フォトスタチンを用いた生きた着床前マウス胚における微小管細胞骨格の時空間的細胞内操作

サマリー

基礎研究および応用研究で広く使用されている典型的な微小管阻害剤は、細胞に広範な影響を及ぼします。最近、フォトスタチンは、微小管の瞬間的、可逆的、時空間的に正確な操作が可能な光スイッチ可能な微小管阻害剤のクラスとして登場した。この段階的なプロトコルは、3Dライブ着床前マウス胚におけるフォトスタチンの適用を詳述する。

要約

微小管細胞骨格は、細胞のフレームワークを形成し、細胞内輸送、細胞分裂、およびシグナル伝達の基本である。例えば、ノコダゾールを用いたユビキタス微小管ネットワークの伝統的な薬理学的破壊は、あらゆる細胞に壊滅的な結果をもたらす可能性がある。可逆的に光交換可能な微小管阻害剤は、薬物効果を時空間的に制御された方法で実施することを可能にすることによって、限界を克服する可能性を秘めている。そのような薬物ファミリーの1つは、アゾベンゼンベースのフォトスタチン(PST)である。これらの化合物は暗所条件下では不活性であり、UV光で照明すると、β-チューブリンのコルヒチン結合部位に結合し、微小管重合および動的ターンオーバーを遮断する。ここで、3次元(3D)ライブ着床前マウス胚におけるPSTの適用は、細胞内レベルで微小管ネットワークを破壊するように設定されている。このプロトコルは、実験セットアップの手順、および生細胞共焦点顕微鏡を使用したPSTの光活性化および不活性化パラメータを提供します。これにより、再現性が確保され、他の人がこの手順を研究課題に適用できるようになります。PSTのような革新的なフォトスイッチは、動的な細胞内微小管ネットワークの理解を促進し、リアルタイムで細胞骨格を非侵襲的に操作するための強力なツールとして進化する可能性があります。さらに、PSTは、オルガノイド、ブラストイド、または他の種の胚などの他の3D構造において有用であることが証明され得る。

概要

微小管アーキテクチャは、多様な機能をサポートするために、異なる細胞タイプ間で大きく異なる^1,2。成長と収縮のそのダイナミックな性質は、細胞外および細胞内の手がかりへの迅速な適応を可能にし、細胞の絶え間なく変化するニーズに応えることを可能にする。したがって、それは細胞の同一性において重要な役割を果たす「形態学的指紋」と考えることができる。

小分子阻害剤を用いた微小管細胞骨格の薬理学的標的化は、発生生物学、幹細胞生物学、癌生物学、および神経生物学³、⁴、⁵、⁶、⁷における多数の基本的な発見をもたらしている。このアプローチは、不可欠ではありますが、毒性やオフターゲット効果など、さまざまな限界があります。例えば、最も広く使用されている微小管標的化剤の1つであるノコダゾールは、強力な微小管脱重合剤⁸である。しかしながら、ノコダゾールのような小分子阻害剤は、適用時から活性であり、微小管細胞骨格が多くの重要な細胞機能に必須の性質を有することを考えると、微小管のグローバルな解重合はオフターゲット効果を生じる可能性があり、これは多くの用途には適さない可能性がある。さらに、ノコダゾール処理は、サンプルを薬物なしで洗浄しない限り不可逆的であり、連続的なライブイメージング、したがって個々の微小管フィラメントの正確な追跡を妨げる。

光活性化化合物の開発は、光アンケージド分子の創製から始まり、微小管成長阻害の影響を正確かつ時空間的に制御された方法で標的化およびモニタリングする新しい時代を告げた。可逆的に光交換可能な薬物の1つのファミリーであるフォトスタチン(PST)は、コンブレタスタチンA-4のスチルベン成分をアゾベンゼン⁹で置き換えることによって開発された。PSTはUV光による照明まで不活性であり、それによって不活性 トランス配置は可逆的異性化によって活性 シス配置に変換される。 Cis-PSTsは、β-チューブリンのコルヒチン結合部位に結合し、β-チューブリンとの界面を遮断し、微小管増殖に必要な二量体化を防止することによって微小管重合を阻害する¹⁰。PSTのコホートの中で、PST-1Pは、最も高い効力を有し、完全に水溶性であり、照明後に生理活性の急速な発症を示すため、鉛化合物として浮上している。

