免疫不全マウスへのCBir1 TCRトランスジェニックCD4+ T細胞の養子移入による腸管炎症の誘導

サマリー

このプロトコールでは、腸内微生物叢抗原特異的T細胞養子移入大腸炎モデルが記載されている。CD4⁺ T細胞は、CBir1 TCRトランスジェニックマウスから単離される。これらは免疫優性腸内微生物叢抗原CBir1フラジェリンに特異的であり、これはレシピエントRag1-^/-マウスに移され、腸の炎症を引き起こす。

要約

発生率の増加に伴い、胃腸管に影響を及ぼす慢性疾患である炎症性腸疾患(IBD)は、個人および社会にかなりの健康および財政的負担を課す。したがって、IBDの病因および発症の根底にあるメカニズムを調査することが重要である。ここでは、腸内微生物叢抗原特異的T細胞導入大腸炎モデルについて説明する。CBir1フラジェリンは、実験的大腸炎およびクローン病患者において免疫優性腸内細菌抗原として認識されている。CBir1フラジェリンに特異的なCBir1 TCRトランスジェニックnaϊve CD4⁺ T細胞は、免疫欠損Rag1-^/-マウスへの養子移入後に慢性大腸炎を誘導し得る。疾患の重症度は、組織病理学によって評価される。結腸粘膜固有層におけるCD4⁺ T細胞表現型も決定される。このモデルはIBDの開発によく似ており、IBDの病因を駆動するメカニズムを調査し、IBDを治療するための潜在的な薬物を試験するための理想的なマウスモデルを提供する。

概要

主にクローン病(CD)や潰瘍性大腸炎(UC)を含む炎症性腸疾患(IBD)は、胃腸管の慢性的な再発寛解型炎症を特徴とし、世界中の何百万人もの人々に影響を及ぼしています¹。IBDの発症と病因には、遺伝的感受性、腸内微生物叢、免疫応答、食事、ライフスタイルなど、いくつかの要因が関与しています²。しかしながら、IBDの正確なメカニズムはまだ完全には理解されていない。

特に興味深いのは、腸の炎症を調節する際の腸内微生物叢と宿主免疫応答との相互作用^です3。腸内微生物叢は一連の免疫刺激分子と抗原を提供し、免疫応答を活性化することができます⁴。エフェクターT細胞と制御性T細胞(Tregs)のバランスは腸の恒常性を維持する上で重要ですが、腸内微生物叢抗原に対する過剰な腸粘膜CD4⁺ T細胞応答は腸の炎症に寄与します^5,6,7。免疫優性腸内微生物叢抗原として、CBir1フラジェリンはヒト^CD8,9の病因に関連している。さらに、CBir1 TCRトランスジェニック(Tg)T細胞の転写は、ヒトIBDによく似た免疫欠損マウス⁶において腸の炎症を誘発し、このT細胞導入モデルがヒトIBDのメカニズムの調査に役立つことを示している。

この研究は、CBir1 TCR Tg naϊve CD4⁺ T細胞の養子移入によってRag1-^/-マウスに大腸炎を誘導し、疾患の重症度を評価する詳細なプロトコールを記載している。さらに、予想される結果が示され、手順とトラブルシューティングの重要なステップが議論され、研究者が腸の炎症の病因のメカニズムを調査し、IBDを治療するための潜在的な薬物をテストするのに役立ちます。

プロトコル

すべての動物の処置は、テキサス大学医学部の動物の使用と世話に関する委員会に従って実施された。CBir1 TCR Tgマウスは、アラバマ大学バーミンガム校のチャールズ・エルソン博士によって提供された。CBir1 TCR Tgマウスは、雌または雄であり得るが、8〜12週でなければならない。C57BL/6バックグラウンドのRag1^-/-マウスをジャクソン研究所から入手した¹⁰。Rag1-^/-マウスは性別と年齢が一致していなければならず、雄または雌のいずれかを使用できますが、8〜12週でなければなりません。プロトコル全体を図 1 にまとめます。

