ここでは、マウス骨格筋からのミトコンドリア単離の詳細な方法と、その後のマイクロプレートベースの呼吸数アッセイを用いた酸素消費速度(OCR)による呼吸の分析について説明する。このパイプラインは、ミトコンドリア代謝に対する複数の環境的または遺伝的介入の影響を研究するために適用することができる。
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この記事について
サマリー
要約
細胞のエネルギーの大部分は、細胞の要求に応じて調節されるミトコンドリア酸化リン酸化(OXPHOS)系に収束する異なる経路によるグルコース、脂肪酸、およびアミノ酸の分解によって得られる。脂質分子コエンザイムQ(CoQ)は、一定の酸化/還元サイクルを通じて電子輸送鎖(ETC)内の複合体IIIに電子を伝達することによって、このプロセスにおいて不可欠である。ミトコンドリアの状態、そして最終的には、細胞の健康状態は、呼吸測定アッセイを用いてETC酸素消費量を測定することによって評価することができる。これらの研究は、典型的には、数日間培養された樹立または初代細胞株において行われる。両方の場合において、得られた呼吸パラメータは、任意の所与の器官または組織において正常な生理学的状態から逸脱していてもよい。
さらに、骨格筋から単離された培養単繊維の固有の特性は、このタイプの分析を妨げている。この論文は、マウス骨格筋から新たに単離されたミトコンドリアにおける呼吸の分析のための最新かつ詳細なプロトコルを提示する。また、プロセスのどの段階でも発生する可能性のある潜在的な問題に対するソリューションも提供します。ここで提示された方法は、多様なトランスジェニックマウスモデルにおける酸素消費速度を比較し、薬物治療または加齢または性別などの他の要因に対するミトコンドリア応答を研究するために適用することができる。これは、ミトコンドリアの生体エネルギー学の代謝と調節に関する重要な質問に答えるための実行可能な方法です。
概要
ミトコンドリアは細胞内の主要な代謝小器官1です。これらの特殊な膜密閉細胞小器官は、栄養分子を使用して、OXPHOSによってアデノシン三リン酸(ATP)の形でエネルギーを生成する。このプロセスは、ETC2における一連の酸化還元反応におけるドナー分子からの電子の移動に依存する。CoQは、抗酸化機能を示すすべての細胞膜および循環リポタンパク質で内因的に産生される唯一の酸化還元活性脂質である3。これはETCの必須成分であり、NADH依存性複合体IおよびFADH2依存性複合体IIから複合体IIIに電子を伝達するが、他の多くのレダクターゼは、複数の細胞代謝経路における必須ステップとしてミトコンドリアCoQのユビキノールへの還元を駆動することができる4,5。
このプロセスを通して、ミトコンドリア内膜を横切って電気化学的プロトン勾配が作成され、ATP合成酵素複合体V2によって生物学的に活性なエネルギーに変換される。その結果、ミトコンドリアの機能不全は、主に高エネルギー要求を有する組織(脳、心臓、骨格筋)に影響を及ぼす無数の病理学的状態をもたらす
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プロトコル
マウスの飼育および組織採取は、スペイン勅令53/2013、欧州指令2010/63/EU、およびその他の関連ガイドラインに従って、パブロ・デ・オラヴィーデ大学倫理委員会(スペイン、セビリア、プロトコル24/04/2056および12/03/2021/033)によって承認されたプロトコルを使用して実施された。
1. 呼吸アッセイのためのストック、緩衝液、および試薬の調製
- 以下のストックソリューションを準備し、指示された温度で数ヶ月間保存することができます。すべての場合に超高純度H2Oを使用してください。
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)錠剤をH2O(H2O200mLあたり1錠)に溶解し、1x PBSを調製する。溶液をオートクレーブし、室温(RT)で保存する。
- 2gのNaOHペレットを50mLのH2Oに溶解し、1M NaOHを調製する。
- pH 校正用に 0.1 M、1 M、5 M、および 10 M KOH ストックを準備します。
- 70 mL の H2O に 14.612 g の EDTA を加え、pH が 8.0 に達するまで NaOH ペレットを加えて、EDTA が完全に溶解するようにします。H2O量子サティス<....
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結果
ここに提示されたプロトコルは、マウス骨格筋からのミトコンドリアの単離によるミトコンドリア呼吸の in vivo 分析を可能にする。この方法の概要を 図 1 に示します。後肢から骨格筋を解剖した後(図2)、組織は均質化され、ミトコンドリアは等張条件下で連続遠心分離によって精製される。単離プロセス中に得られた異なる画分の純度は、異なる細胞小器官マーカーに対する抗体を用いたウェスタンブロットによって分析することができる。 図3A は、単離された画分における別個のタンパク質集団を示す異なる画分からの一般的なタンパク質プロファイルを示す。
図3Bは、すべてのミトコンドリア含量がミトコンドリア画分中にあることを示しており、外側(VDACおよびTOMM20)および内側(TIMM23)のミトコンドリア膜のマーカー、さらにはヌクロイド関連タンパク.......
