3日間発生した雛胚を用いたフック虚血再灌流モデルの生成

Summary

本論文では、I/Rの発達と治療をよりよく理解するために、脊髄カスタマイズフックを用いた3日間のひよこ胚における虚血再灌流(I/R)モデリングについて述べている。このモデルは、シンプルで迅速で、安価です。

Abstract

心筋梗塞、脳卒中、末梢血管疾患などの虚血および再灌流(I/R)障害は、病気や死亡の主要な原因の一部です。イン ビトロ および インビボ モデルの多くは、現在、疾患または損傷した組織におけるI/Rメカニズムを研究するために利用可能です。しかし、現在までに 、ovo I/Rモデルには報告されておらず、I/Rメカニズムのより良い理解と薬物スクリーニングの迅速化を可能にする。この論文では、3日間のひよこ胚に脊髄をカスタマイズしたフックを用いてI/Rの発達と治療メカニズムを理解するI/Rモデリングについて説明する。このモデルは、DNA、RNA、およびタンパク質レベルの異常を調査するために使用できます。この方法は、簡単で、迅速で、安価です。現在のモデルは、独立して、または既存 のin vitro および in vivo I/Rモデルと組み合わせて使用することができます。

Introduction

虚血再灌流組織損傷は、心臓発作、虚血性脳卒中、外傷、および末梢血管疾患を含む多くの病理に関連している^{1、2、3、4,5}。これは主に、疾患の進行に関する包括的な理解の欠如と効果的な研究モデルの欠如によるものです。虚血性損傷は、組織の特定の領域への血液供給が遮断されたときに起こる。その結果、虚血性組織は最終的に壊死するが、速度は組織によって異なる。したがって、血液供給を回復することは、損傷を軽減するのに役立つ可能性があります。しかし、再灌流は虚血単独で^6,7,8よりも多くの組織損傷を引き起こすことが観察されている。したがって、効果的な治療介入を開発するためには、虚血再灌流の分子および細胞機構を理解することが必要である。現在、I/R傷害に対する有効な治療法は知られていない。この格差により、in vitroからin vivoモデルに至るまで、既存の問題^{9,10,11,12,13}に対処するための新しい実験モデルが作成されました。

ひよこ胚(ガルス・ガルス・ドメスティックス)は、アクセスの容易さ、倫理的受容性、比較的大きなサイズ(他の胚と比較して)、低コスト、および急速な成長のために研究に広く使用されています¹⁴。72時間の発達でひよこ胚を使用して、脊髄の助けを借りて右ビテリン動脈を閉塞して放出することで、ovo I/Rの中に胚を作り出しました。フックI/R虚血再灌流モデルと命名しました(図1)。本研究で利用されたモデルは、I/R損傷^15,16,17に頻繁に関連する酸化および炎症経路を含むすべての下流プロセスを正確にシミュレートすることができる。

Protocol

Eraのラクナウ医科大学と病院の制度的動物倫理委員会は、動物実験の管理と監督を目的とした委員会(CPCSEA)に従ってこれらの実験を行うための正式な承認は必要ないという書面による免除を発行しました。しかし、胚性苦痛の可能性を最小限に抑えるために、標準的な操作手順に従った。

1. バッファ調製(表1)

1. リンガーのソリューションを準備する
   1. リンゲルの溶液を調製するには、NaCl(123 mM)の0.72 g、_CaCl2 (1.53 mM)の0.017 g、70mLのKCl(4.96 mM)の0.037 gを無菌蒸留_H2Oの70 mLに溶解し、最終体積は100mLです。pH を 7.4 に調整します。完全に溶解し、オートクレーブしましょう。その後、0.22 μmフィルターを通してフィルターし、アリコートを一回使用量(約10 mL)にして室温で保存します。
2. 通常の生理食塩水(0.9%塩化ナトリウム、NaCl)を準備します。
   1. 70 mLの無菌蒸留_H2Oに、NaCl(154 mM)の0.9 gを溶解する。音量を100mLにします。121 °Cで15分間オートクレーブ。 必要に応じて、pHを 0.1 N HCl で 7.4 に調整するか、必要に応じて 0.1 N NaOH に調整します。15 mLの無菌遠心分離機チューブで10 mLのアリコートを作り、室温で保管します。
3. 70%エタノール(v/v)を準備します。
   1. 70 mLの純粋なエタノール(Mol. 46.07 g/L)を30 mLの無菌_H2Oに混ぜ合わせます。殺菌の必要性がない。
4. 1xリン酸緩衝液生理食塩分(1x PBS)を準備します。
   1. 1x PBSの100 mLを、_Na2HPO4·_7H2O(5.37mM)、0.8gのNaCl(136.8 mM)、0.2gのKCl(26.8 mM)、0.2gの_KH2PO4(14.6mM)の70mLに蒸留水の70mLを加えて調製します。 121 °Cで15分間、100mLとオートクレーブに溶解し、ボリュームを構成します。 pH を 7.4 に持ち込み、必要に応じて 0.1 N HCl または 0.1 N NaOH のドロップを 2、3 ドロップ追加します。15 mLの無菌遠心分離管で10 mLのアリコートを作り、室温で保管してください。