レシピエントマウスの作製

1. C57BL/6バックグラウンドでRag1-^/-マウスを準備し、同じ特定の病原体を含まない動物施設で飼育する。検出力分析¹¹により1群あたりのマウス数を算出する。
   注: Rag1^-/- マウスには成熟T細胞およびB細胞がありません¹⁰。
2. 耳パンチでマウスにマークを付けます。
3. T細胞導入の同じ日にマウスを秤量する。

2. 試薬および溶液の調製

注:使用される試薬は有毒またはバイオハザードであり、その取り扱いには予防措置と安全対策が必要です。

1. 洗浄バッファーの調製:5 mL の 100x ペニシリン-ストレプトマイシンを 500 mL の RPMI 1640 培地に加えます。よく混ぜて4°Cで保存します。
2. トリス-_NH4Cl溶解バッファーを調製する。
   1. 溶液パートAを調製し、2.06gのトリス塩基を100mLの二重蒸留水(_ddH2O)に溶解し、HClでpH値を7.2に調整する。
   2. 溶液パートBを調製し、7.47gの_NH4Clを800mLの_ddH2Oに溶解する。
   3. AとBを徹底的に混ぜる。pHを測定し、そうでない場合は7.2に調整します。
   4. 総容量を1000mLに調整します。オートクレーブ、4°Cで保存した。
3. 分離バッファーを準備します。
   1. 2.5 g の BSA および 500 μL の EDTA (0.5 M、pH 8.0) を 500 mL の 1x PBS に加えます。それを徹底的に混ぜる。
   2. 0.22 μmの真空駆動使い捨てボトルトップフィルターで溶液をろ過します( 材料表を参照)。4°Cで保存してください。
4. FACS バッファを準備します。1 mL の FBS および 50 μL の EDTA (0.5 M、pH 8.0) を 50 mL の洗浄バッファー (ステップ 2.1 で調製) に加えます。よく混ぜて4°Cで保存します。
5. 完全なメディアを準備します。45mLの洗浄バッファーに5mLのFBSを加える。よく混ぜて4°Cで保存します。
6. EDTA-PBS バッファーを準備します。
   1. 必要な EDTA-PBS バッファーのボリュームを計算します。ボリューム (mL) = マウス数 x 20。
   2. PBSに適切な量のFBS、EDTA、およびHEPESを追加します(FBSの2%、EDTAの0.5mM、PBS内のHEPESの10mM)( 材料表を参照)。
   3. それを十分に混合し、37°Cの水浴中で予め温める。
7. 消化バッファーを準備します。
   1. 必要な消化バッファーの量を計算します。ボリューム (mL) = マウス数 x 10。
   2. 適切な量のFBS、コラゲナーゼIV、およびDNase Iを洗浄バッファー(FBSの2%、コラゲナーゼIVの0.5mg/mL、および洗浄バッファー中のDNase Iの10U/mL)に加える( 材料表を参照)。
   3. それを十分に混合し、37°Cの水浴中で予め温める。
8. Percoll ソリューションを準備します。
   1. 100%パーコールを準備します。45 mL のオリジナル Percoll に 5 mL の 10x PBS を加えます ( 材料表を参照)。
   2. 洗浄バッファーに2%FBSを調製する。49 mL の洗浄バッファーに 1 mL の FBS を加えます。
   3. 40%パーコール溶液および75%パーコール溶液の体積をコーキュレーションする。40%パーコール溶液の体積(mL)=マウス数×4;75%パーコール溶液の体積(mL)=マウス数×2。
      注:ステップ2.1〜2.5で調製された試薬/溶液はステップ3〜4で使用され、ステップ2.6〜2.8で調製された試薬/溶液はステップ9で使用される。ステップ9で使用するすべての試薬/溶液は、新たに調製する必要があります。すべての手順で 5% のバッファを追加することをお勧めします。

