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方法論記事

呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離

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DOI：

10.3791/63336

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2022年2月10日

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1Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, CSIC-UPO-JA, Universidad Pablo de Olavide, 2CIBERER, Instituto de Salud Carlos III

この記事について

サマリー

ここでは、マウス骨格筋からのミトコンドリア単離の詳細な方法と、その後のマイクロプレートベースの呼吸数アッセイを用いた酸素消費速度(OCR)による呼吸の分析について説明する。このパイプラインは、ミトコンドリア代謝に対する複数の環境的または遺伝的介入の影響を研究するために適用することができる。

要約

細胞のエネルギーの大部分は、細胞の要求に応じて調節されるミトコンドリア酸化リン酸化(OXPHOS)系に収束する異なる経路によるグルコース、脂肪酸、およびアミノ酸の分解によって得られる。脂質分子コエンザイムQ(CoQ)は、一定の酸化/還元サイクルを通じて電子輸送鎖(ETC)内の複合体IIIに電子を伝達することによって、このプロセスにおいて不可欠である。ミトコンドリアの状態、そして最終的には、細胞の健康状態は、呼吸測定アッセイを用いてETC酸素消費量を測定することによって評価することができる。これらの研究は、典型的には、数日間培養された樹立または初代細胞株において行われる。両方の場合において、得られた呼吸パラメータは、任意の所与の器官または組織において正常な生理学的状態から逸脱していてもよい。

さらに、骨格筋から単離された培養単繊維の固有の特性は、このタイプの分析を妨げている。この論文は、マウス骨格筋から新たに単離されたミトコンドリアにおける呼吸の分析のための最新かつ詳細なプロトコルを提示する。また、プロセスのどの段階でも発生する可能性のある潜在的な問題に対するソリューションも提供します。ここで提示された方法は、多様なトランスジェニックマウスモデルにおける酸素消費速度を比較し、薬物治療または加齢または性別などの他の要因に対するミトコンドリア応答を研究するために適用することができる。これは、ミトコンドリアの生体エネルギー学の代謝と調節に関する重要な質問に答えるための実行可能な方法です。

概要

ミトコンドリアは細胞内の主要な代謝小器官1です。これらの特殊な膜密閉細胞小器官は、栄養分子を使用して、OXPHOSによってアデノシン三リン酸(ATP)の形でエネルギーを生成する。このプロセスは、ETC2における一連の酸化還元反応におけるドナー分子からの電子の移動に依存する。CoQは、抗酸化機能を示すすべての細胞膜および循環リポタンパク質で内因的に産生される唯一の酸化還元活性脂質である3。これはETCの必須成分であり、NADH依存性複合体IおよびFADH2依存性複合体IIから複合体IIIに電子を伝達するが、他の多くのレダクターゼは、複数の細胞代謝経路における必須ステップとしてミトコンドリアCoQのユビキノールへの還元を駆動することができる4,5。

このプロセスを通して、ミトコンドリア内膜を横切って電気化学的プロトン勾配が作成され、ATP合成酵素複合体V2によって生物学的に活性なエネルギーに変換される。その結果、ミトコンドリアの機能不全は、主に高エネルギー要求を有する組織(脳、心臓、骨格筋)に影響を及ぼす無数の病理学的状態をもたらす6,7。したがって、ミトコンドリアの生体エネルギー学を正確に解析し、健康や病気、特に骨格筋などの高エネルギー組織におけるミトコンドリアの生体エネルギー学の役割を調べる方法を開発することが不可欠です。

クラーク型酸素電極は、ミトコンドリア呼吸の研究で古典的に使用されています8。しかし、このシステムは徐々に高分解能技術に取って代わられており、Agilent Seahorse XF分析装置などのマイクロプレートベースの酸素消費技術が特に人気があります9。骨格筋分野では、これらの研究は通常、主にC2C12不死化マウス筋芽細胞株またはサテライト細胞に由来する初代培養細胞において、培養細胞において実施される10,11。しかし、これらの研究は、特に特定の侮辱、非遺伝的介入、または遺伝子操作による組織レベルでのミトコンドリア生物学および機能を調査する場合、インビボでの状況を完全に要約していない。

さらに、細胞内の呼吸アッセイは、ATPおよびアッセイ基質のミトコンドリア外要求またはシグナル伝達事象を含む追加の要因のためにより複雑であり、結果の解釈を誤解させる可能性がある。あるいは、筋肉から単離されたばかりの筋線維の単一または束を用いることもできる。しかし、単離方法は技術的に困難であり、いくつかの筋肉タイプに対してのみ実現可能である。この場合、屈筋デジトルム・ブレビス(FDB)および伸筋デジトルム・ロンガス(EDL)筋が主に使用されていますが10,12,13が,他の筋肉型の使用についても記述されている報告もあります14,15。

骨格筋切片の生体エネルギープロファイリングも報告されている16。この方法の主な利点は、無傷の筋肉を研究できることである(著者らは、単離された筋線維と比較して、線維をスライスしても結果を妨げないことを示している)。しかし、基質およびアッセイ阻害剤へのミトコンドリアのアクセスは限られているため、測定できるパラメータはごくわずかです16。最後に、単離されたミトコンドリアも同様に採用することができる9、17、18、19。この場合、ミトコンドリアは細胞質ゾル環境を失い、その機能に影響を与える可能性があります。対照的に、この方法は、基質および阻害剤へのアクセスを保証し、多数のサンプルタイプの分析を可能にし、典型的にはより少ない材料を必要とする。

