創傷治癒の動物モデルとしてのモンゴルスナネズミ

サマリー

この記事では、角膜の解剖学と組織学、およびその治癒過程を研究するために開発された新しい動物モデルについて説明します。この新しい動物モデルは、ヒトの角膜と多くの類似点を持つ角膜を持つモンゴルスナネズミを使用しています。

要約

角膜創傷治癒研究は長い間行われており、苦痛を軽減し、患者の目の健康を改善するのに役立つ治療法を開発するのに役立ちました。歴史的に、角膜治癒はマウスやラットなどのげっ歯類で研究されてきましたが、これらのモデルは人間の障害を完全に模倣していない可能性があります。しかし、モンゴルスナネズミ(Meriones unguiculatus)などの他のげっ歯類に関する情報は、角膜研究では乏しい。

ここでは、フォトリフラクティブ角膜切除術後の角膜治癒を研究するための新規動物モデルを開発する技術について述べる。 M. unguiculatusの角膜に関する文献が限られているため、正常な角膜の組織学的分析についても説明します。これらの研究技術は、遺伝学、解剖学、生理学の点でモンゴルスナネズミと人間の角膜が類似しているため、眼疾患の研究にも採用できます。

概要

前眼部手術の重要な関心事である角膜創傷治癒の最も重要な側面のいくつかは、上皮構造の完全性、角膜間質の透明性の維持、そして最後に角膜^の屈折特性の観点からの結果です1。

角膜は眼球の前面にある最も外側の透明な組織であるため、外傷、感染症、火傷の影響を受けやすいです。これらの創傷の治癒障害は、視覚の健康を損なう可能性があります²。

現在、角膜治癒を研究するためにいくつかの動物モデルが利用可能であり、それらのいくつかは、研究される種およびメカニズムの種類に応じて、他のものよりも優れています¹。スナネズミ²の網膜に関する以前の調査の記録がいくつかあります。しかし、これまでのところ、これらのげっ歯類の角膜の瘢痕化プロセスに関する発表された文献はありません。

本稿では,角膜創傷治癒の動物モデルとしてメ リオネス・ウンギキュラトゥ ス(モンゴルスナネズミ)を紹介する.フォトリフラクティブ角膜切除術後に角膜治癒を誘発する手順を説明し、さまざまな種類の角膜瘢痕化プロセスを研究し、生体組織の動的段階の観点から創傷治癒を理解し、最後に適切な将来の治療を計画することができます³。光線療法用角膜切除術は再現性の高い技術であり、角膜損傷の深さや直径などのパラメータを正確に制御できる可能性があります⁴。さらに、この技術は、器具または処置を行うオペレータに特有の変数を追加し得る手術器具または化学溶液(例えば、生理食塩水、ホルマリン、アルコールなど)^{を用いた処置を必要としない}5。

この記事で紹介した実験には、同様のサイズと体重(約90 g)の生後6か月のオスのスナネズミ3匹を使用しました。手順は右目でのみ行われました。1匹のスナネズミ(スナネズミ1またはコントロールと呼ばれる)は光線療法の角膜切除術を受けておらず、すべての正常な眼構造を評価するために除核されました。光線療法用角膜切除術は、エキシマレーザーで生成された紫外線を角膜に制御して送達することを含み、屈折矯正手術を行うために開発されました⁶。マウス⁷などの他のげっ歯類に使用されています。他の2匹のスナネズミは光線療法の角膜切除術を受けました。そのうちの1人は手術後24時間で除核され(スナネズミ2と呼ばれる)、もう1人は手術後96時間で除核されました(スナネズミ3と呼ばれます)。

この実験を行うため、研究する条件ごとに無作為に選抜したスナネズミを撮影したが、この実験は予め各条件につき合計16匹のスナネズミで行った。編集上の理由から、例として各条件(合計3匹のスナネズミ)にランダムに選択されたスナネズミを使用することが決定されました。