3. 脾臓CBir1 TCR Tg CD4⁺ T細胞の単離

1. CBir1 TCR Tgマウス/マウスを_CO2 安楽死を伴う子宮頸部脱臼(30%〜70%のガス空気置換率)によって安楽死させる。マウスを70%エタノールで濡らす。
2. 約1cmの左腹部切開を行い、皮膚を腹筋組織から引き離し、腹筋組織に約3cmの切開を行い、滅菌ハサミおよび鉗子で脾臓を除去する。脾臓を、5mLの予め冷冷洗浄緩衝液(ステップ2.1で調製)を含む培養皿に入れる。
3. 2つの滅菌スライドガラスの粗い表面で脾臓を粉砕する。細胞懸濁液を100μmのセルストレーナーに通すことによって50mL遠沈管に移す( 材料表を参照)。スライドガラスと培養皿を5mLの冷間洗浄バッファーですすぎ、洗浄バッファーをチューブに移します。
4. 細胞懸濁液を350 x gで4°Cで8分間遠心分離する。 上清を捨て、脾臓あたり5mLの予め加温したTris-NH4Cl溶解バッファー(ステップ2.2で調製)で細胞を再懸濁する。室温で10分間インキュベートする。10 mL の予備冷洗浄バッファーをチューブに加えます。
5. 細胞懸濁液を350 x g で4°Cで8分間遠心分離する。 上清を捨て、10 mL の冷間単離バッファー (ステップ 2.3 で調製) で細胞を再懸濁します。
6. セルを数えます。10 μLの細胞懸濁液と10 μLのトリパンブルーを徹底的に混合する。混合物10 μLをスライドにロードし、スライドを自動セルカウンター( 材料表を参照)に挿入し、生細胞番号¹²を取得します。
   注:このステップでは、1匹のドナーマウスから約1 x ¹⁰⁸ 個の細胞を得ることができます。
7. ステップ3.6から残った細胞懸濁液を350 x g で4°Cで8分間遠心分離する。 すべての上清を捨てる。
8. 抗マウスCD4磁性粒子を徹底的に渦巻き(材料表を参照)、107細胞あたり50μLの粒子を直接添加し、細胞ペレットと十分に混合する。4°Cで30分間インキュベートする。
   注:他の市販のCD4⁺ T細胞濃縮キットをここで使用することができます。
9. 細胞粒子懸濁液を滅菌回収チューブに移す。3.5 mL の冷間分離前バッファーをチューブに加えます。
10. チューブを細胞分離マグネット( 材料表を参照)に室温で8分間置きます。3 mLのトランスファーピペットを使用して上清を慎重に吸引します。
11. チューブを細胞分離マグネットから取り出し( 材料表を参照)、3.5mLの冷間分離バッファーでセルを再懸濁し、チューブをマグネットに室温で4分間置きます。3 mLのトランスファーピペットを使用して上清を慎重に吸引します。
12. 手順 3.11 を繰り返します。
13. 細胞を1 mLのプレコールドFACSバッファー(ステップ2.4で調製)で再懸濁する。

4. CBir1 TCR Tg naϊve CD4⁺ T細胞の精製

1. 手順 3.6 に従ってセルを数えます。
2. 細胞濃度が>¹⁰⁷/mLの場合は、FACSバッファーを大量に追加して、細胞濃度が¹⁰⁷/mL≤ことを確認します。
   注:〜1×¹⁰⁷ 個の細胞を、このステップで1匹のドナーマウスから得ることができる。
3. 表面マーカーを10 μLの抗マウスCD4-APC、10 μLの抗マウスCD25-Percp/Cy5.5、および10 μLの抗マウスCD62L-PE13,14で染色する(材料表を参照)。穏やかに混合し、暗所で4°Cで30分間インキュベートする。
4. 2 mL の予備冷 FACS バッファーで細胞を洗浄します。細胞懸濁液を350 x g で4°Cで8分間遠心分離する。 3 mLのトランスファーピペットを使用してすべての上清を吸引します。
5. 手順 4.4 を繰り返します。
6. 細胞を40 x ¹⁰⁶/mLの濃度に予め冷したFACS緩衝液に再懸濁する。
   メモ: ソーターの目詰まりを防ぐため、セルを 70 μm のストレーナーに通します。
7. 0.1 μg/mL の DAPI を加える。
   注: DAPI は、デッド セルを除外するために使用されます。
8. 選別した細胞を回収するために、4 mLの完全培地(ステップ2.5で調製)を含む15 mL遠沈管を準備する。
9. セルをソーターにロードします。単一生存可能なnaϊve CD4+ T細胞(DAPI−CD4+ CD25⁻CD62L⁺細胞)を純度モードで選別する(ノズルサイズ:70μm;圧力: 70 PSI;イベントレート: 8000-12000 イベント/秒;効率:90%以上(図2)。
   注:Naϊve CD4⁺ T細胞はCD62Lの高発現を発現し、活性化マーカーCD2513,14を欠い^ている。
10. 細胞懸濁液を350 x g で4°Cで8分間遠心分離する。 3 mLのトランスファーピペットを使用してすべての上清を吸引します。
11. 細胞を500 μLの1x PBSに再懸濁する。
12. 手順 3.6 に従ってセルをカウントする
    注:〜5×^106個の 細胞を、このステップで1匹のドナーマウスから得ることができる。

