59%;SAG: 18.24% ± 0.88%).この毛様化速度は、DIV2ポストエレクトロポレーションでの細胞表面に一次シリウム(Arl.......

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Discussion

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エレクトロポレーション法による原発GCP培養におけるトランスフェインのトランスフェクションは、典型的には低い細胞生存率と低いトランスフェクション効率9,10と関連している。この論文では、高効率と生存率を実証した、費用対効果が高く、再現性の高いエレクトロポレーションプロトコルを紹介する。また、一次GCP細胞における一次シリウム依存性Hhシグナル伝達経路の研究も簡単に行う方法を示す。

他の一般的なエレクトロポレーション方法では、多くの場合、特定のメーカーから購入しなければならない高価な細胞型エレクトロポレーション試薬が必要です。ここで説明する方法は、異なる細胞タイプに共通かつ経済的なエレクトロポレーション試薬を使用するため、有利であると考えられる。また、これらのデータは、エレクトロポレーション効率が〜80〜90%に達したことを示し、これは、他のエレクトロポレーションおよびトランスフェクション法と比較して高効率である

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は宣言する利害の対立を持っていません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、HKBUシードファンドとティア2スタートアップグラント(RG-SGT2/18-19/SCI/009)、研究助成金協議会共同研究基金(CRF-C2103-20GF)からC.H.H.Horに支援されました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GCP Culture
B27サプリメントLife Technologies Ltd17504044
Cell strainer, 70 & micro;mCorning352350
DNase I from usvine pancreasRoche11284932001
Earle's Balanced Salt SolutionGibco、Life Technologies14155063
FBS、認定Thermo ScientificSH30028.02
GlutamMAXTM-I 、100xGibco、Life Technologies35050061 L-グルタミン代替品
L-システインSigma AldrichC7352
MatrigelBD Biosciences 354277基底膜マトリックス
ニューロバサルGibco, Life Technologies21103049
Papain,懸濁液Worthington Biochemical CorporationLS003126
Poly-D-lysine HydrobromideSigma AldrichP6407
SAGCayman Chemical11914-1Smoothened Agonist
IF staining
ウシ血清アルブミンΣ AldrichA7906
パラホルムアルデヒドΣ AldrichP6148
Triton X-100Σ AldrichX100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat abRockland600-101-215希釈係数:1 : 1000
抗Arl13bマウスモノクローナル抗体NeuroMab75-287希釈係数:1:1000
抗Pax6ウサギポリクローナル抗体CovancePRB-278P希釈係数:1:1000
二次抗体ミックス
Alexa Fluor 488ロバ抗ヤギIgGInvitrogenA-11055希釈係数:1:1000
Alexa Fluor 555ロバ抗マウスIgGInvitrogenA-31570希釈係数: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 ロバ抗ウサギ IgGInvitrogenA-31573希釈係数: 1 : 1000
DAPIThermo Scientific62247希釈係数: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 キュベットチャンバーNepageneCU500
EPA エレクトロポレーションキュベット (2 mm ギャップ)NepageneEC-002
Opti-MEMLife Technologies Ltd31985070トランスフェクション用減血清培地
pEGFP-mSmoAddgene25395
スーパーエレクトロポレーター NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo ElectroporationNepageneNEPA21エレクトロポレーター

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
  2. Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the....

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Primary CiliumElectroporation MethodGranule Cell PrecursorHedgehog SignalingGenetic ModificationIn Vitro TransfectionCell ViabilityCilium Marker Arl13bSmoothened EGFP LocalizationPax6 Expression

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