2. 1日目

1. 卵の殺菌に必要なすべてのツール(70%エタノール、クリーニングワイプ、卵ラック、OHPマーカー)を配置します。
2. ティッシュペーパーワイプを使用して70%エタノールで0日の卵をきれいにします。古い卵は胚を生じないかもしれないので、0日の卵だけを使用してください。
3. OHPマーカーを持つ卵に現在の日付を書きます。
4. 卵を36~37°Cの温度と湿度60%~65%に設定した卵インキュベーターに入れます。次の24時間の卵をインキュベートします。

3. 2日目

1. アルブミン(シャープエッジはさみ、5 mLシリンジ、18G針、注射器の廃棄、および粘着テープ)の撤退に必要な機器を配置します。
2. 70%エタノールで手術用はさみを拭くか、70%エタノールで拭いた後、オートクレーブを使用して滅菌します。
3. 今、重ねるために37°Cの卵インキュベーターから卵を取ります。
4. きれいな卵のラックの上に卵を置きます。
5. 小さな粘着テープ(サイズ:長さ約1インチ×幅)を卵の端に取り付けます。
6. 鋭利な尖ったエッジはさみを使用して、卵殻の端に小さな穴を作ります。5 mL のシリンジをおよそ 75° の角度で挿入します。
   注意:5 mLの注射器は24 G x 1針(無菌)が付属していますが、24 G x 1針を18 G x 1.5針(滅菌)に交換することは良いことです。18 G x 1.5針は幅1.25 x 38 mmです。したがって、アルブミンの除去を容易にする。
7. 卵黄嚢に針を挿入した後、アルブミンの5〜6 mLをゆっくりと引き出す。
   注:これは、それが成長することができるベッドを胚に提供します。アルブミンを撤回すると、ウィンドウを確立しながらアルブミンのオーバースピルを防ぐことができます。最後に、5-6 mLのアルブミンを排除することで、窓の間に胚が損傷するリスクを軽減します。
8. アルブミンを取り除いた後、粘着テープで開口部を再密封し、卵を残して37°Cで48時間インキュベートします。

4. 4日目

1. プロトコルのセクション 1 で説明されているように、リンガーの溶液、通常の生理液0.9%、PBS 1x を準備します。次に、3つのソリューションをオートクレーブします。オートクレーブ処理に続いて、それぞれの溶液を室温に置きます。
2. 37°Cの卵インキュベーターから卵を取り出し、殻を円形に切ります。卵殻を切る前に、粘着テープで切る部分を覆います。
   メモ:窓の領域を粘着テープで覆うと、卵殻が望ましくない場所に壊れないようにします。ただし、不要な場所に侵入した場合は、粘着テープでエリアを密封してください。粘着テープで切る場所を覆うと、殻片が黄身嚢に落ちるのを防ぎます。
3. 窓が望まれる場所に鋭く尖ったエッジはさみで卵殻に小さな穴を作成し、円形の開口部を切断し始めます。このプロセスはウィンドウと呼ばれます。
   注:円形カットは、任意の方向から胚に簡単にアクセスできるように十分な大きさであることを確認してください。必要に応じて、胚の位置に合わせて卵の位置を変更します。
4. 次に、ステレオズーム手術用顕微鏡を使用して、右ビテリン動脈(RVA)を見つける。
   注意:鶏の胚は通常、72時間の段階で頭の左側が黄身に対して起こるように、発達するにつれて胸部の胸部の胸部(子宮頸部屈曲などと共に)を受ける。より大胆には、ビテリン動脈が体を出るところでは、胚はあまりねじれず、体のこの部分は黄身に向かって腹側にある。だから、直接見て、胚の右は研究者の右側にあります。
5. RVA が配置されたら、26 G 針を使用して RVA の左側と右側に 2 つの小さな穴を作成します(図 2)。
6. ドップラー血流イメージングプローブをRVAの上に置きます。ドップラー血流イメージングプローブは、虚血部位からRVAの遠位端に向かって5±1mmに配置されていることを確認します。2分と30 s(または必要に応じて長く)のフラックスの読み取りを取ります。これは規範的な相の読み取りになります。
7. その間、鼻のペンチと歯付き鉗子を使用して、脊髄針の端をフックの形に手動で成形します(図3)。これは、脊髄の端を約1mm曲げて行います。サイズが大きいほど、I/R手順中に脊髄針を挿入したり取り外したりすることが難しくなります。
8. マイクロマニピュレーターを使用して、右のビテリン動脈のすぐ下に脊髄針を挿入します。
   注:RVAまたは隣接する動脈を損傷しないように細心の注意を払って脊髄針を挿入してください。最適な技術は、RVAホールの右側のすぐ上に脊髄針のカスタム設計されたフックを調整し、続いて右穴を通してステレオズーム手術顕微鏡の指導の下でマイクロマニピュレータの助けを借りて、徐々に脊髄のカスタム設計されたエッジを黄身嚢に挿入することです。脊髄針のフックが黄身嚢に入ったら、RVAの下のフックを徐々に調整して、その端が左穴の下に正確に配置されるようにします。今が脊髄針を持ち上げる時です。
9. さて、マイクロマニピュレーターの助けを借りて、ドップラー血流フラックスが動脈流量の最低80%の減少を示すまで徐々に動脈を持ち上げる。
10. ドップラーフラックスで80%以上のドロップダウンが達成されたら、脊髄の針を持ち上げて(動脈を上に引っ張る)5分間放置します。これはRVAにおける虚血の期間になります。
    注: 虚血の期間中にドップラーフラックスを監視することが重要です。かなりの変動が見つかった場合は、テストを終了します。
11. 5分の虚血期間の後、徐々に正常な血流レベルを回復するために動脈を解放する。ドップラー血流計の読み取り値は、ノルモキシア中に得られたものと同等の値を表示することを確認します。これはRVAにおける再灌流の期間になります(図4)。
12. I/R手順の後、1x PBSの数滴(2〜3)を胚に塗布し、2〜3分間監視します。
    注:1x PBSを使用すると、胚が乾燥するのを防ぐことができます。
13. 最後に、粘着テープで窓を再密封し、卵を卵インキュベーターに5時間55分間戻します。
14. 5時間と55分後に卵を卵インキュベーターから取り出し、卵ラックの上に置き、窓を開け直し、下流の処理プロトコルに従ってください。

