巨大な単層小胞内の再構成された細胞骨格の迅速なカプセル化

脂質二重層コンパートメントは、密閉された有機反応および膜ベースのプロセスを研究するためのモデル合成細胞として、または薬物送達用途におけるキャリアモジュールとして使用される^1,2。精製された成分を用いたボトムアップ生物学は、タンパク質や脂質などの生体分子間の特性や相互作用を探求するために最小限の実験システムを必要とする^3,4。しかし、この分野の進歩に伴い、生体細胞の条件をよりよく模倣するより複雑な実験システムの必要性が高まっています。GUVsへのカプセル化は、変形可能で選択的に透過性の脂質二重層および閉じ込められた反応空間を提供することによって、これらの細胞様特性のいくつかを提供することができる実用的なアプローチである。特に、細胞骨格系のインビトロ再構成は、合成細胞のモデルとして、膜区画⁵への封入から利益を得ることができる。多くの細胞骨格タンパク質は細胞膜と結合し、相互作用する。ほとんどの細胞骨格集合体は細胞全体にまたがる構造を形成するので、それらの形状は細胞サイズの閉じ込め⁶によって自然に決定される。

GUVを生成するために、膨潤⁷、⁸、小小胞融合⁹、10、エマルジョン移送11、¹²、パルス噴出13、および他のマイクロ流体アプローチ^14、15など^、異なる方法が使用される。これらの方法はまだ利用されていますが、それぞれに限界があります。したがって、GUVカプセル化の高収率を伴う堅牢で直接的なアプローチが非常に望ましい。自発的膨潤および電気膨潤などの技術がGUVの形成に広く採用されているが、これらの方法は、主に、特定の脂質組成物¹⁶、低塩濃度緩衝液¹⁷、より小さい封入剤分子サイズ¹⁸、および大量の封入剤を必要とする。複数の小さな小胞をGUVに融合させることは、本質的にエネルギー的に好ましくないため、荷電脂質組成物⁹および/またはペプチド¹⁹または他の化学物質などの外部融合誘導剤における特異性を必要とする。一方、エマルジョン転写およびマイクロ流体法は、二重層形成後の界面活性剤および溶媒除去を介した液滴安定化をそれぞれ必要とし得る^18、20。パルス噴射などのマイクロ流体技術における実験セットアップおよび装置の複雑さは、さらなる課題²¹を課す。cDICEは、エマルジョン移送^22、23を支配する同様の原理に由来するエマルジョンベースの方法である。水溶液(外液)と脂質-油混合物は、脂質飽和界面を形成する回転円筒チャンバ(cDICEチャンバ)内で遠心力により成層化される。回転するcDICEチャンバ内に脂質単層水性液滴をシャットリングすると、液滴が脂質飽和界面を横切って外側水溶液^22、24に入るにつれて二重層のジッピングが生じる。cDICEアプローチは、GUVカプセル化のための堅牢な手法です。提示された改変法では、有意に短い封入時間(数秒)を有するcDICEに典型的な高いベシクル収率が達成されるだけでなく、時間依存プロセスの観察を可能にするGUV生成時間(例えば、アクチン細胞骨格ネットワーク形成)が有意に短縮される。プロトコルは、開始からGUVの収集とイメージングまで約15〜20分かかります。ここで、GUV生成は、アクチンおよびアクチン結合タンパク質(ABP)を封入するための修飾cDICE法を用いて説明される。しかし、提示された技術は、生体高分子の組み立てから無細胞タンパク質発現、膜融合ベースの貨物輸送まで、幅広い生体反応および膜相互作用をカプセル化するために適用可能である。