PSTの最も効果的な トランスから シス異性化は、360〜420nmの波長で起こり、PST活性化のための二重オプションを可能にする。典型的な共焦点顕微鏡上の405nmレーザーラインを投与して、微小管成長阻害の最適な空間ターゲティングを行うことができる。405nmレーザー照射によるPST活性化の位置とタイミングを正確に特定する機能は、正確な時間的および空間的制御を容易にし、1秒未満の応答時間内に細胞内レベルで微小管ダイナミクスの破壊を可能にします⁹。あるいは、手頃な価格のLED UV光は、生物全体の照明が微小管アーキテクチャの生物全体の破壊を誘発することを可能にする。これは、空間的ターゲティングではなく、正確にタイミングを合わせた阻害の開始が目標である研究者にとって、費用対効果の高い代替手段となる可能性があります。PSTのもう1つの特徴は、510〜540nmの範囲の波長の緑色光を印加することによってオンデマンドで不活性化^{されることです9}。これにより、PST媒介性増殖阻害の前、最中、および後の微小管フィラメントのトレースが可能になります。

PSTsは、まだ比較的最近の設計ではあるが、アメーバイド¹²、新生児マウス13の脳から単離されたニューロンにおける細胞遊走の新しいメカニズムの調査、ショウジョウバエメラノガ^スター14における翼上皮の発生の調査を含む、多様な研究分野^にわたる多数のin vitroアプリケーション¹¹で使用されてきた。.他の光反応性薬物は、細胞機能の標的破壊において貴重なツールであることが証明されている。例えば、ブレビスタチンの類似体であるアジドブレビスタチンを、照明下でのミオシン阻害の増強に使用した^15、16。これは、細胞機能の時空間的に制御された阻害の能力による新しい発見の可能性を強調している。

生きた3D生物は、生理学的条件下で動物全体、単一細胞、または細胞内レベルで微小管のダイナミクスを操作するための、優れた、より繊細なシステムを提示します。特に、着床前マウス胚は、細胞の内部の働きならびに生物内の細胞間関係についての例外的な洞察を提供する¹⁷。PSTの活性化および不活性化の時間的および空間的に標的化された連続的なサイクルは、着床前マウス胚¹⁶における非中心染色体微小管組織化中心としての、細胞間の細胞間運動学的構造である相間架橋の特性評価に寄与した。同様の実験セットアップは、胚盤胞形成を可能にするためにマウス胚のシーリングにおける微小管の成長の関与を実証し^た18。さらに、PSTsは、後脳内の細胞のサブセットにおける微小管増殖を阻害することによって神経細胞遊走を調べるために、ゼブラフィッシュ胚全体においても使用された¹⁹。

このプロトコルは、着床前マウス胚におけるPST-1Pの実験セットアップおよび使用を記載する。ここで提示された指示はまた、染色体の分離および細胞分裂の研究、細胞内貨物の輸送、ならびに細胞の形態形成および遊走の研究など、幅広い目的のためのPSTの適用を導くことができる。さらに、このような研究は、オルガノイド系、芽球状、および Caenorhabditis elegans および Xenopus laevisなどの他の胚モデルにおけるPSTの実装を支援し、 体外 受精技術のためのPSTの使用を拡大する可能性がある。

プロトコル

実験は、モナッシュ動物倫理委員会によって動物倫理番号19143の下で承認された。動物は、動物施設(モナッシュ動物研究プラットフォーム)の特定の病原体のない動物ハウス条件で、倫理ガイドラインに厳密に従って飼育された。

1. 着床前マウス胚採取

1. スーパー排卵および交配マウスは、先に記載したように¹⁶、¹⁸、制度的動物倫理ガイドラインに準拠している。
   注:生きた胚採取に最も一般的に使用される株は、C57BL/6またはFVB/Nマウスである。ここに示したすべてのデータは、FVB/Nマウスを用いて生成した。
2. 交配後の朝に、²⁰に記載のM2培地、またはヒト管液(HTF)培地を用いて卵管から接合体をフラッシュする。²¹、²²に記載されるような口内ピペット装置を用いて、接合体を新鮮な単純カリウム最適化培地(KSOM)液滴に移し、37°Cに予温し、5%_CO2に平衡化し、35mm培養皿中で^、培地被覆率を確実にするために十分な量の鉱物油を重ね合わせた。
3. ²⁰に記載のように接合体を赤色蛍光タグ付き微小管プラス末端マーカーをコードするcRNAと共にマイクロインジェクションする。ここで、エンドバインディングタンパク質3(EB3)-dTomatoのcRNAは、¹⁶、¹⁸記載のように調製・精製し、マイクロインジェクションバッファーで希釈した後^、30ng/μL濃度で使用した。
   注:cRNAは事前に準備し、必要になるまで-20°Cで保存することをお勧めします。
4. 胚をPST−1P処理のための所望の発生段階に達するまで37°Cおよび5%_CO2 で暗所で培養する。
   注:異なる胚期に必要な培養時間の包括的なリソースについては、²³を参照してください。ここで用いた16細胞期胚については、受精後の胚3日目(E3)まで培養する。

