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方法論記事

いくつかの腎臓病モデルマウスにおけるポリエチレンイミンナノ粒子を用いた外因性人工合成miRNA模倣体の腎臓への送達

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DOI:

10.3791/63302

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2022年5月10日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、いくつかの腎臓病モデルマウスにおいて、非ウイルスベクターとポリエチレンイミンナノ粒子の尾静脈注射 を介して 、外因性人工的に合成されたmiRNA模倣物を腎臓に送達します。これにより、腎臓における標的miRNAの有意な過剰発現がもたらされ、その結果、いくつかのマウスモデルにおいて腎臓病の進行が抑制された。

要約

タンパク質に翻訳されない小さなノンコーディングRNA(21〜25塩基)であるマイクロRNA(miRNA)は、さまざまな腎臓病においてそれらの翻訳を不安定化および阻害することにより、多くの標的メッセンジャーRNA(mRNA)を阻害します。したがって、外因性人工的に合成されたmiRNA模倣物によるmiRNA発現の交替は、多くの腎臓病の発症を抑制するための潜在的に有用な治療選択肢である。しかし、血清RNAaseはin vivoで系統的に投与された外因性miRNA模倣物を直ちに分解するため、腎臓へのmiRNAの送達は依然として課題です。そのため、外因性miRNA模倣体をRNAaseによる分解から保護し、腎臓に有意に送達できるベクターが必要です。多くの研究では、ウイルスベクターを使用して、外因性miRNA模倣物または阻害剤を腎臓に送達しています。しかしながら、ウイルスベクターは、インターフェロン応答および/または遺伝的不安定性を引き起こす可能性がある。したがって、ウイルスベクターの開発は、外因性miRNA模倣物または阻害剤の臨床使用のためのハードルでもある。ウイルスベクターに関するこれらの懸念を克服するために、ポリエチレンイミンナノ粒子(PEI-NP)の尾静脈注射を使用してmiRNA模倣物を腎臓に送達する非ウイルスベクター法を開発し、腎臓病のいくつかのマウスモデルで標的miRNAの有意な過剰発現をもたらしました。

概要

タンパク質に翻訳されない小さなノンコーディングRNA(21〜25塩基)であるmiRNAは、さまざまな腎臓病において、それらを不安定にし、それらの翻訳を阻害することにより、多くの標的メッセンジャーRNA(mRNA)を阻害します1,2。したがって、外因性の人工的に合成されたmiRNA模倣物または阻害剤を使用する遺伝子治療は、多くの腎臓病の発症を抑制するための潜在的な新しい選択肢である3、4、5。

遺伝子治療のためのmiRNA模倣物または阻害剤の約束にもかかわらず、標的臓器への送達は、その臨床的可能性を開発するためのin vivo実験にとって依然として大きなハードルです。人工的に合成されたmiRNA模倣物または阻害剤は血清RNaseによる即時分解を受けやすいため、それらの半減期はin vivoでの全身投与時に短縮されます6。さらに、原形質膜およびトランスフェクト細胞質を通過するmiRNA模倣物または阻害剤の効率は、適切なベクターなしでは一般にはるかに低い7、8。これらの一連の証拠は、臨床現場での使用を可能にし、さまざまな腎臓病患者の新しい治療選択肢となるために、腎臓用のmiRNA模倣体または阻害剤送達システムの開発が必要であることを示唆しています。

ウイルスベクターは、外因性miRNA模倣物または阻害剤を腎臓に送達するための担体として使用されてきた9、10。それらはバイオセーフティーおよびトランスフェクションの有効性のために開発されてきたが、ウイルスベクターは依然としてインターフェロン応答および/または遺伝的不安定性を引き起こす可能性がある11,12。これらの懸念を克服するために、腎臓病のいくつかのマウスモデルで、非ウイルスベクターであるポリエチレンイミンナノ粒子(PEI-NP)を使用して腎臓のmiRNA模倣送達システムを開発しました13,14,15。

PEI-NPは、miRNA模倣物を含むオリゴヌクレオチドを腎臓に効果的に送達することができる線状ポリマーベースのNPであり、その長期的な安全性および生体適合性のために非ウイルスベクターの調製に好ましいと考えられている13,16,17。

この研究は、片側尿管閉塞(UUO)によって産生された腎線維症モデルマウスにおける尾静脈注射を介したPEI-NPによる系統的外因性miRNA送達の効果を示しています。さらに、糖尿病性腎疾患モデルマウス(db/dbマウス:C57BLKS/J Iar -+Lepr db/+Leprdb)および腎虚血再灌流障害(IRI)によって作製された急性腎障害モデルマウスにおいて、尾静脈注射によるPEI-NPによる系統的外因性miRNA模倣送達の効果を実証する。