5. 治療

1. 薬物、活性化剤、または阻害剤による動脈の治療のために、I/Rプロセスの1時間後にRVAを物品切りする。
2. 下流の研究では、まず胚を無菌90mmペトリ皿に置いて卵殻から取り除きます。
3. 胚がペトリ皿に放出されたら、ステレオズーム手術顕微鏡の指導の下で眼の虹彩を使用してRVAを切除する。
4. RVAの切除寸法が最大15±1mm(幹からの遠位)、動脈の左右に5±1mm、トランクに向かって2±1mmであることを確認します。
   注: ルーラーを使用して、切除する領域を測定できます (省略可能)。
5. RVAを切除した後、1x PBSを含む滅菌ペトリ皿で1x PBSで洗浄します。
6. 所望の処置のために、リンガーの溶液の500 μLで満たされた1.5 mL遠心分離管(殺菌)に動脈を置く。RVAを遠心分離管に入れ、37°Cインキュベーターに5時間55分間置きます。
   注:治療に応じて、何の治療もせずにRingerの溶液を使用するか、または薬物、アクチベーター、または阻害剤の所望の体積と濃度での治療を行ってください。
7. 5時間及び55分のインキュベーション後、37°Cの実験室インキュベーターからRVAを取り出し、所望の処置を進める。

Results

ドップラー血流イメージング技術は、当社のモデルの有効性を評価するために使用されました。つまり、コントロールグループのデータと RVA グループのデータを比較して、作成の成功を判断しました。 図4Aは 、制御動物に関連する代表的なフラックスを示し、 図4B はRVAから得られた結果を示している。数値 1 から 8 は、I/R フェーズに関連付けられたさまざまなイベントを表します。簡単に言えば、数値1-3はノルモキシアの相に対応し、点3および4での流束の急激な減少はRVAにおける血流の減少に関連する事象を表す。80%以上のドロップダウンが達成されると、RVAは次の5分間上昇したままでした。これは虚血の相(数値4-5)であった。RVAの5分の持ち上げの後、RVAは、数値6と7で表されるリリースされました。ポイント7以降のフラックスは、RVAが正常な血流レベルを達成した後に起こる再灌流期を表し、これは再灌流の段階であった。この特定の実験は、3日間開発されたひよこ胚におけるI/Rモデリングの有効性を実証した。

