交換可能な蓋付き乳房イメージングウィンドウを使用した縦方向のバイタル内顕微鏡

サマリー

このプロトコルは、交換可能な蓋(R.MIW)を備えた新しい乳房イメージングウィンドウを記述しています。R.MIWの移植後の生体内顕微鏡検査は、異なる発達段階の間に細胞分解能を有する健康および罹患した乳腺の縦方向および複数日のイメージングを可能にする。

要約

乳腺の分岐構造は非常に動的であり、出生後に成長およびリモデリングのいくつかの段階を経る。皮膚フラップ手術またはイメージングウィンドウの移植と組み合わせたバイタル内顕微鏡検査は、異なる発達段階における健康な乳腺の動態を研究するために使用されてきた。ほとんどの乳腺イメージング技術は数時間から数日の時間枠に制限されていますが、乳腺のリモデリングプロセスの大部分は数日から数週間の時間枠で行われます。乳腺リモデリングを研究するには、関心のある組織への光学的アクセスを長時間にわたって可能にする方法が必要である。ここでは、交換可能な蓋(R.MIW)を備えたチタン乳腺イメージングウィンドウの改良版が記載されており、最大数週間の細胞分解能で乳腺の高解像度イメージングを可能にします。重要なことに、R.MIWは、生体内イメージング実験の全期間にわたって組織アクセスを提供するため、局所組織操作、標識、薬物投与、または画像誘導マイクロダイセクションに使用される可能性があります。まとめると、R.MIWは乳腺の発達、恒常性、および疾患中の細胞ダイナミクスの高解像度特性評価を可能にします。

概要

乳腺上皮は哺乳類に存在するユニークな分泌器官であり、子孫に栄養を与えるために牛乳を生産して分泌します。生涯を通じて、乳腺は複数回の発達および成長を受け、組織¹の構造的および機能的変化を伴う。発生段階に応じて、組織リモデリングに寄与する細胞型、ならびに管状樹内の位置が異なる。

多光子インタビタル内顕微鏡(IVM)は、天然かつ最小限に摂動した設定^2、3、4におけるインビボでの乳腺細胞ダイナミクスの研究を可能にする。乳腺への視覚的アクセスを得るために、思春期⁴、⁵、⁶、⁷、成人期2、⁸、授乳⁹、^10、11、^12、および腫瘍動態^13、14を含む、乳腺発達の異なる段階の間に、いくつかの一時的なエクスビボまたは皮膚フラップ画像化技術が公開されている。^,15.これらの技術は、乳腺細胞ダイナミクスの高い空間的および時間的に分解された画像化をもたらすが、時間枠は時間に制限されているのに対し、ほとんどの乳腺リモデリングプロセスは数日から数週間かかる。したがって、長期間にわたって関心のある組織への光学的アクセスを可能にする方法が必要とされる。長年にわたり、チタン製乳房画像化窓(MIW)^2,3,19を含む、乳腺腫瘍画像化のためにいくつかの永久画像化窓^15,16,17,18が開発されてきた。乳腺腫瘍の増殖を研究するのに非常に有用であるが、健康な乳腺構造の可視化は数日にとどまった。最近、柔軟なシリコンイメージングウィンドウが開発され、数週間にわたって思春期の乳腺を視覚化することができます²⁰。しかし、乳腺は脂肪細胞が豊富な脂肪パッドに埋め込まれており、これは広範な光散乱をもたらし、その結果、乳腺管構造の視認性が制限される。したがって、乳腺における長期間にわたる組織動態を視覚化するためには、常に優れた画像化条件が要求される。古典的なMIWも柔軟なシリコンウィンドウも、手術や移植後にウィンドウが閉じたシステムを形成するため、イメージング前の組織操作や物理的な組織位置の最適化はできません。その結果、基礎となる乳腺組織への最適な光学的アクセスは、より長い期間にわたって妨げられる可能性が高い。対照的に、皮膚フラップ技術は、画像化セッション中の組織の最適化および再配置を可能にし、皮膚フラップを複数回繰り返すことができる²。しかし、皮膚フラップによる反復画像化セッションは、皮膚の回復を可能にするために手術の間に十分な時間(少なくとも7日間)が割り当てられている場合にのみ可能であり、したがって、より長い時間スケールでの研究プロセスにほとんど適している。さらに、その侵襲的な性質および創傷閉鎖時の感染および瘢痕化の大きなリスクのために、この処置を何度も行わないことが推奨される。

これらの制限を克服するために、すなわち、高周波で長期間にわたって最適なイメージング条件を確保し、同時に組織操作を可能にするために、交換可能な蓋(R.MIW)を備えたMIWの改良されたチタンバージョンが、数日から数週間にわたって健康な乳房および罹患した乳腺を視覚化するように設計されました² (図1A、R.MIWは、最適な組織アクセスを提供するようにカスタム設計されており、IVM実験の全期間にわたって直接組織操作を可能にし、それによって長期間にわたって適切な時間と場所で乳腺を視覚化することができます。閉じると、R.MIWは古典的なMIWに匹敵する気密システムを形成します(図1C)。無菌条件下で開くと、R.MIWは局所組織操作を可能にして光学アクセスを改善し、経路阻害剤またはアゴニストなどの物質の局所投与、癌細胞または免疫細胞集団などの異なる細胞タイプの標的の注射、または組織標識色素の添加も可能にする。蓋は、下層組織に損傷を与えることなく、イメージングセッション間の任意の時点で開くことができる。