1. 油-脂質-混合物の調製

メモ:この手順は、クロロホルムの取り扱いに関するすべての安全ガイドラインに従って、ヒュームフード内で実行する必要があります。

1. 15 mLのガラスバイアルに0.5 mLのクロロホルムを入れます。88 μL の 25 mg/mL のジオレオイル ホスホコリン (DOPC)、9.3 μL の 50 mg/mL コレステロール、および 5 μL の 1 mg/mL のジオレオイル-ホスホエタノールアミン-リサミン ローダミン B (ローダミン PE) ( 材料表を参照) を 15 ml のガラス バイアルに加えます。
   注:シリコーンオイル/鉱物油中のDOPCおよびコレステロールの最終モル分画は、それぞれ69.9%および30%である。20〜30モル%コレステロールは、提示された技術^25、26を用いて生成されたGUVの膜流動性および安定性のために最適化された濃度であることが確立されました。生理学的には、これらの値は、哺乳動物細胞原形質膜6において見出されるコレステロール濃度範囲内に十分収ま^っている。脂質ストックはクロロホルム中で溶液として取得され、-20°Cで保存される。 脂質ストックバイアルは、開封する前に室温に順応させる必要があります。
2. 7.2 mL のシリコーンオイルと 1.8 mL の鉱物油を 2 番目の 15 mL バイアルにピペットに入れます ( 材料表を参照)。一般的に、これは主に鉱物油が再利用される場合、低湿度のグローブボックス内で行う必要があります。
3. 最大回転速度(3200rpm)で10秒間ボルテックスでオイルを混合し、混合物をリピッドインクロロホルム混合物を含むバイアルに加え、直ちにボルテックスミキサーに置く。最大回転速度(3200rpm)で10〜15秒間の渦。得られた油中脂質混合物は、脂質が油中に完全に溶解するのではなく、むしろ小さな凝集体²⁴として分散されるため、わずかに白濁しているはずである。
4. 油中脂質分散液を、80Wの超音波パワーおよび室温で40kHzの動作周波数で30分間浴超音波処理機( 材料表を参照)に入れる。混合物を直ちに使用するか、4°Cで最大24時間保存する。