この研究の主な目的は、利用可能な最良の動物モデルを探索することです。ただし、すべての種が人間の目と同様の目の特徴を持っているわけではないことに注意することが重要です⁸。この記事では、 Meriones unguiculatus の角膜を研究するために使用される方法論と、角膜損傷を生成するために実行される手順について説明します。

プロトコル

すべての研究手順は、コルドバカトリカ大学の「実験動物の世話と使用のための機関委員会」によって承認され、実験動物の世話と使用に関する国立研究評議会のガイドに従いました。これらの手続きは、コルドバ・カトリカ大学の「サルード科学部」と「セロ・ビシオン研究所」の当局によっても承認されました。

1.スナネズミの取り扱いと麻酔

注:すべての動物は特定の病原体を含まない(SFP)オスのモンゴルスナネズミであり、免疫学および感染症研究開発センター(CIDIE)施設(アルゼンチン、コルドバ)で飼育されていました。それらはラプラタ大学(アルゼンチン、ブエノスアイレス)から入手しました。

1. スナネズミをトウモロコシの穂軸の寝具で寝かせたポリスルホンケージに社会的に収容します。食品とろ過された水道水を水筒に入れて 自由に提供します。室温範囲が18°C〜24°Cであり、12:12時間の明暗サイクルが使用されていることを確認してください。
2. 各スナネズミの体重を別々に量り、混乱を避けるためにそれぞれを特定します。スナネズミの尾の付け根に消えないインクマーカーで印を付けます。ピンセットを使用してスナネズミの耳を保持し、げっ歯類の耳に消えないマーカーを使用してマークを付けます。実験室と大きなバイオテリウムが利用可能な場合は、対応する識別情報とともにげっ歯類ごとに一意のケージを割り当てます。
3. 層流フードを70%エタノール溶液で消毒します。針、注射器、ラックを含むすべての外科用および使い捨て器具をフード内の作業領域に置きます。フードにも使い捨ての外科用フォームを置きます。
4. 小さな開いたプラスチック容器を使用して、げっ歯類を精密天びんに保ち、測定を容易にします。
5. この実験には、同様のサイズと体重(~80 g)の生後6か月のオスのモンゴルスナネズミ3匹を使用します。一度に1つずつ、げっ歯類と一緒に各ケージを層流フードの中に置きます。ケージを開き、スナネズミのそれぞれを特定し、体重計で体重を量ります。
   注:スナネズミは無害ですが繊細な動物です。スナネズミを扱うときは使い捨て手袋を着用してください。
6. 利き手ではない手でスナネズミをつかみ、尻尾でしっかりと保持します。親指と人差し指を耳の後ろに置いて利き手を使用して、腹側領域を上に向けて動物を保持します。小指を使って尾を持ちます。
7. シリンジに1 mLのケタミンとキシラジンを入れた30 Gの針を入れます。利き手を使用して、げっ歯類に腹腔内麻酔を投与します(50-100 mg / kgケタミンと2 mg / kgキシラジン)⁹ 。.効果の持続時間は約20〜50分です(変動が発生する可能性があります)。
8. スナネズミが完全に麻酔されていることを確認するには、角膜を切開する前に、つま先をつまむ、尾をつまむ、角膜の反射などで確認します。
   注意: すべての手順は右目だけで実行してください。

2.角膜の光干渉断層撮影(OCT)

1. 分泌物や動物の毛から機器を保護するために、滅菌外科用ドレープを配置します。
2. オペレーターの1人が動物を持ち、別のオペレーターが画像を撮影していることを確認します。オペレーターは、スナネズミの目ができるだけ安定し、研究できるように、スナネズミを持ちながら機器に手を置く必要があります。スナネズミを持っている手をあご当てに置きます。
3. OCT を制御するソフトウェアを起動し、[イメージの撮影]、[目的のイメージの保存] の順にクリックします。角膜の複数の矢状および冠状スライスを実行します。OCTの下の目を画像化し、複数のスライスを作成して、げっ歯類の角膜の前部を表示します。
   注意: 取得した画像が鮮明ではなく、目がわずかに動いた場合は、手順を数回繰り返して十分な画像を取得してください。
4. OCTソフトウェアを使用して、中央および周辺領域のパキメトリック測定を実行します。ソフトウェアのメイン画面で、[ 画像の撮影]を押してから、[ 目的の画像を保存 ]ボタンを押します。
5. 正常または対照眼、および他のげっ歯類の眼の光線療法角膜切除術の直後に測定を実行します。