図1:交換可能な蓋を備えた乳房造影窓の設計。(A)リングに10mmのカバーガラスを接着した乳房造影窓の交換可能な蓋の上面図と側面図。(b)乳房撮像窓の上面図及び側面図は、財布紐縫合糸を用いてマウスの皮膚内に窓を固定する間に溝を有する外輪及び内輪からなる。外側のリングには、蓋の4つの突起(アーム)にフィットする小さな溝があります。(C)蓋の開閉機構を示す漫画や写真。斜めの突起は、蓋が窓枠の内側に固定されていることを確認します。この図は Messal et al. ² から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

このプロトコルは、R.MIWの設計と移植手順、および同じ乳管とその可視化を細胞分解能で再検討するための縦方向IVM戦略を記述しています。R.MIWは、多様な蛍光レポーターマウスモデルにおける乳腺の異なる発生段階における細胞分裂および形態学的変化の追跡を可能にする。まとめると、R.MIWは、乳腺の発達、恒常性、および疾患中の細胞ダイナミクスの高解像度特性評価を容易にする。

プロトコル

本稿に記載されているすべての手順は、IACUCおよびルーヴェン大学(KU Leuven)のガイドラインに従って実施され、承認されたプロジェクト申請P160/2020のコンテキスト内で実施されました。このプロトコルを実行する前に、施設の獣医師と鎮痛戦略を確認し、施設のガイドラインに従って術前および術後の鎮痛を投与してください。

1. R.MIWの準備(推定タイミング:2時間)

注:R.MIWの建設には、特別なツールと専門知識が必要なため、チタンなどの硬質材料を扱うことを専門とする地元のメーカーを見つけることをお勧めします。チタン補綴物の設計と製造を専門とするワークショップは、通常、R.MIW部品を製造するための機械と専門知識を持っています。

1. R.MIWの蓋を、蓋の外側が上を向いて(そして蓋の腕が下方に傾斜して)滅菌された面に置きます。 図1A)。
2. 蓋の縁全体にシアノアクリレート接着剤接着剤を塗布し、蓋の上に10mmの丸いガラスカバースリップを慎重に置きます。
   注:外科的処置中は、必ずガラスカバースリップ付きの予備の蓋をバックアップとして準備してください。
3. 滅菌した木の棒を使用してガラスカバースリップを配置し、ガラスカバースリップと蓋のフレームの間に気密シールを確保するために、押し下げるために力を加えます。蓋の腕の穴がガラスで覆われていないことを確認してください。
4. 蓋とR.MIWを消毒するには、閉じたペトリ皿に80%エタノールを少なくとも30分間沈めます。
   注:シアノアクリレート接着剤の溶解を避けるために、80%エタノール中に1時間以上蓋を放置しないでください。
5. アセトンに浸した綿の先端を使用して、ガラスカバースリップから余分なシアノアクリレート接着剤接着剤を取り除きます。
6. 蓋とR.MIWは、さらに使用するまで無菌環境に保管してください。
   注:R.MIWフレームと蓋は、滅菌チューブまたはバッグに最大1週間保管することができます。実験を再開するときは、プロトコルに進む前に、ガラスカバースリップがまだ蓋に正しく取り付けられているかどうかを必ず調べてください。

2. 手術準備(予定時間:15分)

注:R.MIW移植手順では、任意の系統の雌マウス(>3.5週齢)を使用することができる。

1. 滅菌手袋を使用して滅菌を維持し、マウスと接触するすべてのアイテムを滅菌します。手術器具を水と中性石鹸で洗い、風乾させ、角や縁が露出していないアルミホイルで包み、オートクレーブを用いて120°Cで20分間殺菌してから手術を行います。
2. 滅菌手術プラットフォームを準備し、表面を80%エタノールで滅菌する。
   注:無菌性を確保するために、手術はフローキャビネットで行うことができます。
3. 加熱パッドの電源を入れ、マットを滅菌ドレープで覆います。滅菌ドレープ上に滅菌器具をレイアウトし、R.MIWと少なくとも2つのガラスで覆われた蓋をペトリ皿の滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に入れます(外部汚染を避けるために蓋を閉じます)。
4. 3%イソフルラン/_O2 混合物を用いて誘導チャンバー内でマウスを麻酔する。動物が簡単に操作でき、何の苦労もなく鼻マスクに移されるのに十分なほどリラックスしていることを確認してください。
5. マウスを誘導チャンバーから麻酔鼻マスクに移し、イソフルランレベルを1.5%〜2%イソフルラン/_O2 混合物に下げる。足の離脱テストを実行して完全な麻酔を確認します。
6. 足引き抜き試験を行うには、爪または鈍い端の鉗子を使用して動物の足をしっかりとつまみます。筋肉反射がない場合は、動物を無意識と見なし、外科的準備を進めてください。動物操作の前にこの試験を行い、麻酔および外科的処置中に定期的に繰り返して麻酔を確認する。
7. 角膜脱水を防ぐために眼軟膏を塗布する。
8. 4^番目の 乳腺の周囲をカミソリの刃で剃ります(図2A)。4^番目の 乳首を目印にしてください。粘着テープを使用して緩んだ毛を取り除きます。
   注:あるいは、脱毛クリームを使用して毛を取り除くこともできます。
9. 露出した皮膚を80%エタノールまたはポビドンヨードで消毒し、1.5%イソフルラン/_O2 混合物を使用して鼻を麻酔鼻マスクに入れて、マウスを背中の滅菌手術領域に置きます。
10. マウスの前肢と後肢を紙テープで固定します。
    注:麻酔をかけ、回復中のマウスを、手術中および手術後に、できるだけ加熱パッドの上に置いておきます。
11. 手術領域を露出させたまま、マウスを覆うために、予めカットされた滅菌手術用ドレープまたはガーゼを使用してください。