2. 小胞生成

1. 黒い樹脂で作られた3Dプリントシャフト(補足ファイル1)( 材料表を参照)をベンチトップ攪拌プレートに取り付け、回転数を1200rpmに設定します。
2. 透明な樹脂で作られた3DプリントされたcDICEチャンバー(補足ファイル2)( 材料表を参照)をシャフトに取り付けます(図1A、B)。
3. アクチンとアクチン結合タンパク質(ABP)溶液を別々に20 μLの総量で調製する。
   1. 10%ATTO 488アクチンを含む球状アクチン緩衝液(Gバッファー)中に1〜10μMのアクチンを調製する( 材料表を参照)。
      注: 1x G バッファーは、5 mM のトリス塩酸、pH 8.0、および 0.2 mM の CaCl₂ を含みます。
   2. 糸状アクチン重合バッファー(Fバッファー)を加えて、氷上でアクチン重合を開始します。架橋剤を添加する前にアクチン重合を遅くするために溶液を氷上に保管する。
      注: 1x F バッファーには、10 mM のトリス (pH 7.5) に 50 mM の KCl、2 mM の MgCl₂、および 3 mM の ATP が含まれています。
   3. 氷上でアクチン重合の開始を可能にするまで15分間待ってから、目的の架橋剤を所望のモル比で添加する。カプセル化されるまで溶液を氷の上に保管してください。
   4. アクチン結合タンパク質(ABP)をマイクロチューブ内で別々に調製する(図1C)。
      注:このステップは、ABPsの組み合わせ(例えば、ミオシン、αアクチニン、ファシン、Arp2/3複合体)がアクチン25^、26、27と共にカプセル化される場合に行われる。このような場合、各ABPの所望の量は、そのストックから引き出され、ABP用に指定されたマイクロチューブに添加される。総溶液は20μLでなければならないので、総ABP混合物の所望の量が5〜6μLを超えないように、ABPのストックアリコートを調製しなければならない。ここでの代表的な結果で使用された唯一のABPはファシンであり、その調製は以下に述べられる。
      1. 1.75mg/mLのファシンストックから1.57μLのファシンをアリコートし( 材料表を参照)、ステップ2.7でアクチン溶液に直接添加する。これは、溶液中の2.5μMのファシンに相当する。
4. 7.5%の密度勾配媒体( 材料表を参照)をアクチン溶液に追加して、外側水相と内水相の間に密度勾配を作り、GUV沈降を容易にする。
5. 200 mM のグルコースの外側溶液 700 μL をチャンバーに分注します (図 1D、左)。
   注:内液の浸透圧はグルコースの濃度を決定する。これらの実験では、内液のオスモル濃度は〜200mOsmであるため、外側溶液として200mMグルコース溶液が使用される。
6. チャンバーの60%~80%が充填されるまで、十分な量の脂質-オイル混合物(チャンバーサイズに基づいて>3mL)をチャンバーに加えます(図1D、右)。脂質 - 油混合物と外側の溶液との間に界面が形成される。
7. ABP(ステップ2.3.4で調製)をアクチン溶液に移す。通常の100~1000 μLのピペットを使用して、700 μLの脂質-オイル混合物をアクチン-ABP混合物に直ちに移す(図1E、左)。ピペットを8回上下させて、直径7〜100μmの範囲の細胞サイズの脂質単層液滴を生成した(図1E、中央)。
   メモ: ステップ 2.7 は、カプセル化の前に actin ネットワークアセンブリを回避するために数秒で完了する必要があります。したがって、ステップを実行する前に、ピペットチップがすでにピペットに挿入されており、混合物を移送する準備ができていることを確認してください。
8. 同じ100〜1000μLのピペットを使用して、直ちにエマルジョン全体を回転チャンバに分配する。液滴は、油-外溶液界面で脂質単分子膜を横切ることによって脂質の第2の小葉を獲得し、それによってGUVを形成する(図1E、右)。
9. チャンバーを攪拌板から取り出し、脂質 - オイル混合物の大部分がチャンバの中央にある大きな開口部から排出されるように、廃液容器内のチャンバを傾けることによって脂質 - 油混合物の大部分を廃棄する。
   注:このようにして、脂質 - 油混合物はチャンバから引き出され、次のステップにおける脂質 - 油混合物と外側溶液との混合を避ける。
10. 蓋をユーザーの方に向けてチャンバーを持ちます。チャンバーの蓋を開け、チャンバーをユーザーの方にわずかに傾けます。GUVを含む外側溶液と脂質 - 油混合物との間の界面は、チャンバ開口部(蓋が位置する場所)から見える。
11. ピペットを使用して、GUVを含む十分な外側溶液を収集し、50〜300μLの外側溶液を96ウェルプレートに分注して、適切な密度のGUVを得た。
    注:このプロトコルに従って、合計約2 x¹⁰⁵ GUVがチャンバ内の外側溶液中に放出される。GUV分散度は定量化されなかった。しかし、GUVの約90%の直径は12〜30μmの範囲にあり、7〜50μmの範囲の任意の直径を有するGUVが集団中に見出すことができる。封入密度勾配培地、GUVサイズ、およびウェルプレート内の溶液深さに応じて、GUVが表面に落ち着くまでに2〜15分かかります。再構成されたアクチン束を有するGUVの収率は約90%である。