5. レシピエントマウスへの細胞導入

1. 1x PBSを加えてCBir1 TCR Tg naϊve CD4⁺ T細胞を5 x ¹⁰⁶/mL濃度に再懸濁する。
2. Rag-^/-マウスをヒートランプ(材料表を参照)の下で4分間温め、マウス拘束器を用いてマウスを拘束する。
3. 1mLインスリン注射器(27G)を用いて、200μLの細胞懸濁液をRag-^/-マウスの尾静脈に静脈内移入する(材料表を参照)。
   注:1匹のドナーマウスの細胞は、約5匹のレシピエントマウスに転移するのに十分である。

6. 大腸炎進行中の臨床徴候のモニタリング

1. 毎週マウスの体重を量り、マウスが元の体重の>5%を失い始めたら、観察を週に2回に増やします。
2. 穏やかに刺激されたときのマウスの反応/動きを観察します。
3. 他の臨床的異常を観察する。すなわち、姿勢と便の一貫性。

7. 結腸採取と病理組織学的スコアリング

1. 元の体重の20%または細胞移入後6週間の体重減少>の時点で_CO2 による子宮頸部脱臼によってレシピエントマウスを屠殺する。マウスを70%エタノールで濡らす。
2. 〜1cmの腹側正中線皮膚切開を行い、腹筋組織から皮膚を引き出し、腹筋組織に〜3cm切開を行い、盲腸を同定し、滅菌はさみおよび鉗子で結腸全体を除去する。培養皿中の予め冷たいPBSで結腸を濡らす。
3. 結腸を縦に切開し、冷蔵前のPBSですすいでください。結腸の1/3を縦に切ります。
4. コロンストリップをペーパータオルに入れ、管腔側を上向きにします。つまようじを使ってスイス式圧延を行う¹⁵。
5. 結腸スイスをカセットに入れ、カセットを10%緩衝ホルマリンに24時間¹⁶時間入れ、続いて自動プロセッサ( 材料表を参照)を使用して脱水し、パラフィンを埋め込んだ。
6. ミクロトーム上の5μmの組織切片を切断し、スライドに装着し、ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色¹⁷ を行う( 材料表を参照)。
7. 最大12個の6つのパラメータのそれぞれのスコアを組み合わせることによって、病理組織学的スコアを決定する。膝蓋骨固有層の炎症 (正常, 0; 軽度, 1; 中等度, 2; 重度, 3);杯細胞喪失(正常、0;軽度、1;中等度、2;重度、3);異常な陰窩(正常、0、過塑性、1;解体、2;陰窩損失、3);陰窩膿瘍(不在、0;現在、1);粘膜びらんおよび潰瘍形成(正常、0;軽度、1;中等度、2;重度、3);粘膜下変化(なし、0;粘膜下、1;経壁、2)¹⁸。