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プロトコル

すべての動物実験プロトコルは、自治医科大学の動物倫理委員会によって承認され、自治医科大学実験動物ガイドの実験動物の使用と管理のガイドラインに従って実施されました。ここでは、UUOマウスを使用して、腎臓へのmiRNA模倣送達により過剰発現を実証しました。本試験は自治医科大学倫理委員会の承認を受けました[腎線維症については承認番号19-12、急性腎感染症(AKI)については17-024、糖尿病性腎症については19-11]。

1. PEI-NPs-miRNA模倣複合体の調製

注:ここでは、PEI-NPs-miRNA模倣体13,14,15およびPEI-NPsコントロール-miRNA(陰性対照として)の調製について、1匹のマウスについて記載する。

  1. 次のアイテムを準備します。
    1. 10 μLのリニアPEI-NPを調製します。
    2. 100 μMの濃度でヌクレアーゼフリー水に溶解した人工合成miRNAを50 μL調製します(5 μLのヌクレアーゼフリー水に溶解した5 nmol miRNA)。
    3. 100 μMの濃度でヌクレアーゼフリー水に溶解した人工合成コントロール(非標的)miRNAを50 μL調製します(5 nmol miRNAを50 μLのヌクレアーゼフリー水に溶解)。
    4. 5%および10%グルコース溶液を調製する。1.5 mLマイクロ遠心チューブとボルテックスミキサーの可用性を確保します。
  2. 10 μLのPEI-NPを1.5 mLの微量遠心チューブ内の90 μLの5%グルコース溶液に溶解します。次に、チューブを静かに渦巻き、回転させます。
  3. ヌクレアーゼフリー水(100 μM濃度)に溶解した人工合成miRNA(5 nmol)50 μLと10%グルコース溶液50 μMを1.5 mLマイクロ遠心チューブで混合します。次に、チューブを静かに渦巻き、回転させます。このプロセスにより、5%グルコース溶液に溶解したmiRNAが得られます。
  4. 100 μLのPEI-NPを5%グルコース溶液に、100 μLのmiRNA模倣物(5 nmol)を5%グルコース溶液に混合します。次に、チューブを静かに渦巻き、回転させます。
  5. 混合物を室温(RT)で15分間インキュベートして、PEI-NPs-miRNA模倣体の安定な複合体を調製します。この溶液には、PEI-NPとmiRNA模倣物(5 nmol)が、ポリマー中の窒素(N)と核酸中のリン酸(P)の比率(N/P比)= 6で含まれています(図1)。
    注:PEI-NPs-control-miRNA複合体は、この原稿に記載されているすべての腎臓病マウスモデル(UUO、糖尿病性腎症、およびAKI)について、ステップ1.1〜1.5に記載されているのと同じプロセスを使用して調製できます。PEI-NP-miRNAs模倣体の1つの注入量は、N/P比= 6でPEI-NPと結合した5 nmolのmiRNA模倣体と同じである。各PEI-NP-miRNA模倣体の注入期間および頻度は、それが適用される疾患モデルに依存する。

2.蛍光顕微鏡を用いた尾静脈注射によるPEI-NP による UUOマウスの腎臓へのmiRNA模倣物の有意な送達の確認

注:ここでは、人工的に精製されたmiRNA模倣体の腎臓への送達方法が詳しく説明されており、さまざまな腎疾患の治療法の確立を示しています。簡単に説明すると、UUOマウスに、尾静脈を介して100μLのPEI-NPに添加されたシアニン3カルボン酸(Cy3)標識miRNA模倣物を投与した。腎臓への送達は蛍光顕微鏡で確認した。1匹のマウスのPEI-NPs-シアニン3カルボン酸(Cy3)標識miRNA模倣物(オリゴヌクレオチド)が記載されている。この方法は、UUOマウス、糖尿病性腎臓病マウス、およびIRIによって産生されたAKIマウスなどのいくつかのマウスモデルにおいて、miRNA模倣体を腎臓に有意に送達することができる。ここでは、ビデオデモンストレーションにUUOマウスモデルを使用しました。UUOの誘導方法は、他の場所で以前に説明されました13。UUO手術後6日以内にこれらのプロトコルに従ってください。