2. 薬物およびイメージング皿の準備

メモ: 手順 2.1-2.10 では、意図しない PST-1P アクティベーションを回避するために、暗い場所または赤色の明るい条件下でのみ作業してください。アルミホイルまたはダークカバーは、PSTを含むすべてのチューブや皿に使用する必要があります。

1. 超純水中に濃度50mM PST-1Pのストックを調製する。
   注:PST-1Pの分子量は440 g /モルです。原液は-20°Cで最大1年間安定しています。PST-1Pは水または水性緩衝液に可溶であるが、DMSOでは容易に溶解しない。
2. ステップ2.1から、超純水中で800μM PST-1Pの中間作用濃度を準備する。
3. PST-1Pを新鮮なKSOMで終濃度40μMに希釈する。典型的な実験では、約20 μLのPST-1P処理KSOMが必要であり、19 μLのKSOMで800 μM PST-1Pの1 μLを希釈し、最終容量を20 μLにし、視認性のために赤色光のみを使用して、十分な培地が事前に調製されるようにする。
   注:PST-1P希釈液の濃度と活性化状態の両方は、アッセイの確立中に行うべき分光光度計を使用してUV-Vis吸光度スペクトルを撮影することによって確認することができます。1 cmキュベット中の完全トランス40μM希釈液の_{380nm(A 380})での吸光度は約0.8であるべきである。シス体およびトランス体の両方が、455nmで同じ吸光度を有する(_A455)。_A380と_A455との比がおよそ9:1のとき、希釈は不活性(完全トランス)である。比A₃₈₀:A₄₅₅が1:2である場合、希釈は完全に活性化される(完全にシス)。中間比率は、アクティブ化の中間状態を反映します。
4. ライブイメージング用のチャンバースライドを準備するために、PST-1P処理KSOMを1つのウェルの中央に10μLピペットし、半球状の液滴を形成した(図1A)。
5. 液滴を覆うのに十分な鉱物油を静かに加え、媒体を分散させないようにします。これにより、液滴が蒸発しないようにします。
6. チャンバースライド皿を37°Cおよび5%_CO2のインキュベーター内で予め温め、_CO2 平衡化して最低3時間、または最大で一晩平衡化する。
7. ステップ2.6の平衡化期間の終わりに、洗浄ステップとしてPST-1P処理、予温、平衡化KSOMの10μL液滴を含む35mm培養皿を準備する。油で覆い隠さないでください。
8. ステップ2.7からPST-1P処理KSOM液滴に口ピペッティングによって胚を移入する。
   注:ステップ2.7および2.8は、胚の口ピペッティングに推奨されますが、オプションです。
9. ステップ2.4〜2.6で調製した画像化チャンバスライド内のPST−1P処理KSOM液滴の中心に口ピペッティングによって胚を直ちに移入する(図1A)。
10. 画像化前に、胚を37°CおよびPST-1P処理KSOM中の5%_CO2 で画像化チャンバスライド中で少なくとも1時間インキュベートする。可能であれば、チャンバースライドを37°Cおよび5%_CO2 の環境チャンバー内の顕微鏡に取り付け、完全な暗闇の中で、すべてのPST-1Pが不活性 トランス構成にあり、胚が皿の底に沈む可能性があることを確認します。

3.ライブイメージングとPST-1P光活性化

注:ステップ3.1-3.13は、アバランシェフォトダイオード検出器(APD)と暗い環境チャンバを備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡で実行されます。これらの手順は、 材料表に記載されている集録ソフトウェアを使用したイメージング設定に特に言及しています。しかし、それらはまた、他の共焦点顕微鏡システムに適用することができる。