3. イメージングと3D画像再構成

1. 回転ディスク(またはレーザースキャン)共焦点ユニット、EMCCDまたはsCMOSカメラ、油浸60倍の対物レンズを備えた倒立顕微鏡のステージ上に96ウェルプレートを設置します( 材料表を参照)。
2. 任意の関心領域(ROI)に焦点を合わせ、0.5μmのzステップ間隔でROIからzスタック画像シーケンスを取得します。
   注: GUV は時間の経過とともに表面上でわずかにずれる可能性があるため、複数の蛍光色素分子が画像化されている場合、つまり、ATTO 488 アクチンおよび Rhod PE 画像をキャプチャするために、各 z レーンで一度に 561 nm および 488 nm の画像を一度に撮影する場合は、各 z 平面で多波長の画像セットをキャプチャすることをお勧めします。
3. 各 Z スタック イメージ シーケンスを.tiff形式で保存します。
4. 画像処理ソフトウェア (ImageJ/Fiji) で目的の画像シーケンスを開きます。最も強度の高い画像を特定します。「ctrl + shift + c」を押して明るさとコントラストウィンドウを開き、[ リセット]をクリックします。
5. ImageJ/Fijiメニューから 、スケールを分析>設定 に移動し、各画像ピクセルの既知の物理的距離とその単位を入力します。
6. ImageJ/Fiji メニューから [3D プロジェクトの画像>スタック] > 移動して、Z スタックから 3D イメージを再構築します。「投影方法」を 輝度ポイント、「スライス間隔(μm)」を 0.5に設定し、補間チェックマークを付け ます。既定のオプションは、残りの設定に使用できます。
   注: 一部の顕微鏡では z 間隔が較正されていない可能性があり、Z 方向への実際の動きは入力された Z 間隔 (つまり、0.5 μm) とわずかに異なる場合があります。このような場合、既知の直径を有する蛍光微小球などの3D較正試料を使用して、実際のz間隔を得ることができる。したがって、この値は 3D 投影の「スライス間隔 (μm)」として使用されます。

現在のプロトコールを用いて細胞骨格GUVの生成に成功したことを実証するために、GUVsにおけるファシン-アクチンバンドル構造が再構成された。ファシンはアクチンフィラメントの短い架橋剤であり、硬い平行配向アクチン束を形成し、 大腸菌 からグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質26として精製される。アクチン重合バッファー中の0.53μMのATTO488アクチンおよび密度勾配媒体中の7.5%を含む、5μMのアクチンが最初に再構成された。2.5μMの濃度でファシンを添加し、ファシン-アクチン混合物を封入すると、GUV中にアクチン束構造が形成された。ローダミンPE標識GUVsに封入されたアクチン束構造のZスタック共焦点画像配列を、封入の1時間後に捕捉した(図2A)。このプロトコールを用いて、カプセル化されたアクチン架橋剤、α-アクチニン、およびファシンの固有の競合および選別は、一緒になって、GUVサイズ依存的に異なるアクチンバンドルパターンを形成することが、以前に実証された26。

ここで紹介した修飾逆エマルジョンアプローチと同様に、従来のcDICEプロセスは、細胞骨格GUVを高収率で生成しますが、毎秒22,28ナノリットルオーダーの低流速で回転チャンバにタンパク質溶液を制御注入するためのシリンジポンプとチューブのセットアップが必要です。このアプローチでは、エマルジョンは回転cDICEチャンバ内で直接生成される。薄い毛細血管が油相に挿入される。タンパク質溶液をシリンジポンプを通して注入する。液滴は、水性外相に向かって移動する前に毛細血管先端で形成され、剪断され、そこでGUVに変わる、上記の方法と同様である。図2Bは、このアプローチを用いて反応混合物を封入する小胞を示す。反応混合物は、0.9μMのファシンによって束ねられた6μMのアクチンを含有する。ここでは、2つの方法とその結果は比較されていませんが、どちらも高い収率のGUVを生成することに注意してください。

図1:GUVを生成するための実験セットアップ (A)cDICEチャンバの上面図および側面断面図。(B)紡績室のセットアップの写真。(C-E)GUVの生成のための段階的な手順の概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:アクチンバンドル構造のカプセル化。 (A)画像は、GUVの代表的な蛍光共焦点スライス(左)およびアクチンおよび脂質チャネルの共焦点zスタックの最大突起(右)を示す。ファシン、2.5μM;アクチン、5μM(10%ATTO 488アクチンを含む)。スケールバー=10μm. (B)従来のcDICEを用いたアクチン束構造のカプセル化。この画像は、ファシンの存在下で形成された封入アクチン束の共焦点蛍光画像の代表的な最大投影を示す。ファシン、0.9μM;アクチン、6 μM、スケール バー = 10 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:3Dプリントシャフトデザイン。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:3DプリントされたcDICEチャンバーの設計。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者らは利益相反がないと宣言しています。