8. 腸管粘膜固有細胞の単離と染色

1. ステップ7.3の後、結腸の別の2/3を0.5〜1cm片に切断し、予め冷えたPBSで洗浄する。
2. 結腸セグメントを、50mL遠沈管内の20mL予備加温EDTA-PBS緩衝液に移す。37°Cで250rpm振とうしながら30分間インキュベートする。
3. チューブをボルテックスし、滅菌ふるい(直径:0.01インチ)に通すことによって上清を捨て、結腸セグメントを50mLチューブ内の20mLの予冷PBSに再懸濁した。
4. 手順 8.3 を 2 回繰り返します。
5. 結腸セグメントを、予め加温した消化バッファー 10 mL を含む C チューブ ( 材料表を参照) に入れます。
6. チューブを解離機( 材料表を参照)に置き、「37C_m_LPDK_1」のプログラムの下で25分間インキュベートする。
   注:「37C_m_LPDK_1」は、サンプルを攪拌して37°Cに保つために使用される解離機の標準的なプリセットプログラムです。
7. 組織が完全に消化されているかどうか、つまり消化バッファーに組織片がないことを確認します。そうでない場合は、「37C_m_LPDK_1」のプログラムを繰り返します。
8. 金属ふるいと100 μLのストレーナーを通過して上清を回収する。10mLの冷蔵前PBSですすいでください。
9. 細胞懸濁液を350 x g で4°Cで8分間遠心分離する。 すべての上清を吸引する。
10. 細胞を4mLの40%パーコール溶液に再懸濁し、十分に混合する(ステップ2.8で調製)。
11. 再懸濁した細胞を、15 mL遠沈管内の2 mLの75%パーコール溶液に移す。
12. 細胞懸濁液を850 x g で20°Cで20分間遠心分離する(加速ランプ:0;ブレーキランプ:0)。
13. 3 mL トランスファーピペットを使用して最上層の脂肪を慎重に除去し、細胞層を 50 mL チューブ内の 20 mL の洗浄バッファーに移します。
14. 細胞懸濁液を350 x gで4°Cで8分間遠心分離する。 すべての上清を廃棄し、細胞を1mLの完了培地に再懸濁する。
15. 手順 3.6 に従ってセルを数えます。
16. 細胞を24ウェルプレートに播種し、50ng/mLのホルボール-12-ミリスチン酸13-アセテートおよび750ng/mLのイオノマイシンで2時間活性化し、続いて5μg/mLのブレフェルジンAと3時間インキュベートした( 材料表を参照)。
    注:使用される試薬は有毒であり、その取り扱いには予防措置と安全対策が必要です。
17. 細胞をFACSチューブに移し、2mLのFACSバッファーを加え、350 x g で細胞を4°Cで8分間遠心分離する。 上清を捨てる。
18. 細胞を12.5μg/mLの抗マウスCD16/³²¹⁹ ( 材料表を参照)FACS緩衝液中でインキュベートし、室温で5分間Fc受容体を遮断する。
19. 生きている/死んだと表面マーカーのための汚れ。
    1. 細胞を 2 mL の FACS バッファーで洗浄し、350 x g で 4 °C で 8 分間遠心分離します。 上清を捨てる。
    2. 生きた色素および表面マーカー(すなわち、抗マウスCD3および抗マウスCD4抗体)20(材料表を参照)で細胞をFACS緩衝液中で最適化された濃度で暗所の4°Cで³⁰分間染色する。
       注:使用される試薬は有毒であり、その取り扱いには予防措置と安全対策が必要です。
20. 細胞染色および核染色を行う。
    1. 2 mL の FACS バッファーを加え、細胞懸濁液を 350 x g で 4 °C で 8 分間遠心分離します。 上清を捨てる。
    2. 200 μLの転写因子固定作業溶液( 材料表を参照)で室温で40分間細胞を再懸濁することにより、細胞を透過処理し、固定する。
    3. 2 mLのPerm緩衝液を加え、細胞懸濁液を350 x g で4°Cで8分間遠心分離する。 上清を捨てる。
    4. 細胞および核マーカー(すなわち、抗マウスIFNγ、抗マウスIL-17A、および抗マウスFoxp3抗体)20と共に、Perm緩衝液(材料表を参照)中で、室温で³⁰分〜1時間インキュベートする。
    5. 2 mLのPerm緩衝液を加え、細胞懸濁液を350 x g で4°Cで8分間遠心分離する。 上清を捨てる。
    6. 1 mL の FACS バッファーを加え、細胞懸濁液を 350 x g で 4 °C で 8 分間遠心分離します。 上清を捨てる。
21. 細胞を200 μLのFACSバッファーで再懸濁し、サンプルをフローサイトメーターで実行します( 材料表を参照)。

