マイクロチャネルにおけるサブキロヘルツ振動流を生成するための外部ドライバの組み立てと特性評価

Summary

このプロトコルは、マイクロチャネルで10~1000Hzの高調波振動流を生成するための便利な方法を示しています。これは、コンピュータ制御のスピーカダイアフラムをマイクロチャネルにモジュール方式でインターフェースすることによって行われます。

Abstract

マイクロ流体技術は、分析と合成の両方のための化学および生物学的実験室の標準的なツールとなっています。化学試薬や細胞培養などの液体サンプルの注入は、主にシリンジポンプ、重力、または毛細管力によって駆動される安定した流れによって達成されます。相補的な振動流の使用は、最近文献で実証されたように、その多数の利点にもかかわらず、アプリケーションではめったに考慮されません。マイクロチャネルにおける振動流の実装に対する重大な技術的障壁は、その広範な採用の欠如の原因である可能性が高い。振動流を生成することができる高度な市販のシリンジポンプは、しばしばより高価であり、1Hz未満の周波数でのみ機能する。ここでは、マイクロ流路に振動流を発生させる低コストのプラグアンドプレイ型スピーカ系装置の組み立てと動作を実証する。10~1000Hzの範囲の周波数を持つ高忠実度の高調波振動流は、独立した振幅制御とともに実現できます。10~600μmの範囲の振幅は、一般的なマイクロチャネルで共振周波数で1mm>振幅を含む、動作範囲全体にわたって達成できます。発振周波数はスピーカによって決定されますが、我々は発振振幅が流体特性とチャネル形状に敏感であることを示しています。具体的には、チャネル回路長や液粘度の増加に伴って発振振幅が小さくなり、これに対してスピーカ管の太さや長さが長くなると振幅が大きくなります。さらに、この装置は、マイクロ流路上に事前の機能を設計する必要はなく、容易に取り外し可能である。シリンジポンプによって生成される定常的な流れと同時に使用して、拍動流を生成することができます。

Introduction

マイクロチャネル内の液体流量の正確な制御は、液滴生成およびカプセル化¹、混合^2,3、懸濁粒子⁴、5、⁶、⁷の選別および操作などのラボオンチップアプリケーションにとって重要です。流量制御に主に使用される方法は、固定量の液体または固定体積流量のいずれかを分配する高度に制御された定常流量を生成するシリンジポンプであり、しばしば完全に一方向の流れに限定される。一方向の流れを生成するための代替戦略は、重力ヘッド⁸、毛細管力⁹、または電気浸透流¹⁰を使用することを含む。プログラム可能なシリンジポンプは、流量と分配量の時間依存の双方向制御を可能にしますが、シリンジポンプの機械的慣性のために1秒を超える応答時間に制限されています。

より短い時間スケールでのフロー制御は^、フロー物理学の質的変化のために、そうでなければアクセスできない可能性の6,11,12,13,14,15の茄多を解き放ちます。この多様な流れ物理学を利用する最も実用的な手段は、10-1-10-9秒または10 ^{1-10 9Hz}の範囲の時間周期の音響波または振動流を使用することです。この周波数範囲のハイエンドには、バルク弾性波(BAW; 100 kHz-10 MHz)および弾性表面波(SAW; 10 MHz-1 GHz)デバイスを使用してアクセスします。典型的なBAWデバイスでは、接合された圧電体に電圧信号を印加することによって、基板全体と流体カラムが振動します。これにより、比較的高いスループットが可能になりますが、より高い振幅での加熱ももたらされます。しかし、SAWデバイスでは、圧電基板上にパターニングされた一対の桁間電極に電圧を印加することによって固液界面が発振される。非常に短い波長(1 μm-100 μm)のため、300 nmという小さな粒子は、SAWデバイスで発生する圧力波によって正確に操作できます。小さな粒子を操作する能力にもかかわらず、SAW法は波が源からの距離とともに急速に減衰するため、局所的な粒子操作に限定される。