3. R.MIW移植(推定タイミング:30分)

1. 足の離脱試験を実施して、動物が適切に麻酔されているかどうかを確認します。細かいグレフ鉗子で皮膚をやさしく持ち上げ、4番目の乳首を配向点として、4^{番目の乳腺}脂肪パッドの上に、小さなスプリングハサミを使って10~15mmの対角切開を行います(図2A)。腹膜や乳腺を切ったり傷つけたりしないでください。
2. リンパ節または腫瘍病変の位置を含む乳腺組織の巨視的特徴に基づいて関心領域(ROI)を定義し、切開に関してROIを中心に保つようにする。
3. 切開ラインの周囲に最大5〜8mmの鈍い解剖を使用して、乳房脂肪パッドおよび下層の組織層から皮膚を分離し、R.MIWフレームにフィットするポケットを作成する(図2BI)。
4. 滅菌鉗子を使用してR.MIWを拾い上げ、切開部が窓を挿入するのに十分な大きさであるかどうかをテストします。必要に応じて、R.MIWが収まるまで切開部をわずかに拡大します。
5. R.MIWを取り外し、5-0シルク縫合糸(編組、非再吸収性)を使用して、切開部の周囲に財布状の縫合糸を置きます。切開部の尾端から始めて、切開部の縁から皮膚の外側から内側に1〜2mmの縫合糸を置く。
6. 切開部に沿って約5mm上に移動させ、縫合糸を皮膚の内側から外側に通す。切開部の縁に沿ってこの手順を繰り返し、それによって5〜6個のループからなる円形の縫合糸を作成する(図2BII)。縫合糸の最終出口は、最初の入り口から約2〜5mm離れた場所に配置する必要があります。
   注:縫合糸を切開部の端に近づけすぎないように注意してください, これは、皮膚の裂け目の危険性を高めるので、.縫合糸を切開部の端から遠すぎると、余分な皮膚とR.MIWの溝との間の感染のリスクが高まる。
7. R.MIWを切開部内に収め、グレーフ鉗子を使用してR.MIWの溝に皮膚を慎重に配置します。縫合糸のループを外側に残してください。
8. 財布ひも縫合糸のループを引っ張り、縫合糸の両端を優しく引っ張ってR.MIWの溝の縫合糸を締め付けます(図2BIII)。外科用結び目で結び、余分な糸を切り取ります。
9. 爪楊枝を使用してR.MIWの内側の縁にワセリンを塗布し、下層の組織を避けるようにしてください。滅菌鉗子または2本の指先で窓枠を慎重に下方に押し、蓋をR.MIWフレームに差し込みます(図1B)。これにより、乳腺組織とR.MIW蓋との間の空気の量を避けることができます。
10. 薄い鉗子の先端を蓋の腕の穴に通し、蓋を時計回り(約5°)にねじって蓋を締めます(図1C および 図2BIV)。
11. R.MIWの蓋を締めた後に空気が残っている場合は、滅菌インスリン針を使用して余分な空気を取り除きます。皮膚を通して乳腺組織と蓋の間の空洞に針を導入し、プランジャーをゆっくりと引き抜くことで、乳腺組織とR.MIW蓋との間に真空を作り出す。
12. ブプレノルフィン(滅菌0.9%NaClで希釈した0.1mg/kg)などの鎮痛を皮下注射で手術後に投与する。手術後8時間および16時間でブプレノルフィンによる皮下注射を繰り返す。
13. マウスをケージに戻して回復し、完全に目を覚ますまで注意深く監視するか、ステップ4に進んですぐにイメージングします。
14. この術後の段階では、呼吸、反応性、行動、姿勢、体重などの重要なパラメータに基づいて、不快感や合併症の兆候がないかマウスを注意深く監視します。炎症や壊死の兆候がないか、窓を囲む皮膚を注意深く監視してください。合併症が起こらなければ、R.MIWは移植後数週間にわたって反復IVMセッションを可能にする。

図2:外科的処置と窓移植の概要 (A)雌マウスの4^番目の 乳首付近に斜め切開を行い、鈍的解剖により皮膚および下層組織を切断する。(b)鼠径リンパ節および脂肪パッドの形状は、(I)の組織の正しい向きに使用することができる。切開部(II)の周りの皮膚に財布紐縫合糸を置き、窓枠に嵌め込んだ後、縫合糸を溝に締め付けて窓枠を固定し、手術用結び目(III)で固定する。最後のステップは、窓枠(IV)への蓋の挿入とロックです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. R.MIWによる反復生命内顕微鏡検査