3.エキシマレーザー光線療法角膜切除術(PTK)

1. エキシマレーザー装置に滅菌外科用ドレープを置き、分泌物や動物の毛から装置を保護します。
2. 外科的処置の5分前に治療される眼に局所塩酸プロパラカイン(0.5%)を一滴注入する。
3. 利き手ではない手を使ってスナネズミをしっかりと握ります。利き手で動物のまぶたを開き、画像を適切にキャプチャできるようにします。焦点を合わせて鮮明な画像を取得できるようにするには、スナネズミを持っている人の手が機器の頭にかかっていることを確認してください。患者が首を置く場所に動物を持っている手を置きます。
4. 右目にPTKアブレーションを行います。次のパラメータを使用します:厚さ60μm〜62μmのアブレーション、3mmの光学ゾーン、4秒の持続時間、および合計1,867パルス。
   注:PTKはスナネズミ2とスナネズミ3でのみ実行されます。このステップでは、第2のオペレータは、角膜組織を切除するためにレーザーを準備して活性化する。
5. 手順の直後に、写真を撮り、OCT分析を実行して、治療された目の表面変化を記録および記録します。
6. 手順が完了したら、げっ歯類をケージに戻し、バイタルサインを監視し(心拍数:毎分360拍、直腸温度:37〜38.5°C、呼吸数:毎分90呼吸)、動物を麻酔から回復させます。

4.角膜PTK後のスナネズミの目覚め

1. ブプレノルフィン(0.1mg / kgから0.05mg / kg)とアチパメゾール(0.1-1 mg / kg)を腹腔内注射 で 投与します。.
2. 各スナネズミをそれぞれのホームケージに入れ、バイタルサインを監視して正常な目覚めを確認します(通常の体温は37〜39°Cです)。
3. エリスロマイシン軟膏を塗布して、表面を清潔に保ち、感染を防ぎます。この手順を1日2回実行してください。
4. PTK後2日間連続して、鎮痛と眼軟膏のためにブプレノルフィン(6〜12時間ごと)を皮下(0.01〜0.05 mL)投与します。.

5.安楽死法

1. 可能な限り、ホームケージで安楽死を行います。
2. 圧縮二酸化炭素(CO₂)ガスをホームケージに導入します。ホームケージ内の既存の空気にCO₂ を添加したチャンバー容積の30%〜70%の充填率は、目的を満たす混合物を達成するのに十分です(10 L容量のチャンバーの場合、3〜7 L / minの流量を使用します)。げっ歯類の死を確実にするために(安楽死の二次的な方法として)頸部脱臼を使用してください。
3. スナネズミ2とスナネズミ3の手術後24時間後と96時間で、動物をホームケージから取り出して眼球(正常な眼球と手術中の眼球の両方)の除核を行い、角膜治癒を観察します。
4. 動物を手術台に置き、約1分間心拍がないことを確認します。