1〜100kHzの周波数範囲では、振動流は、通常、設計されたキャビティ^16,17の上のポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロチャネルに結合されたピエゾ素子を使用して生成される。パターン化されたキャビティの上にあるPDMS膜は、チャネル内の流体を加圧する振動膜またはドラムのように振る舞う。この周波数範囲では、波長はチャンネルサイズよりも大きくなりますが、発振速度振幅は小さくなります。この周波数レジームで最も有用な現象は、慣性¹⁸を有する液体の流れに内在する非線形性のために生じる整流された定常流である音響/粘性ストリーミング流れの生成である。定常的な流れは、通常、障害物、鋭いコーナー、またはマイクロバブルの近くで高速の逆回転渦として現れます。これらの渦は、^19,20を混合し、^10μmサイズの粒子を流れ流²¹から分離するのに有用である。

10~1000Hzの範囲の周波数では、振動成分の速度とそれに関連する定常粘性ストリーミングの両方がかなりの大きさで有用です。この周波数範囲における強い振動流は、慣性集束²²に使用でき、液滴生成²³を容易にし、イン ビトロ 研究のための血流を模倣する流れ条件(Womersley数)を生成することができる。一方、ストリーミング フローは、混合、パーティクルのトラップ、および操作に役立ちます。この範囲の周波数における振動流は、上記²³のように装置に接合されたピエゾ素子を用いて達成することもできる。結合されたピエゾ素子に振動流を実装する際の大きなハードルは、機能を事前に設計する必要があることです。さらに、接合されたスピーカ要素は着脱可能ではなく、新しい要素が各装置²⁴に接合されなければならない。しかしながら、このような装置は、コンパクトであるという利点を提示する。別の方法は、電気機械式中継弁^{20を用いることである}。これらのバルブは、操作のために空気圧源とカスタム制御ソフトウェアを必要とするため、テストと実装に対する技術的な障壁が高まります。それにもかかわらず、そのようなデバイスは、設定された圧力振幅および周波数の適用を可能にする。

この記事では、マイクロチャネルで10~1000Hzの周波数範囲で振動流を生成するためのユーザーフレンドリーな方法の構築、動作、および特性評価について説明します。この方法は、費用対効果の高い組み立て、操作の容易さ、シリンジポンプやチューブなどの標準的なマイクロ流体チャネルやアクセサリとのインターフェースの準備ができているなど、多くの利点を提供します。さらに、以前の同様のアプローチ²⁵と比較して、この方法は、正弦波波形と非正弦波波形との間の変調を含む、発振周波数および振幅の選択的かつ独立した制御をユーザに提供する。これらの機能により、ユーザーは振動流を簡単に展開できるため、生物学および化学の分野における現在存在する幅広いマイクロ流体技術およびアプリケーションへの広範な採用が容易になります。

Protocol

1. ラピッドプロトタイプ金型の設計と製作

1. PC で AutoCAD を開きます。タスクバーの[ファイル]を選択し、[ 開く ]を選択して、.dxfまたは.dwg拡張子を持つチャネルモールドの3次元(3D)モデルファイルを参照してクリックします。
2. モデル全体を選択するには、モデルの周囲にあるボックスをクリックしてドラッグします。デザインを .stl ファイルとしてエクスポートするには、[ファイル] | を選択します。エクスポート、その他の形式、ドロップダウンボックスから.stlを選択します。 
3. ファイルを Formlabs FORM3 などの高精度樹脂ステレオリソグラフィー (SLA) プリンターにアップロードします。樹脂チャンバーに樹脂を注ぎ、印刷を開始し、最小のz軸ステップ(Formlabs CLEAR樹脂の場合は25ミクロン)で金型を製造します。
4. 自動パーツ印刷が完了するのを待ちます。
   注: 0.1 mm という小さな特徴を持つ金型は、この方法で製造できます。
5. 樹脂から部品を取り除いた後、イソプロパノール中で5分間攪拌し、残りの樹脂を除去します。
6. 金型を空気または窒素ガスで2分間乾燥させます。
   注:シリコンウェーハを使用した従来のマイクロ流体モールド製造およびSU8またはKMPRフォトレジストを使用したフォトリソグラフィーを使用して、より小さな機能を備えたモールドを製造することもできます。
7. 乾燥した金型をUV光中60°Cで最大1時間硬化させる。