注:ここで説明する反復IVM戦略は、電動ステージと35.8°Cの暗い気候チャンバーを備えた逆多光子共焦点システム用に最適化されました。

1. 3%イソフルラン/_O2 混合物を用いて誘導チャンバー内でマウスを麻酔する。足の離脱テスト(ステップ2.6で説明)を実行して意識喪失を確認します。イメージングセッション中に角膜脱水を防ぐために眼軟膏を塗布する。
2. 縫合糸の安定性や蓋の損傷の可能性など、R.MIWフレームと蓋の状態を調べます。蓋に損傷がある場合は、手順5で説明したように蓋を交換することができます。
3. マウスを予熱(37°C)したカスタムメイドのイメージングボックス(図3A)に移し、マウスをヘッド付きでノーズコーンに置きます。イメージングボックスは、顕微鏡の自動ステージ内に収まるフレームで構成されています。フレームは、R.MIWの直径の穴が開いたカスタムメイドのインレイを保持するように設計されています(図3A)。
4. ノーズコーン付きの入口は、ボックスの前面に接続され、2%〜3%のイソフルラン_{/ O2}混合物を使用してイソフルラン気化器ステーションに取り付けられます。出口は麻酔薬清掃ユニットに接続され、循環を確保し、箱内のイソフルランの蓄積を防止する。撮像ボックスは、透明な蓋を用いて閉じることができる。
5. R.MIWがイメージングボックスインレイの穴に収まるように、マウスをインレイの上に置きます(図3A)。パラフィルムと紙テープをマウスの背中に貼り、マウスを安定させ、呼吸による組織運動を軽減します。
6. 蓋で撮像ボックスを閉じ、顕微鏡のステージに撮像ボックスを挿入します。
7. 画像化セッションの過程でイソフルラン用量を徐々に減らし、安定しているが表面的な麻酔(典型的には1.5%〜0.8%のイソフルラン/_O2 混合物の間)を維持する。
8. 以下に説明するように、イメージング中に適切な栄養を与えます。
   1. イメージングセッション<3時間の場合、水和のために200〜300μLの滅菌PBSをマウスの皮下に注射する。
   2. イメージングセッション>3時間の場合は、以下の手順に従ってください。
      1. 長期イメージングのために、マウスに栄養素を注入する。このために、アミノ酸およびグルコースを含む市販の滅菌注入混合物を使用する。マウスの首に柔軟な針を皮下に置き、紙テープで固定します。
      2. 調製した栄養ミックスを含む10mLシリンジを柔軟なシリコンチューブに取り付け、チューブの端に達するまで栄養ミックスを押し通します。
      3. シリコーンチューブを柔軟な針に接続します。チューブの端を取り、イメージングボックスの穴の1つを通して置きます(内側から外側へ、ニードル取り付け側をボックスに残します)。
      4. 30分ごとに50μLの注入溶液を注入する。
9. イメージングボックスを顕微鏡のステージに固定し、顕微鏡の落射蛍光モードを使用して関心領域を定義します。
10. マウスのモデルに応じて、必要な顕微鏡設定を適用します(図3B)。血管構造、コラーゲンパターン(第二高調波生成によって視覚化される)、および鼠径リンパ節を含む他の安定な解剖学的構造は、ランドマークとして使用され得る。12ビットの深さで倒立多光子共焦点顕微鏡を使用し、1.0〜4.0μmの範囲のZステップサイズ(150〜800μmの範囲の総zスタック)を使用して25倍の水対物レンズを使用して画像を取得します。次の標準設定を適用します: 1024 x 1024 形式、600 Hz スキャン速度、双方向モード。
11. 860nmの励起波長を用いて第2高調波発生を行い、425-435nmで検出することにより、コラーゲンI線維を可視化する。異なる蛍光色素についての励起および検出波長を 表1に示す。

表 1.この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

12. イメージングソフトウェアナビゲータモードで スパイラル 機能を使用して、大きな概観タイルスキャンを生成し、組織の参照マップを作成します(図3B)。スパイラルオーバービュー内のROIを定義し、上下のZ平面を定義してZスタックを決定します。 [開始 ]を押して、組織の詳細な3次元(xyz)または4次元Zスタック(xyzt)を取得します。
    メモ: イメージング実験全体を通して、マウスを注意深く監視する必要があります。長時間のイメージングセッションには、パルスオキシメータと温度プローブをお勧めします。マウスの呼吸は規則正しく、同じペースでなければなりません。マウスがあえぎの兆候を示し始めたら、イソフルランの量を減らす必要があります。
13. 各イメージングセッションの最後に、完全に目を覚ますまでマウスを加熱パッドの上に置きます。マウスが不快感や運動性の低下の兆候を示す場合は、ケージを加熱パッドに長時間保管し、通常のチャウの代わりに栄養ゲルを提供してください。
    メモ:イメージングセッションの合間には、食物や水の消費量の減少、急速な呼吸、動きの減少、振戦、異常な身体の姿勢、または手入れの行き届いていない毛皮などの不快感の兆候がないか、マウスを注意深く監視する必要があります。不快感の明らかな兆候がある場合は、動物福祉に関する機関のガイドラインに従い、人道的なエンドポイントに達したら実験を終了します。
14. イメージングセッションを繰り返すたびに手順4.1~4.12を繰り返し、概要タイルスキャンを使用して、複数の時点にわたって同じ位置をたどります(図3B)。イメージングの頻度は、研究の質問と研究プロセスのタイミングに依存し、典型的には、イメージングセッションから1日2回から週に1回までさまざまです。
15. 所望の実験期間の終わりに、イソフルランによる深部麻酔を用いて移植されたR.MIWで動物を安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行う。所望により、さらなる エクスビボ 分析のために目的の器官を解剖する。
16. あるいは、将来の in vivo 分析のために動物を生きたままにしてください。その場合は、R.MIWを握っているポーチ縫合糸をスプリングハサミで切って外し、鈍い鉗子を使って窓の輪をマウスの皮膚から慎重に外します。以前に窓を保持していた皮膚の縁をきれいにし、単純な連続縫合糸(ポリグリコール酸などの吸収性材料)で進める。
17. 皮膚が閉じられたら、開始と終了縫合糸を2つの正方形の結び目(4回投げ)で結びます。組織虚血を最小限に抑えるために、結び目は皮膚縁部の血流を可能にするのに十分緩くなければならない。炎症を防ぎ、皮膚の治癒を促進するためにポビドン - ヨウ素で創傷を消毒する。