  1. 次のアイテムを準備します。
    1. 2 μLのPEI-NPと100 μLのCy3標識二本鎖オリゴヌクレオチド[Cy3標識miRNA模倣体(1 nmol; 10 μM)]を調製します。
    2. 5%および10%グルコース溶液を調製する。1.5 mLマイクロ遠心チューブとボルテックスミキサーの可用性を確保します。
    3. キャップに小さな穴のある50 mLのプラスチック製遠心チューブを使用して、UUOマウスの尾静脈を分離します。
    4. 蛍光顕微鏡では、最適切断温度(OCT)コンパウンド、クライオスタット、液体窒素、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、27 G針付き1.0 mLシリンジ、およびシランコーティングガラスを準備します。
      注:フルオレセイン標識 ロータステトラゴノロバス レクチン(近位尿細管マーカー)および4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)は、近位尿細管および細胞核のオプション染色用に調製できます。
  2. 2 μLのPEI-NPを1.5 mLの微量遠心チューブ内の98 μLの10%グルコース溶液に溶解します。次に、チューブを静かに渦巻き、回転させます。
  3. 10%グルコース溶液(ステップ2.2で調製)中の100 μLのPEI-NPに100 μLのCy3標識miRNA模倣物を追加します。次に、チューブを静かに渦巻き、回転させます。
  4. 混合物をRTで15分間インキュベートして、PEI-NP-Cy3標識-miRNA模倣体の安定複合体を調製します。
  5. UUOマウスの頭を麻酔なしで50 mLの遠心チューブに入れ、次にキャップの準備された穴に尾を通します。
  6. 1.0 mLシリンジに200 μLのPEI-NPs-Cy3-miRNA模倣複合体を含む27 Gの針を充填します。
  7. 27 G針を備えた1.0 mLシリンジを使用して、マウスの尾静脈 を介して PEI-NPs-Cy3-miRNA模倣物(200 μL)を注入します。
    注:エタノール(70%〜80%)で飽和させた脱脂綿で尾静脈を拭いて、尾静脈を拡張し、注射部位を消毒します。
  8. 200 μLのPEI-NPs-Cy3-miRNA模倣複合体注射の1時間後、小動物用の適切な麻酔装置を使用して、イソフルラン(4%-5%)でマウスを麻酔します。つま先のピンチ反射がない状態で麻酔の深さを確認します。手術中はイソフルラン(3%)で麻酔を維持します。
  9. 次に、外科用ハサミと鉗子で皮膚、筋肉、肋骨を切開し、心臓を露出させます。右心房を切開した後、左心室にPBSを注入し、腎臓の色が淡黄色に変わる(マウスの全身にPBSが灌流されていることを示す)まで全身に血液を抜きます。
    注:心臓灌流は、全身の血液を効率的に除去するために行われます。
  10. イソフルランを停止し、マウスから腎臓を取り除き、PBSで洗浄する。その後、腎臓から腎カプセルを取り除き、PBSで腎臓を2回洗います。
  11. 腎臓組織サンプルをOCT化合物に埋め込み、液体窒素で凍結します。
  12. クライオスタットを使用して切片(厚さ5 μm)を準備します。切片をシランコーティングされたスライドガラスに取り付け、4%パラホルムアルデヒドで固定します。
    注:腎臓組織は、オプションでフルオレセイン標識ロータ ステトラゴノロバス レクチン(2 mg / mL)でRTで2時間近位尿細管で染色し、続いてDAPI(PBSで30 nM)でRTで15分間染色することができます。
  13. スライドをPBSで2回静かに洗います。
  14. 100倍および400倍の倍率の蛍光顕微鏡と適切なイメージングソフトウェアによって蛍光染色を視覚化します。

3.尾静脈注射によるPEI-NP による 腎臓へのmiRNA模倣物の送達後の標的miRNA変化の確認

  1. 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)を実行して、標的miRNAの交代を確認します。
    注:qRT-PCR 18,19,20の詳細については、以前に公開された記事を参照してください。以下に示す代表的な結果を生成するために使用されるqRT-PCRシステムは、メーカーによって変更されました。qRT-PCRは、最新のメーカーのプロトコルに従って実施する必要があります。

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結果

下記の腎線維症、糖尿病性腎症、およびAKIの標的miRNAは、マイクロアレイ、qRT-PCR、および/または遺伝子治療アプリケーションのためのデータベース研究に基づいて選択されました。詳細については、以前の出版物13、14、15を参照してください。

腎線維化マウスにおけるPEI-NPを用いたmiRNA-146a-5p-模倣体の送達と効果13
蛍光顕微鏡分析は、PEI-NPの尾静脈注入がmiRNA模倣物を尿細管間質腔に送達できることを示しました。UUOによって作製された腎線維症マウスでは、これには腎臓に規則的な形態を持たない腎尿細管細胞(図2A矢印)および糸球体(図2A)が含まれていました。