Discussion

虚血再灌流研究の目的は、細胞死を予防し、回復を促進する治療戦略を作成することです^29,30.I/R研究における現在の制約を克服するために、我々は信頼性の高い、再生可能なI/Rモデルを作り出すためにフックI/Rのひよこ胚モデルを設計した。私たちの知る限りでは、私たちの知る限りでは、ストレス信号(酸化ストレスや炎症ストレスなど)を研究する以外に、ルーチンI/R実験のために3日間のひよこ胚で作成された最初のI/ Rモデルです。開発³¹日目のサイズとアクセシビリティの利点を考えると、ひよこ胚は、モデルの高出力、採用の簡易性、およびルーチン分析³²の適応性のために、72時間の発達段階で使用された。簡単に言えば、発達3日目に、ovoひよこは、正常な生理学、疾患病理、および実験的治療の効果を視覚化するために使用することができる卵内の高度に制御され、まだアクセス可能で合理的に透明なモデルです。その巨大なサイズは、正常な生理学...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(-80°C;C)冷凍庫	ハイアール、中国	-
1.5mL遠心分離管	ターソンズ、インド	500010X100mm
シャーレ(滅菌)	ターソンズ、インド	460050
18G針(18G×1.5 (1.25×38mm)	Ramsons, India	13990
1mLシリンジ	DISPO VAN-26G
針 (26G×1/2 (10.45x13mm)	ディスポバン、インド	30722D
37°湿度調整可能なパーセンテージのCエッグインキュベータ	ーGentek、インド	GL-100
37°C ラボラトリーインキュベーター	SCIENCE TECH, India	CB 101-14
3-Methyladenine (3-MA)	Sigma Aldrich, USA	M9281
3mL Pasture Pipette	TARSONS, India	940050
50mL Beaker	TARSONS,	India-5mL
Syringe	DISPO VAN, India	IP53
70% ethanol	Merck Millipore, United States	64-17-5
粘着テープ/チェロテープ	Sunrise,	India-Ambra1
primers	Applied Biosystems, Foster city, USA	Hs00387943_m1
Anti-mouse IgG	Cell Signaling Technology, USA	7076S
Anti-Rabbit IgG	Jackson Immuno Research Laboratories, USA	711-035-152
Atg7	R&D Systems, USA	MAB6608
Atg7 primers	Applied Biosystems, Foster city, USA	Hs00893766_m1
Autoclave Bag	Tarsons, India	550022
Autoclave Machine	Local made, Lucknow,
	Proteintech, USA	66665-1-Ig
Beta Actin	ImmunoTag, USA	ITT07018
ウシ血清アルブミンハイ	メディア、ムンバイ、インド	TC194
塩化カルシウム	ヒメディア、ムンバイ、インド	GRM534
カタラーゼ	イムノタグ、アメリカ	ITT5155
クリーニングワイプ	キンバリークラーク、インド	370080
Cleaved Caspase3	ImmunoTag、アメリカ	ITT07022
ジナトリウムリン酸水素七水和物	Himedia, Mumbai, India	GRM39611
Doppler blood flowmeter	Moors instrument, United Kingdom	moorVMS-LDF1
Egg rack	-	-
GAPDH	ImmunoTag, USA	M1000110
GAPDH primers	Applied Biosystems, Foster city, USA
Glycine Himedia	, Mumbai, India	MB013
Kidney tray	HOSPITO-LC3A
/B	Cell Signaling Technology, USA	4108S
Methanol	Rankem laboratories, Mumbai, India	M0252
Micromanipulator	成茂, 日本	M-152
N-アセチル-L-システイン(NAC)	Sigma Aldrich, USA	A7250
Naringenin	Sigma Aldrich, USA	67604-48-2
NF-kβ	サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国	51-0500
NLRP3	ImmunoTag、米国	ITT07438
ノーズプライヤー	ローカル製、ラクナウ、インド	-
眼鉗子	Stoelting、ドイツ	52106-40
眼虹彩	Tufft 手術器具、ジャイプール、インド	ハードエイジ Vannas マイクロはさみ 角度付き 8CM / 3 1/8"
OHPマーカーペン	Camlin,
	ImmunoTag, USA	ITT08329
Pointed sharp edge scissor	Stoelting, Germany	52132-11
Potassium Chloride	Himedia, Mumbai, India	MB043
Potassium phosphate monobasic anhydrous	Himedia, Mumbai, India	MB050
Protease Inhibitor	Abcam, United States	Ab65621
SOD-1	ImmunoTag, USA	ITT4364
Sodium Chloride	Fisher Scientific, Mumbai, India	27605
Sodium dodecyl sulphate	Himedia, Mumbai, India	GRM886
Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm)	Ramson, India	GS-2029
ステレオズーム手術用顕微鏡	オリンパス、日本	SZ2-STU3
シリンジディスカード	BIOHAZARD	882210
歯付き鉗子	Stoelting、ドイツ	52102-30
Tris Base	G Biosciences、米国	RC1217
Tris Hydrochloric Acid	Himedia、ムンバイ、インド	MB030
Tween 20	G Biosciences、米国	RC1227
ホワイトレグホーンチキン0日卵	-	-
Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK	MP Biomedicals、LLC、アメリカ	FK009