図 3: 縦方向の IVM ワークフロー (A)典型的な複数日のIVM実験の概略図。(B)成体乳腺内の腫瘍形成領域のイメージング。各イメージングセッションの前に、低解像度の概要タイルスキャン(トップパネル)は、その後のイメージング日にわたって関心のある領域の識別を容易にすることができる。コラーゲンIパターン(第2高調波生成、マゼンタ)、組織構造、および蛍光タンパク質で差次的に標識された細胞のパターン(緑、黄、赤で描かれている)を使用して、同じ組織領域をたどることができます。スケールバーは、1 mm (概要タイルスキャン) と 100 μm (下部パネル) を表します。(C) R26-紙吹雪 レポーター構築物の模式図。タモキシフェン誘導クレ組換えにより、紙吹雪コンストラクトは確率的に再結合し、4つの蛍光色素(NGFP、YFP、RFP、またはmCFP)のうちの1つを発現させる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

5. イメージングセッション間のR.MIWの蓋の開閉

1. 滅菌手袋を使用して滅菌を維持し、マウスと接触するすべてのアイテムを滅菌します。手術前のオートクレーブ手術器具(詳細はステップ2を参照)。
2. 加熱パッドの電源を入れ、マットを滅菌ドレープで覆い、3%のイソフルラン/_O2 混合物を使用して誘導チャンバー内でマウスを麻酔します。足の離脱反射テストを実行して適切な麻酔を確認します。
3. マウスを誘導チャンバから麻酔鼻マスクに移し、イソフルランレベルを1.5%〜2%イソフルラン/_O2 混合物に低下させる。
4. 蓋の腕の穴に細い鉗子の先端を置き、蓋を反時計回りにひねってふたを緩めます。必要に応じて、蓋の緩みを容易にするために、窓に予熱した滅菌PBS(37°C)を塗布する。
5. R.MIWの蓋を滅菌PBSを含む滅菌皿に入れ、さらに使用するまで置く。蓋のカバーガラスをデミ水で拭き取り、続いて80%エタノールで拭きます。さらに使用するまで、蓋を滅菌PBSに入れたままにしてください。
6. 露出した組織が乾燥するのを防ぐには、滅菌PBSを組織表面に数滴加えます。
7. 露出した組織に目的の任意の物質または細胞を適用または注入し、最大容量50μLを使用することができる。液体が組織に吸収されるまで数分待ちます。あるいは、無菌の鈍い鉗子を使用して組織を操作または再配置して、特定のROIの画像化条件を最適化することもできます。
8. R.MIWの内縁にワセリンを塗布し、基礎となる組織を避けるようにしてください。手順 3.9 の説明に従って蓋を R.MIW フレームに差し込み、薄い鉗子の先端を蓋の腕の穴に通し、蓋を時計回り (約 5°) にねじってふたを締めます。

結果

乳腺の異なる発達段階における乳腺上皮細胞の増殖動態を研究するために、記載されたプロトコールが実行された。R.MIWの設計を図 1に示し、R.MIWを移植する手順を 図2にまとめたものです。R.MIWは、乳腺と皮膚との間に外科的に移植される。縫合糸は、窓のリング内に保持し、マウスが縫合糸を引っ張るのを防ぐために使用されます(図2)。R.MIWを保持する縫合糸は、低アレルギー性、柔らかい質感、および取り扱いが容易な非吸収性シルクで作られています。R.MIWリングはチタンでできており、移植後の炎症や壊死を促進しない最も生体適合性の高い材料の^{1つである21}。無菌状態に従い、縫合糸がうまく実行される場合、R.MIW乳腺移植は術後合併症のリスクが低い。さらに、腹部画像窓移植²²とは異なり、R.MIW移植は、乳腺が重要な器官ではなく、倫理的プロトコルに規定された限界まで毎日の画像化を可能にするため、マウスの生存のための制限因子ではない。窓の移植の持続時間を制限する唯一の要因は、皮膚の恒常性ターンオーバーであり、これは最終的に4〜6週間後に縫合糸が脱落することにつながる。したがって、縫合糸の安定性を定期的に検査することが重要です。必要に応じて、縫合糸を除去し、無菌条件下で(ステップ3.5〜3.8で説明されているように)新しい財布紐縫合糸で置き換えて、窓の安定性を安心させることができる。