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ディスカッション

この原稿で提示されたプロトコルを使用して、PEI-NPはmiRNA模倣物を腎臓に送達して標的miRNAの過剰発現を誘導し、腎線維症、糖尿病性腎疾患、AKIを含むいくつかの腎疾患の in vivo マウスモデルで治療効果をもたらします。

PEI-NPとmiRNA模倣体の複合体を調製する方法は非常に簡単です。PEI-NPの正に帯電した表面は、それらがちょうど混合されたときにmiRNA模倣物を閉じ込めます13、14、15、16、17(図1)。さらに、直鎖状ポリエチレンイミンベースの非ウイルスベクターとして、PEI-NPは、IFN応答や遺伝的不安定性によって誘発される発癌などのウイルスベクタ...

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開示事項

著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

本研究の一部はJSPS科研費(課題研究(課題番号21K08233)の支援を受けて行われました。この原稿の草稿を編集してくれたEdanz (https://jp.edanz.com/ac)に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール 核染色用サーモフィッシャーサイエンティフィックD-1306
バッファー RPEQiagen79216ウォッシュバッファー 2
バッファー RWTQiagen1067933ウォッシュバッファー 1
Control-miRNA-mimic (人工的に合成された miRNA)サーモフィッシャーサイエンティフィック未割り当て5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3'(センス)
5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′(アンチセンス)
Cy3標識二本鎖オリゴヌクレオチドタカラバイオ(株)
フルオレセイン標識ロータステトラゴノロバスレクチンVector Laboratories IncFL-1321
In vivo-jetPEIPolyplus101000021
MicroAmp qRT-PCR用光学96ウェル反応プレートサーモフィッシャーサイエンティフィック431681396ウェル反応プレート
MicroAmp 光学接着フィルムサーモフィッシャーサイエンティフィック 431197196ウェル反応プレート
miRNA-146a-5p模倣用接着フィルム(人工合成miRNA)サーモフィッシャーサイエンティフィック未割り当て5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGGU
UT-3′(感覚)5'-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′(アンチセンス)
miRNA-146a-5p プライマーQiagenMS00001638Qiagen が qRT-PCR キットを変更しました (2021 年 5 月から miScript miRNA PCR システムから miRCURY LNA miRNA PCR システムへ)
miRNA-181b-5p mimic (人工的に合成された miRNA)遺伝子デザインが割り当てられていません5'-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG
GUU-3'
miRNA-181b-5p プライマーキアゲンMS00006083Qiagen が qRT-PCR キットを変更したため利用できません (2021 年 5 月から miScript miRNA PCR システムから miRCURY LNA miRNA PCR システムへ)
miRNA-5100-mimic (人工的に合成された miRNA)遺伝子デザイン割り当てられていません5'-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′
miRNA-5100-primerQiagenMS00042952Qiagen が qRT-PCR キットを変更 (2021 年 5 月から miScript miRNA PCR システムから miRCURY LNA miRNA PCR System に変更) のため利用できません。
miRNeasy Mini kitQiagen2170042.0 mL コレクションチューブの膜固定スピンカラム
miScript II RT kitQiagen218161Qiagen が qRT-PCR キットを変更したため (2021 年 5 月から miScript miRNA PCR システムから miRCURY LNA miRNA PCR System に変更
miScript SYBR Green PCR kitQiagen218073Qiagen が qRT-PCR キットを変更したため (2021 年 5 月から miScript miRNA PCR システムから miRCURY LNA miRNA PCR System に変更) 利用できません
QIA シュレッダーQiagen796542.0 mL コレクションチューブ
内の生体ポリマースピンカラムQIAzol 溶解試薬Qiagen79306フェノール/グアニジンベースの溶解試薬
QuantStudio 12K Flex Flex リアルタイムPCRシステムサーモフィッシャーサイエンティフィック4472380リアルタイムPCR装置
QuantStudio 12K Flex ソフトウェアバージョン1.2.1。サーモフィッシャーサイエンティフィック4472380リアルタイムPCR装置ソフトウェア
RNaseフリー水キアゲン129112
RNU6-2プライマーキアゲンMS00033740qRT-PCRキットを変更(2021年5月より、miScript miRNA PCRシステムからmiRCURY LNA miRNA PCR Systemへ)のためご利用いただけません。
ッシュテックOCT(Optimal Cutting Temperature Compound)サクラファインテックジャパン株式会社割り当てられ
MIR7900) 利用できません ティていない

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