2. PDMSマイクロ流路作製

1. アルミ箔のシートの上に金型を置きます。PDMSの層間剥離を容易にするために、1回または2回のパスでシリコーン離型剤で金型をスプレーコートします。
2. PDMS樹脂と架橋剤を使い捨てカップに10:1の重量比で注ぎ、使い捨てスプーンで混ぜる。
3. 得られた混合物を金型に注ぎ、必要な厚さのフィルムを製造する。大きな流路壁の変形を防ぐため、PDMS の厚さを 5 mm 以上、またはフィーチャの最大厚さの 3 ~ 4 倍に維持してください。
4. PDMSを流し込んだ金型を脱気室に入れ、蓋を閉めます。Oリングがチャンバーを密閉していることを確認します。
5. 排気バルブを閉じ、真空ラフポンプをオンにして脱気を開始します。
6. 注がれた混合物を真空ポンプで4〜6サイクル以上脱気し、各サイクルは約5分間持続する。細いワイヤーを使用して、残りの気泡(コーナーやトレンチ内)を手動で取り除きます。
7. オーブンの温度を80°Cに設定し、予熱させます。混合物を80°Cのオーブンに2時間置き、硬化させた。
8. 硬化した金型をオーブンから取り出し、室温で10分間放置して冷却する。
9. メスを使用して、金型の端を慎重に切り取ります。最適な層間剥離のために、シリンジを使用して、金型と硬化PDMSの間にイソプロパノールを注入する。
10. 硬化したPDMSを金型から剥がし、カミソリの刃で個々のデバイスに切断します。スライドガラスと接着するには、各デバイスのサイズを 10 mm x 10 mm ~ 30 mm x 70 mm の範囲にする必要があります。
11. 生検パンチを用いて入口と出口に直径1.0〜3.0mmの穴を開ける。
12. ハンドヘルド無線周波数(RF)プラズマ発生器の電源を入れます。スライドガラスを活性化するには、ワイヤー電極を清潔な乾燥スライドガラスの上に2分間複数回着実に通過させます。ワイヤーとガラスの隙間を約 5 mm に保ちます。活性化スライドガラスに接するように硬化PDMSの装置側を置き、次いで80°Cのオーブンに2時間置く。
13. ポリエチレン製の入口チューブと出口チューブを必要な長さに切断し、入口と出口の穴に挿入します。
14. 操作中のチューブの剥離を防ぐために、接触面にシリコーンシーラントを塗布し、チューブを固定するために2時間硬化させます。

3. 振動ドライバアセンブリ

1. 一対のワニからピンへのワイヤのアリゲータークリップの端をスピーカーの端子にクランプします。ここでは、8cmの円錐形の15Wスピーカーが使用されましたが、他のスピーカーを使用することもできます。
2. aux コントローラーチップを絶縁容器の上に置きます。ピンの端を aux コントローラーチップのネジソケットに挿入し、ドライバーでしっかりと締めて接続を確保します。
3. AUXケーブルの一方の端をコントローラチップに接続し、もう一方の端をコンピュータまたはスマートフォンのauxポートに接続します。
4. 12 V 直流 (DC) アダプターを電源装置に接続します。DCアダプタの同軸端を電源ソケットに接続して、コントローラチップの電源を入れます。
5. インターネットブラウザを使用して、オンライントーンジェネレータのウェブサイト(例:https://www.szynalski.com/tone-generator/)に移動します。
6. オンラインアプリケーションで希望の周波数(5-1200 Hz)を入力します。音量バーを必要な量(100%など)までスクロールします。
7. 波形タイプジェネレータシンボルをクリックし、目的の波形(正弦波、正方形、三角形、のこぎり歯)を選択します。デフォルトは正弦波形であることに注意してください。再生を押してスピーカーを作動させます。