複数日イメージングアプローチを使用する場合の大きな課題は、連続した日にROIを追跡することです。この目的のために、ROIを選択する前にクイックオーバービュースキャンを含めることができます(図3B)。コラーゲンネットワークシグナル(第2高調波生成によって視覚化される)、組織構造、色素または蛍光タンパク質で差次的または確率的に標識された細胞の局所パターンなど、複数の組織ランドマークを使用して組織の同じ領域をたどることができます(図3B)。この代表的な例では、MMTV-PyMTの第4乳腺にR.MIWが移植された 。R26-CreERT2^het;R26-触知可能な腫瘍形成の開始時の紙吹雪^ヘット 雌マウス。続いて、1.5mgのタモキシフェンの注射によって確率的組換えが誘導され、いくつかの細胞においてConfetti構築物の再結合を生じた(図3C)。組換え腫瘍細胞を20日間追跡した(図3B、C)。連続した日にわたる乳腺の同じ領域の画像化が妨げられる場合、無菌環境で窓を開き(ステップ5.1で説明したように)、さらに片付け、組織を再配置して視認性と画像取得を改善することができます(図3A)。

この方法を用いて、思春期に発達中の乳腺を単一細胞レベルで追跡した。R.MIWを介した反復IVMを 、R26-CreERT2^ヘットを用いて実施した。R26−mTmG^het雌マウスの4〜6週齢の間に、全ての細胞が膜tdトマトで標識されている(図4A)²³。マウスに低用量のタモキシフェン(0.2mg/25g体重)を注射し、その結果、mTmG構築物の散発的な組換えが起こり、乳腺を含むすべての組織の一部の細胞において赤色から緑色への変化を引き起こした(図4B)。同じROIを数日間にわたって再検討し、乳管伸長および乳管分岐(図4C)を含む乳腺内の形態学的変化を細胞分解能で視覚化した。重要なことに、確率的細胞標識と複数日IVMのこの組み合わせにより、細長い管と分岐する管を囲む間質内の単一細胞のダイナミクス(図4D)や鼠径リンパ節内の細胞ダイナミクス(図4E)など、乳管環境の動的変化を視覚化することもできます。

図4:思春期分岐形態形成の複数日IVM。生後4〜6週のR26-mTmGマウスに、R26-mTmG対立遺伝子のCre媒介性組換えをもたらす低用量のタモキシフェンを注射し、発達中の乳腺の動的変化を追跡するために1日目、3日目、および5日目に画像化した。(b)非組換え条件下で膜tdトマト(mT)の遍在的発現をもたらすR26−mTmGマウス構築物の概略図。Cre媒介組換えにより、mTは膜eGFP(mG)発現のために切り替えられる。(C)R26-CreERT2のR.MIWを通して画像化された数日間にわたる細長く枝分かれした乳管の3Dレンダリング;6週齢のR26-mTmGメスマウス。(D)分岐先端(上部パネル)および伸長分岐(下部パネル)の単一Z平面画像。mT は赤、mG はシアンで表され、スケールバーは 100 μm (A と B) を表します。間質内の単一細胞は、白いアスタリスクで強調表示されている。間質内の単一細胞を強調するためにシグナル強度を手動で増加させ、乳腺上皮細胞のわずかに露出過剰の外観をもたらしたことに留意されたい。(e)R26-CreERT2の鼠径リンパ節の代表的な画像;R26-mTmG メスマウスを R.MIW で画像化し、1 つの Z 平面の概要タイル スキャン (左パネル)、ズーム画像 (右パネル)、および 3D レンダリング (下) を表示します。第2高調波生成(コラーゲンI)は緑色、mTは赤色、mGはシアンで示されている。スケール バーは、500 μm (概要タイルスキャン) と 100 μm (ズーム画像) を表します。図パネルCおよびDは、Messalら²から改変されている。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

同様に、成人乳腺では、提案されたR.MIWアプローチにより、妥協のない視認性で数日間にわたって同じ乳管構造を視覚化することができます。Cdh1-mCFP(Ecadherin-mCFP)マウスモデルのような、あまり明るくない蛍光レポーターモデル²⁴を用いても、細胞分解能での乳管安定性および微妙な形態学的変化の可視化を可能にする(図5)。3日目から5日目の間の視認性は、組織再配置後に有意に改善されたことに留意されたい(図5)。