6.眼科手術

1. 上まぶたと下まぶたを取り除き、眼球にアクセスできるようにします。外科用鉗子とはさみを使用してまぶたを取り除きます。作業領域のサイズは非常に小さくて繊細なので、まぶたを取り除くことで眼球を傷つけることなく摘出することができます。
2. 眼球を摘出するには、外眼窩を切開し、ハサミを後方向に導きます。眼球を軌道から分離することにより、内部カンサスからこの手順を繰り返します。
3. 眼球の後ろにある視神経を切片化します。この技術を実行するとき、後部眼窩神経叢は通常わずかな出血を引き起こし、それが作業を困難にすることを明確にすべきである。
4. 眼球を滅菌生理食塩水を入れた微小遠心チューブに30秒から1分間導入して、残留血液を洗い流します。
5. 眼球を10%ホルムアルデヒドを含む微小遠心チューブに入れて、以下に説明するように解剖病理学的分析を行います。複数の画像や写真を撮ります。

7.解剖病理学分析

1. 目全体を10%緩衝ホルマリンに6〜24時間埋め込みます。
2. ミクロトームを使用して組織を切断します。切断組織の厚さが3 mmであることを確認してください。
3. 組織を96%アルコールに30〜90分間浸し、この手順を2回繰り返します。
4. 組織をイソプロピルアルコールに30〜90分間入れ、この手順を2回繰り返します。
5. 組織をキシレンまたはキシレン代用物に1〜3時間入れます。
6. 組織を液体灯油に最低1時間埋め込みます。
7. ブロックを使用してティッシュを配置し、流動パラフィンに埋め込みます。固まらせて(冷たい場所に置いて)、切ります。
8. 製造元の指示に従って、切片作成用のミクロトームを準備します。
9. その後、ヘマトキシリンやエオシンなどの染色剤を使用してください。
10. 顕微鏡にカメラを追加して写真を取得します。

結果

本研究では、組織学的手法と光干渉断層撮影などの前部セグメントの補完的研究を使用して、角膜構造全体を徹底的に分析しました。前部構造の光干渉断層撮影による画像解析では、上皮と間質が正常であり(図1)、角膜の中心厚さは160 μm、末梢の厚さはそれぞれ106 μm±2 μmです。他の刊行物も、他のげっ歯類の角膜が周辺¹⁰に向かって薄くなることを示している。

PTK後、角膜上皮の創面切除が観察された(図2)。治療前後のスナネズミの目の肉眼写真も撮影しました。PTKを行った後、不規則な角膜表面が観察され、フルオレセインを1滴注入し、紫色光で照射することによって染色されました(上皮性潰瘍を示す)(図3)。

組織学的分析に関して、未治療のスナネズミ(スナネズミ1)の正常な角膜はヒトと同じ層を示した:角膜の全厚さの28...

ディスカッション

角膜創傷治癒の生理機能は、組織再生と恒常性の維持との間のバランスである。過度の創傷治癒は線維症や瘢痕化につながる可能性があり、最終的には臓器機能が失われる可能性があります。角膜外科手術の急速な進化に伴い、角膜創傷治癒とそれに伴う生理学的および病理学的事象を理解することの重要性を過大評価することはできません¹¹。

複数の研究成果によると、スナネズミは、主に日中の行動¹² や、マウスやラットと比較して優れた急性視力など、視力研究に適した種となる多くの感覚特性を持っています¹³。それらの網膜構造は、人間のそれにより類似しています¹⁴。このため、網膜寄生虫感染症¹⁵の発症、治療薬、遺伝子送達、網膜生理学の研究のための動物モデルとして使用されている。さらに、最近発表された遺伝子分析では、同定されたスナネズミ遺伝子のほとんど(81%)がマウスとヒトの間で共...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
麻酔ト	ドドロガス
エッペンドルフチューブ	トドドロガス
エキシマ レーザー	テクノラス	2022445
フルオレセイン	Poen
鉗子	Ofcor	3339
ホルムアルデヒド	トドドロガス
グローブ	トドドロガス
ケタミン	シグマ・アルドリッチ
光干渉断層撮影	Optovue	659007
Proparacaine	Poen
Scisors	Ofcor	3336
滅菌ドレープ	Soporte hospitalario
滅菌ガーゼ	Soporte hospitalario
注射器と針	トドドロガス
キシラジン	シグマ・アルドリッチ