4. アダプタアセンブリ

メモ: スピーカ/チューブアダプタアセンブリ全体は、図 1 の回路 図に示されています。

1. スピーカー(図1(I))を3Dプリントされたスピーカーマウント(図1(II))に固定します(補足ファイル1のspeakermount.stlを参照)。
2. スピーカーコーン面を上に向けてスピーカーを垂直に向けます。3Dプリントされたアダプタ(図1(III))(補足ファイル2のspeakertubeadapter.stlを参照)をスピーカーコーンに同心円状に置きます。
3. アダプターの端に沿ってシリコーンシーラントをたっぷりと塗布し、2時間硬化させます。
4. スピーカーとスピーカーマウントを顕微鏡ステージに置き、テープを下にして操作中の動きを防ぎます。
5. 200 μLのマイクロピペットチップを狭い端から約2cm切り、先端の広い半分を処分します。狭い円錐形の端は、可逆的な取り付けのためのウェッジシールとして機能します。
6. ポリエチレンチューブ(図1(V))をマイクロ流路(図1(VI))出口に接続するには、まずマイクロピペットチップ(図1(IV))を通し、次にアダプタの同軸端を通し、最後に側面から出ます。
7. ピペットチップの狭い端をアダプターの同軸端にしっかりとくさび込み、取り外し可能なタイトシールを作成します。

5. マイクロチャネルにおける振動流の実験セットアップの操作

1. 22%重量/重量(w/w)グリセロール溶液のバイアルにトレーサー粒子を加え、20°Cで液体中の体積分率が0.01%〜0.1%ポリスチレンを有する中性浮力懸濁液を生成する。 振とうして激しく混合し、均質な懸濁液を生成する。
2. 1 mL の入口シリンジに 1 mL のサンプルをロードします。装填されたシリンジを自動シリンジポンプに取り付けて固定します。シリンジ針をデバイスの入口チューブに挿入して、防水シールを作成します。
3. アウトレット・チューブがアダプター・アセンブリーを通ってリザーバーに経路接続されていることを確認します (アダプター・アセンブリーに関する前のセクションを参照)。
4. シリンジポンプの電源を入れます。タッチスクリーンを使用して、 ベクトン・ディッキンソン1mLとしてシリンジタイプを選択します。次に、[ 注入] を選択します。次に、必要な流量(0-1 mL/分)または流量(< 1 mL)を選択します。
5. シリンジポンプを使用して安定した流れを開始します。十分な量の液体が流れ、出口チューブがスピーカーまでの液体で満たされるまで待ちます。
   メモ: 出口チューブがプライミングされている場合、特定の設定の振動振幅は、安定した輸送流量によって変化しません。
6. ステップ3.5の説明に従ってトーンジェネレータアプリケーションで必要な周波数、振幅、波形を選択し、 再生 を押してマイクロチャンネル内に振動フローを生成します。

6. 観測と振幅測定

1. デバイスを顕微鏡に取り付けます。光学構成を設定するには、倍率が 10 倍から 40 倍の対物レンズを選択し、焦点面を調整し、ステージを配置します。
2. 明確に定義された焦点面での測定値を得るには、対物レンズの被写界深度がチャネル深度よりも 5 倍以上小さいことを確認します。
3. 振動の流れを観察するには、ナイキストサンプリング定理を使用して計算された発振周波数の少なくとも2倍のフレームレートを持つ高速カメラを使用します。波形の実用的な分解能を得るには、発振周波数の10倍>フレームレートを使用して、一定期間あたり少なくとも10ポイントを測定します。
4. あるいは、拍動流の整流または長時間の影響のみを観察するには、観測周波数を発振周波数の任意の完全除数に設定してストロボイメージングを行う。
5. 直接撮影でもストロボ撮影でも、ジェロ効果を避けるためにグローバルシャッター付きのカメラを使用してください。いずれの場合も、ストリーキングを防ぐために、露光時間を発振時間よりもかなり短く(10倍以上)してください。
6. 高速カメラを使用せずに発振振幅を測定するには、ストロボスコープのフレームレートに近いが等しくないフレームレート(たとえば、50Hz信号の場合は49フレーム/秒)で記録します。これにより、振幅を正確に測定できる非常に減速した振動が得られます。
7. 振幅測定値を観察し、記録します。

Results

上記のセットアップの能力および性能を説明するために、正方形の断面を有する単純な線形マイクロ流路における振動流の代表的な結果が提示される。チャネルの幅と高さは110μmで、長さは5cmです。まず、球状ポリスチレントレーサ粒子の運動と、これらを使用して振動信号の忠実度と達成可能な振動振幅の範囲を確認する方法について説明します。次に、振動振幅に対する特定の流体特性またはマイクロ流体材料の影響について説明します。最後に、非正弦波波形の機能について説明します。

比較のために、我々は以下の流体特性、チャネル形状、およびマイクロ流体材料によって参照ケースを定義する。作動液体は、直径、d = 1μmおよび密度、ρ = 1.20kg/m³を有するトレーサー粒子の0.01%体積分率を有する脱イオン水(μ = 1.00mPa.s)である。ρd²/18μで与えられる対応する粒子応答時間は70nsで、対応する振動時間スケール(1-100ms)よりはるかに小さいです。粒子は、10倍の対物レンズと10μmの焦点深度を有するチャネル中の高さで観察される...