図5:成体乳腺の複数日イメージング。成体 雌 Cdh1-mCFP (シアン、エカドヘリン陽性管腔細胞発現をマーク)マウスの乳腺管構造の3Dレンダリング画像を連続して複数日間にわたって撮影。コラーゲンIパターン(第2高調波生成、マゼンタ)を用いて同じROIをたどり、 Cdh1-mCFP シグナルを用いて乳管(管内)細胞をマークした。なお、3日目以降の視認性は、R.MIW蓋の開放および組織の位置変更により改善された。スケール バーは 100 μm を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ホルモン周期中の乳腺上皮細胞の増殖性不均一性を単一細胞レベルで評価するために、KikGRタンパク質の遍在的な発現を有する光変換可能なキクメグリーンレッド(KikGR)レポーターマウスモデル²⁵、²⁶を使用した。KikGRは、紫色光に曝露すると緑から赤への変換を受ける明るい蛍光色素分子であり、赤/緑の比は細胞²の増殖活性の代理として使用することができる(図6A、B)。R.MIWアプローチを用いて、成乳腺の乳管樹内の同じ細胞を数日間にわたって追跡し、管樹全体に以前は予想外の増殖性の不均一性を見出した(図6C)。高増殖性および低増殖性細胞は、異なる変換領域にわたって均等に分布していた(図6C、D)。驚くべきことに、局所レベルでは、隣接する細胞は赤/緑の比に大きな違いを示した(図6C、D)。光変換の10日後に異なる細胞の赤/緑の比を(増殖活性の代理として)定量化すると、同じ乳管微小環境内のいくつかの細胞の希釈率が高度に変動することが明らかになった(図6E)。これらのデータを総合すると、成体乳腺内の顕著な局所的な増殖性の不均一性、および同時に、世界的に均一な離職率を明らかにしている。

図6:KikGRマウスモデルを用いて成体乳腺における増殖性不均一性の縦IVM 。 (A)KikGRマウスを紫色光への曝露前後の0日目に画像化した。イメージングセッションは、変換後の2日目、6日目、および10日目に繰り返されました。(B)増殖後のKikGR乳腺上皮細胞の光変換(左パネル)および増殖なし(右パネル)の時間の関数としての仮説的転帰の概略描写。(C)乳腺の同じ領域をR.MIWを通して10日間にわたって画像化した。より小さい領域は0日目に光変換され、時間の経過とともにキクメ赤色シグナルの同様の希釈速度を示し、上皮全体で等しい代謝回転速度を示した。(D)パネルCに示された領域のズーム画像(単一のZ平面)は、光変換後6日目および10日目の細胞レベルでの増殖性不均一性を示す。スケールバーは、100 μm(パネルC)および10 μm(パネルD)を表す。(E)3つの光変換領域におけるランダムに選択された細胞(n= 48細胞)の赤/緑比の定量化。高い赤/緑比は低い希釈率および低い増殖活性を示し、一方低い赤/緑色比は高い希釈率および増殖を示す。図パネルC−Eは、Messalら ²から改変されている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

R.MIWは、そのネイティブで最小限の破壊された環境での健康および罹患した乳腺の縦方向イメージングを可能にし、多様な発達段階で乳腺の反復視覚化を可能にする。R.MIW計画では、実験中の任意の時点でウィンドウを開くことができます。関心のある組織への長期的な視覚的アクセスは、例えば、カバースリップ上の細胞破片の蓄積によって妨げられ得る。このような場合、R.MIWは、画像化セッションの前または直後に開封して、目に見える組織領域および蓋全体の洗浄を可能にすることができる。取り外し可能な蓋はまた、組織の操作だけでなく、特定の阻害剤および療法、標識色素、または関心のある特定の細胞タイプなどの物質の局所適用を可能にする。

この方法は、1つのイメージングセッションに限定された前述の乳房皮膚フラップ手順⁴、⁷、^8、13の限界を克服し、分岐形態形成(図5)、恒常性組織代謝回転(図6)、または細胞レベルでの腫瘍増殖(図3B)などのプロセスを視覚化することができる。).しかし、同時に、R.MIWは、以前に公開されたMIW^3,18および他のすべてのイメージングウィンドウ^20,22と比較して、R.MIWの大きな資産を構成するイメージングセッション間の組織の局所的な操作を可能にする。R.MIWを開くときは、感染源を防ぐために常に無菌状態を維持することが重要です。無菌環境でR.MIWを開く能力により、すべてのイメージングセッションの前にイメージング条件を最適化することができ、目的の組織への長期的な視覚的アクセスが大幅に改善されます。具体的には、脂肪細胞が豊富な間質に埋め込まれている乳腺において、これは大きな価値がある。さらに、交換可能な蓋は、IVM実験を終了させることなく、治療薬、異なる細胞タイプ、標識色素、画像誘導マイクロダイセクション、または組織の他の局所操作の局所投与を一意に可能にすることができる。例えば、腫瘍開始を研究するために、このROIがR.MIWリングを介してアクセス可能である限り、特定の癌細胞集団を、決定されたIVM時点および正確な乳腺位置で管状樹または間質に直接注入することができる。腫瘍の進行を研究するために、IVMセッション中に特定の癌細胞集団(特定の場所、特定の微小環境、または特定の挙動を有する)を光マーキングし、続いてR.MIWの開封後に蛍光解剖顕微鏡を用いて微小解剖することができる。単離された細胞は、(単一細胞)mRNAシーケンシングなどの下流分析のためにさらに処理することができます。このアプローチを用いることで、生体内細胞の挙動を分子発現プロファイルに結びつけることができる。R.MIWによって可能になる局所薬物投与の利点は、組織を治療の前および直後に画像化することを可能にする。マウスをイメージングボックスから取り出し、R.MIW蓋を開けた後に局所薬物投与を行うのに必要な間隔は数分で行うことができ、これにより速効性薬物の即時段階捕捉が可能になる。