結果

脾臓当たり約5 x ¹⁰⁶ CBir1 TCR Tg naϊve CD4⁺ T細胞を、成体CBir1 TCR Tgマウスから単離した。CBir1 TCR Tg naϊve CD4⁺ T細胞の転写は、レシピエントRag1-^/-マウスにおいて慢性大腸炎を誘導した。細胞移動後、臨床徴候をモニターして、体重減少、便の一貫性、および直感した姿勢を含む腸の炎症の進行を評価した。予想通り、マウスは細胞移植後3週間頃に体重が減り始め、体重は細胞移植後6週間で元の体重の約80%〜85%に達しました(図3)。さらに、マウスは細胞導入後3〜4週間頃に下痢を示し、重度の大腸炎を発症すると直感した姿勢を示した。結腸の肉眼的形態を示し、マウスを屠殺したときの組織病理学的スコアによって大腸炎の重症度を評価した。CBir1 TCR Tg naϊve CD4⁺ T細胞を投与されたマウスは、細胞移入後6週間で短い結腸長を示した(図4A

ディスカッション

この大腸炎モデルの再現性にはすべてのステップが不可欠ですが、いくつかの重要なステップがあります。レシピエントRag^-/-マウスは、腸の炎症を誘発するために十分な生存可能なnaϊve CD4⁺ T細胞を投与されるべきである。我々は、MLNの代わりにナイーブCD4⁺ T細胞の単離のために脾臓を使用した。MLNsにおけるナイーブCD4⁺ T細胞の収量は、脾臓よりもはるかに低いためである。CD62LはナイーブT細胞で高発現しており、CD44とCD25はT細胞の活性化マーカーである^13,14。本研究では、まず抗CD4磁気ビーズを用いて、脾臓からCD4⁺ T細胞を単離した。次に、ナイーブCD4⁺ T細胞の単離のために抗CD4、抗CD62L、および抗CD25抗体の組み合わせを使用しました^13,14

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.22 以上m真空駆動使い捨てボトルトップ	フィルターMilliporeSigma	SCGPS05RE
100x Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI
100-µmのこし器	BDのBiosciences	352360
3-mLの移動ピペット	Fisherbrand13-711-9CM
の反マウスCD16/32	Biolegend	101302
反マウスCD25-Percp/Cy5.5	Biolegend	102030
反マウスCD3-Percp/Cy5.5	Biolegend	100327
反マウスCD4 APC	Biolegend
抗マウスCD4磁性粒子	BD Biosciences	551539
抗マウス CD4-BV421	バイオレジェンド	100544
抗マウス CD62L-PE	バイオレジェンド	104408
抗マウス Foxp3-PE	サーモフィッシャー	12-5773-82
アンチマウス IFNγ-FITC	バイオレジェンド	505806
抗マウス IL-17A-PE/Cy7	Biolegend	506922
自動セルカウンター	Bio-rad	TC20
Brefeldin A	BD Biosciences	555029
BSA	Fisher Bioreagents	BP1600-1
C tube	Miltenyi	130-093-237
Cell Separation Magnet	BD Biosciences 552311
コラゲナーゼIV	Sigma-Aldrich	C5138
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
解離器	Miltenyi	130-096-427
DNase I	Sigma-Aldrich
EDTA	Corning	46-034-CI
EDTA (0.5 M, PH 8.0)	Corning	46-034-CI
FBS	のR&D Systems	S11550
フローサイトメーター	BD Biosciences	LSD Fortessa
ヒートランプ	CoverShield	BR40
ヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) 染色キット	Abcam	ab245880
インスリン注射器	BD Biosciences	329412
イオノマイシン	サーモフィッシャー	I24222
ライブ/デッド 固定可能 近赤外 デッドセル ステインキット	サーモフィッシャー	L10119
MaxQ 6000 インキュベート/冷蔵 スタッカブルシェーカー	サーモフィッシャー	SHKE6000
NH4Cl	Thermo Scientific	A687-500
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
ホルボール-12-ミリスチン酸 13-アセテート	Sigma-Aldrich	P8139
RPMI 1640 Medium	Cytiva HyClone	SH3002702
Sorter	BD Biosciences	Arial Fusion
Tissue 自動処理装置	ThermoFisher	STP120
組織包埋・プロセシングカセット	Fisher Healthcare	22048142
Tris Base	Thermo Scientific	BP154-1
True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer)	Biolegend	424401