1. 63x/1.2 NA水油浸漬対物レンズを所定の浸漬媒体で準備します。
2. 誘導位置決めに赤色光トーチを用いて、浸漬媒体に接触するように対物レンズを前進させる。この段階では、胚を見つけるために白色または明視野光を使用することは、PST-1Pを早急に活性化する可能性があるため、避けてください。
3. 接眼レンズを使用し、赤色光照明の下で、媒体の液滴の端を見つけて、この位置の上に対物レンズを直接配置する。これは、ユーザーが方向を確立し、焦点面を見つけるのを助けることができる。
4. 次に、接眼レンズを介して、またはソフトウェア対応のライブモードスキャンで、赤色波長フィルターまたは561nmレーザーを使用して、液滴内の胚を見つけます。
5. ステージコントローラとライブスキャンモードを使用して、胚全体のzスタックを取得するための開始点と終了点を設定します。
6. レーザー出力設定(通常、APDなどの高感度検出器では561nmのレーザー出力で5%未満で十分です)、デジタルオフセット(通常は-0.900)を調整してEB3-dTomato彗星の外観を最適化し、バックグラウンドノイズ、2μmのピンホール、512 x 512のピクセル解像度、3.15μsのピクセルドウェル時間を最小限に抑えます。
7. 1μmのセクション間隔で胚全体のzスタックを取得し、生物全体の微小管成長領域を評価します(図1B)。
8. 手順 3.7 の 3D Z スタック画像を使用して、EB3-dTomato トラッキング実験の関心領域 (ROI) を特定します。ズームを 3 倍に増やし、関心のある特定の細胞内領域の周りに長方形の ROI を描画します。
9. イメージングパラメータの典型的な値を使用して、単一のz平面のタイムラプスムービーを取得します:561nmレーザーパワー5%、デジタルオフセット-0.900、ピクセル解像度512 x 512、ピンホール3μm、ピクセルドウェル時間3.15μs、ズーム3x、時間間隔500ms。
   注:120の時間枠は1分のトラッキングムービーを提供し、データ分析には十分です。蛍光色素分子の漂白が最小限であれば、集録はさらに長く続けることができます(図1C)。
10. PST-1Pをアクティブにするには、405 nmレーザーに切り替えて、405 nmレーザーを10%パワーに設定し、ピクセル解像度を512 x 512、ピンホールを最大に開き、ピクセルドウェル時間を3.15 μs、ズーム3倍、時間間隔500 ms、合計20フレームに設定して、別のタイムラプスムービーを取得します(図1D)。
11. 561nmレーザーに切り替え、ステップ3.9のように取得を繰り返して、PST-1Pの活性化後にEB3-dTomato彗星が失われることを確認します(図1E)。この取得がアクティブ化後、できるだけ早く行われるようにします。
    注:ステップ3.10は、EB3-dトマト彗星のより長い阻害のために繰り返し行うことができる。しかし、胚はUV光によって引き起こされる害を避けるために慎重に監視されなければならない。
12. PST-1Pを非アクティブな トランスステートに戻すには、514nmレーザーを10%のパワーで照射します。514 nmレーザーを10%のパワーに設定し、ピクセル解像度を512 x 512、ピンホールを最大に開き、ピクセルドウェル時間を3.15 μs、ズーム3倍、時間間隔500 ms、合計20時間フレームに設定したタイムラプスムービーを取得します(図1F)。
13. ステップ3.11を繰り返して、EB3-dトマト彗星の回収率を可視化します(図1G)。

4. 画像データ解析

1. PSTによる微小管重合の阻害を分析および定量するには、研究者が特定のニーズに合わせて利用できるソフトウェアプログラムを使用してください。使用を推奨するものは、EB3-dTomato彗星^16,18の動き、方向、速度を手動または自動で追跡できる追跡ツール^{を備えています}。