我々は、R.MIWを介した乳腺のIVMが、多くの異なる蛍光レポーターマウスモデルと互換性があることを示す。脂肪が豊富な環境は画像化が困難なため、明るい蛍光色素の使用をお勧めします。しかし、ここに示すように、mCFPのようなあまり明るくない蛍光色素であっても、最適なイメージング条件でR.MIWを介して可視化することができます。必然的に、脂肪パッドは、より深い管構造のイメージングを排除し、より表面的なダクトへのイメージングを制限する。各IVM実験の開始時に低解像度の概要画像は、高解像度イメージングに十分に表面的な目的のダクト構造を特定するのに役立ちます。局所組織操作、結合組織の除去、またはR.MIWを開いた後の脂肪組織の再配置は、脂肪組織によってオーバーレイされる特定のROIについてIVMを最適化することができる。これは、これらの操作を実行できず、ウィンドウ自体を完全に削除する必要がある以前のすべてのウィンドウ設計に対する重要な利点です。具体的には、鼠径リンパ節の可視化のために、光散乱を低減し、高解像度イメージングを可能にする、上層の脂肪組織を穏やかに除去することが推奨される。組織を操作するときは、IVM実験中に研究されているプロセスに影響を与える可能性があるため、常に無菌状態を維持し、出血や組織への重大な損傷を防止してください。

R.MIWはチタンでできており、関節や骨板などの硬組織を置き換えるために臨床現場で一般的に使用されている材料です。チタンは、その軽量で不活性な特性²¹を含む、スチール窓よりもいくつかの利点を有する。最近、フレキシブルシリコンウィンドウ²⁰を含む新規な画像化ウィンドウタイプを生成するために、いくつかの他の材料が使用された。R.MIWとは対照的に、フレキシブルウィンドウは移植に縫合糸を必要とせず、ほぼすべての解剖学的位置、特に柔らかく壊れやすい組織の場合に適しています。シリコン窓は、その軽量で変形可能な性質のために動物の運動性への影響を最小限に抑え、急速な組織膨張および成長を研究する実験におそらくより適している²⁰。チタン版に対する別の利点は、シリコン窓が、磁気共鳴画像化^20,27を含む他の画像化モダリティと互換性があることである。ただし、対物レンズは 0.17 mm のガラスカバースリップに最適化されていることに留意することが重要です。さらに、乳腺組織は呼吸運動の影響を受けやすく、特に倒立顕微鏡を使用する場合、フレキシブルウィンドウを使用して制限することは困難です。呼吸アーチファクトは、R.MIW設計とイメージングボックスのインレイへのR.MIWの固定によって最小限に抑えられます。その結果、提案されたR.MIWセットアップを使用して取得された画像は、呼吸アーチファクトのために歪むことはありません。しかしながら、組織局在化における軽微なドリフトが生じ得、これは通常、緩やかであり、取得後運動補正ソフトウェア²⁸を用いて補正することができる。IVM技術^2,20のツールボックスの増加に伴い、各実験の特定の要件は、最終的に、関心のある組織のin vivo可視化の最良の方法を決定するでしょう。異なる窓設計には異なる長所と短所があり、研究課題、利用可能な顕微鏡のセットアップ、必要な空間的および時間的分解能、および研究プロセスの総時間スパンに応じて、最適なアプローチを決定する必要があります。

要約すると、R.MIWは、乳腺の発達、恒常性、および疾患中の細胞動態の高解像度特性評価を数日から数週間にわたって促進する。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.9% NaCl	BD	306573	その他のブランドが利用可能
10 mm 丸型カバーガラス	フィッシャー 科学	10696365	その他のブランドが利用可能
5-0 編組シルク縫合	エチコン	W580
80% エタノール	自家製	NA
麻酔誘導ボックス	Kentscientific	VetFlo-MSEKIT
ブプレノルフィン(獣医学®)	Ecuphar	NA
コットンチップ(滅菌)	フィッシャー科学	13113743	他のブランドが利用可能
シアノアクリレート接着剤	ロックタイト	NA	利用可能な他のブランド
目の軟膏	Duratears	NA
フレキシブルバタフライニードル	Greiner Bio-One	450120	利用可能な他のブランド
Graefe鉗子(鈍い)	ファインサイエンスツール	11051-10
加熱パッド	Kentscientific	RightTemp Jr.	利用可能な他のブランド
イメージングボックス	カスタムメイド	NA
注入栄養混合物	ブラウン	・ニュートリフレックス・スペシャル 70/240
インスリン注射器	BD	324911	その他のブランド
自動ステージ付き倒立多光子顕微鏡	ライカ・マイクロシステムズ	NA
イソフルラン気化器	ケントサイエンティフィック	VetFlo-1231K
ニードルホルダー	ファインサイエンスツール	12510-14
パラフィルム	シグマ・アルドリッチ	P7793	半透明テープ
紙テープ テ	サ	NA
ワセリン ワセ	リン	NA
カミソリの刃	フィッシャー サイエンティフィック	11904325	その他のブランド
シリコンチューブ	ソリューションエラストメア	NA	家庭用品
春はさみ(小)	ファインサイエンスツール	15018-10
滅菌PBS	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10010023
シリンジ(10ml)	BD	305482	その他のブランド
薄い鉗子	ファインサイエンスツール	11413-11
乳房イメージングウィンドウ	用チタン蓋カスタムメイド	NA
チタン乳房イメージングウィンドウカスタム	メイド	NA
木製スティックつまようじフィ	ッシャー科学	NC1678836	他のブランドが利用可能