Discussion

我々は、マイクロ流体デバイスにおいて10~1000Hzの範囲の周波数を有する振動流を生成するための外部スピーカベースの装置のアセンブリ(プロトコルクリティカルステップ3および4を参照)および動作(プロトコルクリティカルステップ5および6を参照)を実証した。浮遊トレーサ粒子の粒子追跡は、高調波運動の忠実度を決定し、動作周波数の範囲にわたって達成可能な振動振幅の範囲を較正するために必要です。特定の音量設定の振幅周波数曲線は、主にスピーカの特性に依存しますが、これは変更できません(図3A,Bの代表的な結果のスピーカ特性の説明を参照)。しかしながら、特定のチャネル設計のために、振動振幅は、チューブ特性、液体粘度、またはそれらの組み合わせを適切に修正することによって修正および同調することができる。たとえば、図4では、チューブの直径を大きくしたり、チューブの長さを長くしたりすると、同じボリューム設定の振動振幅の大きさが大きくなることを示しています。ただし、粘度を上げると振動振幅の範囲が狭くなり、1...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oscillatory Driver Assembly
Alligator-to-pin wire	Adafruit	3255	小さなワニ口クリップ - オス ジャンパー ワイヤー (12)
補助ケーブル	Adafruit	2698	3.5 mm オス/オス ステレオ ケーブル 1 m
コントローラー チップ	Damgoo	TPA3116	50w+50w 2 チャンネル オーディオ アンプ (Bluetooth および AUX)
DCアダプター	Adafruit	798	12 V DC 1A 安定化スイッチング電源アダプター
マイクロピペットチップ	VWR シグネチャー	37001-532	200 ul マイクロピペットチップ
シリコンシーラント	ロックタイト	908570	クリアシリコン防水シーラント (80 ml)
スピーカー	Drok	6843996	4.5 インチ 4 Ω 40 W スピーカー
スピーカーマウント			補足ファイルの「speakermount.stl」から3Dプリント
スピーカーからチューブへのアダプター			補足ファイルの「speaketubeadapter.stl」から3Dプリント
Microchannel Manufacture
Biopsyパンチ	Miltex	15110	プランジャー付き生検パンチ(1-4mm)
デガッサー
使い捨て可能なコップ
可能なスプーン
ガラス スライド	VWR 署名	16004-430	3" x 1" pre clean 厚さ 1 mm
厚い型			Si - SU-8 または 3D プリント
オーブン	フィッシャー サイエンティフィ		アイソテンプ
PDMS 樹脂および架橋剤	ダウ ケミカル	4019862	シルガード184 PDMS樹脂および架橋剤(500 g)
ポリエチレンチューブ	ベクトン・ディキンソン・イントラメディック	427440	ポリエチレンチューブ(PE 60 - PE 200)
カミソリブレードVWR		55411-050	シングルエッジ工業用カミソリブレード
RFプラズマ発電機	エレクトロテクニック製品	BD-20	高周波発生器
シリコーンモールドリリース	CRC	03301	食品グレードのシリコンモールドリリース(16オンス)
ObservationおよびCharacterization
CameraEdgertronic		SC2 +
レンズ	ニコン		プランフルーア10倍
顕微鏡	コン		Tiエクリプス手動ステージ
針	ベクトンディキンソン		305175 PrecisionGlide 20G
シリンジ	ベクトン ディキンソン	1180100555	Monoject 1 ml
シリンジ ポンプ	ハーバード 装置		デュアル シリンジ プログラム可能なシリンジ ポンプ
トレーサー 粒子	Spherotech	PP-10-10	ポリスチレン トレーサー粒子 1 um