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ディスカッション
ミトコンドリア呼吸を研究するために使用されるすべての方法には限界があります。したがって、特定の実験的な質問に最も適した方法を選択することが重要です。この研究は、ミトコンドリア機能を調査するためにさまざまな呼吸アッセイを実行するために、マウス骨格筋からミトコンドリアを単離するための最新かつ詳細なプロトコルを提供する。実際、マイクロプレートベースの技術を用いた単離ミトコンドリアにおけるミトコンドリア生体エネルギー学の研究は、再現性、信頼性、および複雑さの点で組織特異的呼吸を研究するのに価値がある。さらに、単離されたミトコンドリアの使用は、基質の利用可能性に対する制御を与え、基礎となる生物学的プロセスの理解を容易にする。単離されたミトコンドリアを使用することのもう一つの肯定的な側面は、膜貫通ATPアーゼの大部分が失われるため、ADP注射後に生成されたATPが再び新しいADPに変換されないため、状態IIIを研究することが可能であることである。さらに、本明細書に記載のアッセイにおいて、オリゴマイシンは、非特異的ATP合成の可能性をブロックするために添加される20。
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開示事項
著者らは、開示すべき利益相反がないことを宣言する。
謝辞
ホモジナイザーとCABDプロテオミクスおよび畜産施設を技術サポートに使用してくれたJuan J. Tenaに感謝します。この研究は、スペイン教育文化スポーツ省のJ.D.H.へのフェローシップFPU16/03264、C.V.-G.へのフェローシップ助成金#22450、制度助成金MDM-2016-0687(CABDの遺伝子規制および形態形成省マリア・デ・マエズトゥ・エクセレンス・ユニット)、BFU2017-83150-PからJ.J..Cへのフェローシップ・フランセーズ・コントル・レ・ミオパシー協会(AFM)を通じて支援されまし.C。アンダルシア暫定軍事政権はP18-RT-4572、欧州連合(EU)のFEDER資金提供プログラム、スペイン科学・イノベーション・大学省はRED2018-102576-TをPNに助成金を支給しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma | A5285 | ストックは -20 °C;C |
| AKT 抗体 | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (宿主種) |
| 抗ヤギ HRP | Sigma | 401504 | ウサギ (宿主種) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | ヤギ (宿主種) |
| アスコルビン酸 | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | ヤギ (宿主種) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | バイオ・ラッド | 5000002 | 5x Bradford 試薬と、標準曲線 |
| BSA、フラクション V、脂肪酸を含まない | Calbiochem | 126575 | 4°Cでストック。C |
| C チューブ | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | 紫色の蓋 |
| カルネキシン抗体 | ThermoFisher | MA3-027 | マウス (宿主種) |
| D-マンニトール | Sigma | M4125 | RT |
| EDTA | BDH | 280254D | 4 °Cでストック;C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | ストック -20 °C;C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | ホモジナイザー |
| HEPES | Sigma | H3375 | RT |
| HSP70抗体 | Proteintech | 10995-1-AP | ウサギ (宿主種) |
| LDH-A 抗体 | Santa Cruz バイオテクノロジー | SC27230 | ヤギ (宿主種) |
| 塩化マグネシウム | ChemCruz | sc-255260A | RTでの在庫 |
| リンゴ酸 | Sigma | P1645 | RT |
| の在庫 マイクロプレート分光光度計 | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | RT |
| Milli-Q 水 | ミリポアシステム | F7HA17757A | 超純水 |
| mtTFA 抗体 | サンタクルーズバイオテクノロジー | SC23588 | ヤギ (宿主種) |
| Na+/K+-ATPase & alpha;1 | Novus Biologicals | NB300-14755 | マウス (宿主種) |
| オリゴマイシン | Sigma | O4876 | ストック -20 °C;C |
| パルミトイル-L-カルニチン | Sigma | P1645 | ストック -20 °;C |
| PBS錠 | Sigma | P4417-100TAB | RTの1倍ストック |
| リン酸二水素カリウム | ChemCruz | sc-203211 | RTのストック |
| 水酸化カリウム | シグマ | 60377 | RTピル |
| ビン酸 | シグマ | 107360 | 4°Cのストック;C |
| ロテノン | Σ | R8875 | ストック -20 °;C |
| Seahorse XF24 ミトコンドリアフラックス分析装置 | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | キットには、カートリッジ、マイクロプレート、および校正液が含まれています |
| コハク酸 | シグマ | S7626 | RT |
| スクロー | シグマ | S9378 | |
| TIMM23 抗体のストック | Abcam | ab230253 | (宿主種) |
| TMPD | Sigma | T7394 | ストック-20°C;C |
| TOMM20 | Abcam | ab56783 | マウス(宿主種) |
| VDAC抗体 | Abcam | ab15895 | ウサギ(宿主種) |
参考文献
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
- Turunen, M.....
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