図1:生きた3D着床前マウス胚におけるPST-1P光活性化および失活の概略図。 すべての実験は、完全な暗闇(黒い背景)で、または赤色光照明によってのみ行われます。(a)EB3-dTomatoを発現する生着床前マウス胚を16細胞期まで培養した後、イメージングチャンバースライド中の40μM PST-1Pを含むKSOMの液滴に移す。(B)胚全体の3D画像は、EB3-dトマト彗星の分布を可視化することによって微小管の成長の評価を可能にする。(c)実験を開始するために、EB3-dTomato彗星をタイムラプスイメージングを用いて細胞内領域で追跡する。(d)405nmレーザーを用いた同じ細胞内領域におけるその後のPST−1P光活性化は、EB3−dトマト彗星の損失をもたらす(E)。強化されたPST-1P活性化は、必要に応じて、逐次的な405nm光照明によって実施することができる。(エフ-ジー)PST-1Pを逆にして非アクティブな状態に戻し、EB3-dトマト彗星を回復させるために、514nmレーザーを同じ細胞内領域に照射する。必要に応じて、光活性化および非活性化の複数回のラウンドを行うことができる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

結果

プロトコールに沿って、着床前マウス胚に、赤色蛍光dトマト(EB3−dTomato)でタグ付けされたEB3用のcRNAをマイクロインジェクションした。これにより、EB3が重合する微小管プラス末端²⁴に結合するにつれて、成長する微小管の視覚化が可能になります。

実験は、マウス胚が16個の細胞からなる受精(E3)の3日後に行った。他の移植前発達段階は、調査される科学的質問に応じて使用することができる。405nmレーザー光活性化プロトコルを用いて最小限のフォトブリーチングを実証するために、未処理の胚を用いた対照実験が示されている(図2A i)。印象的なEB3-dトマト密度を有するROIは、取得した胚の3D画像に基づいて選択される。この例では、EB3-dTomato の高解像度イメージングにセル全体の単一の z 平面が使用されています。しかしながら、胚の異なる領域は、必要に応じて選択することができる(例えば、皮質領域、核周囲領域、有糸分裂細胞、内細胞ま...

ディスカッション

微小管ネットワークは、細胞の基本的な内部動作に不可欠です。その結果、ネットワークへのいかなる摂動も細胞機能のあらゆる側面に広範な結果をもたらす傾向があるため、これは生物における微小管ダイナミクスを操作する上で課題を提示する。光スイッチ可能な微小管標的化合物の出現は、微小管増殖阻害の誘導および逆転に対する優れた制御を用いて、細胞内レベルで細胞骨格を正確に操作する方法を提示する⁹。このプロトコルは、光活性化PST-1Pによって着床前マウス胚において、細胞内スケールで、かつ時間的に正確な方法で微小管重合を阻害する方法を実証する。さらに、この阻害を逆転させて、微小管ネットワークの短期的な摂動の調査を可能にすることができる。

提示されたプロトコルは、生着床前マウス胚へのPSTの適用に最適化されており、それらの使用を他の様々な培養系に拡大するための基礎として使用することができる。PST の新規ユーザーは、アプリケーション内でトラブルシューティングが必要ないくつかのポイントに遭遇する可能性があり、そのためにいくつかの問題解決手順が提示されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
吸引器チューブ	Sigma-Aldrich	A5177	口内吸引装置用
チャンバースライド - LabTek	サーモフィッシャーサイエンティフィック
cRNAコード	N/A	N/A メーカー	の指示に従って調製 mMessage in vitro 転写キット
培養皿 - 35mm	サーモフィッシャーサイエンティフィック	150560
ヒト絨毛性成長ホルモン	Sigma-Aldrich	C8554
ヒト卵管液 (HTF) 培地	Cosmo-Bio	CSR-R-B071
イマリス 画像解析ソフトウェア	ビットプレーン
イマージョン オイル W 2010	カール ツァイス	444969-0000-000	顕微鏡液浸対物レンズ
用 LED トーチ - 赤色光	Celestron	93588
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167
マウス - 野生型 FVB/N、オスとメス	N/A	/A	メス 8-9 週齢。生後2〜6ヶ月のオス。
マイクロキャピラリーピペット - Kimble	Sigma-Aldrich	Z543306	口内吸引装置用
マイクロインジェクションバッファー	N/A	N/A	5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4
鉱物油	Origio	ART-4008-5P
mMessage In vitro 転写キット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	AM1340
NanoDrop分光光度計	Thermo Fisher Scientific
Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium	Cosmo-Bio	CSR-R-B074
妊娠中の牝馬血清ゴナドトロピン	Prospec Bio	HOR-272
PST-1P	N/A	N/A	Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. <>Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).
RNA精製キット	サンゴン	B511361-0100
超純水	Sigma-Aldrich	W1503
ZEN ブラックソフトウェア	カールツァイス