本稿では、マイクロプレートベースの呼吸法アッセイを用いてマウス骨格筋から単離されたミトコンドリアの生体エネルギープロファイリングを行う方法を記載する(図1)。特に、3つのプロトコルが詳述されている:カップリングアッセイ、ETCとOXPHOS機構との間の結合の程度を評価するためのCA;電子フローアッセイにより、個々のETC錯体の活性を測定するEFA;BOXアッセイにより、ミトコンドリアβ酸化能を決定した。特に、従来の呼吸法と比較して、少量のサンプルしか必要としません。ここで使用される分離プロトコルは、他の場所で公開されている方法から変更されています18。

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プロトコル

マウスの飼育および組織採取は、スペイン勅令53/2013、欧州指令2010/63/EU、およびその他の関連ガイドラインに従って、パブロ・デ・オラヴィーデ大学倫理委員会(スペイン、セビリア、プロトコル24/04/2056および12/03/2021/033)によって承認されたプロトコルを使用して実施された。

1. 呼吸アッセイのためのストック、緩衝液、および試薬の調製

  1. 以下のストックソリューションを準備し、指示された温度で数ヶ月間保存することができます。すべての場合に超高純度H2Oを使用してください。
    1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)錠剤をH2O(H2O200mLあたり1錠)に溶解し、1x PBSを調製する。溶液をオートクレーブし、室温(RT)で保存する。
    2. 2gのNaOHペレットを50mLのH2Oに溶解し、1M NaOHを調製する。
    3. pH 校正用に 0.1 M、1 M、5 M、および 10 M KOH ストックを準備します。
    4. 70 mL の H2O に 14.612 g の EDTA を加え、pH が 8.0 に達するまで NaOH ペレットを加えて、EDTA が完全に溶解するようにします。H2O量子サティス(QS)を100mLに加える。得られた0.5 M EDTA(pH 8)溶液をオートクレーブし、RTで保存する。
    5. 70 mL の H2O に 19 g EGTA を加えます。pH が 8.0 に達するまで NaOH ペレットを加えて、EGTA が完全に溶解できるようにします。H2O QSを100mLに加える。得られた0.5 M EGTA(pH 8)溶液をオートクレーブし、RTで保存する。
    6. 2 mL の 0.5 M EDTA を 98 mL の PBS に加えます。得られた10 mM EDTA/PBS溶液をRTに保管します。
    7. 5.958 g の HEPES を 40 mL H2O に溶解します。KOH で pH を 7.2 に、H2O で QS を 50 mL に調整します。得られた 0.5 M HEPESバッファーを 0.45 μm メッシュでろ過し、RT で保存します。
    8. 3.402 g の KH2PO4 を最大 50 mL の H2O に溶解させ、得られた 0.5 M KH2PO4 溶液を 0.45 μm メッシュでろ過し、RT で保存します。
    9. 得られた1 M MgCl2溶液をオートクレーブで最大100 mLのH2Oに9.521 gの無水MgCl2を溶解し、RTで保存する。
      注:これは発熱反応であるため、慎重に進行し、MgCl2 を氷上で溶解してください。
  2. 基質および阻害剤ストック溶液を調製する( 表1参照)。アリコートし、-20°Cで保存する。 凍結融解サイクルは避けてください。例外として、使用直前に必ずピルビン酸を調製してください。
    1. 超純粋なH2Oで調製する:0.5 Mコハク酸、0.5 Mピルビン酸、0.5 Mリンゴ酸、100 mM ADP、1 Mアスコルビン酸、および50 mM N,N,N ',N'-テトラメチルパラフェニレンジアミン(TMPD)(光から保護)。
    2. 100%ジメチルスルホキシド(DMSO)で調製する:50mMパルミトイル-L-カルニチン、4mMロテノン、20mMカルボニルシアン化物-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)、4mMオリゴマイシン、および5mMアンチマイシンA。
      注: マイクロプレートウェル内の最終 DMSO 濃度は 0.1% を超えないようにしてください。したがって、この制限未満にとどまるように、高濃度のストックソリューションを準備してください。
  3. ミトコンドリア単離およびタンパク質定量用のバッファーを実験当日に新たに調製する。すべての場合に超高純度H2Oを使用し、特に明記されていない限り、すべてのバッファーを氷上に保管してください。
    注:時間を節約するために、すべての試薬を計量し、前日に適切な温度で適切な容器(例えば、15mLチューブ)に保管することができます。
    1. 10%遊離脂肪酸(FFA)BSAを調製するには、反転/回転輪により150mgのFFA BSAを1.5mLのH2Oに十分に溶解する。泡立ちを避けるために渦を巻かないでください。
    2. 1xブラッドフォード試薬を調製するには、5xの市販のストック溶液をH2Oで希釈し、RTで暗闇に保ちます。
    3. 8x ミトコンドリアバッファー (MB) を調製するには、4.112 g のスクロースと 763 mg の HEPES を 15 mL の H2O に溶解します。pHを 7.2 に調整し、1.6 mL の 10% FFA BSA および QS を H2O と共に 20 mL に加えます。
    4. 20 mL の単離バッファー 1 (IB1) (サンプルあたり 4 mL を使用) を調製するには、400 μL の 0.5 M EDTA、784 mg の D-マンニトール、および 2.5 mL の 8x MB を 15 mL の H2O に溶解させます。H2O で pH を 7.2 に調整し、QS を調整します。
    5. 5 mL の単離バッファー 2 (IB2) (サンプルあたり 500 μL を使用) を調製するには、30 μL の 0.5 M EGTA 、196 mgの D-マンニトール、および 625 μL の 8x MB を 4 mL の H2O に溶解します。H2O で pH を 7.2 に調整し、QS を調整します。
    6. 5 mL の再懸濁バッファー (RB) (サンプルあたり 200 μL を使用) を調製するには、スクロース 120 mg、D-マンニトール 191.3 mg、0.5 M HEPES 50 μL、および 0.5 M EGTA 10 μL を 4 mL の H2O に溶解します。H2O で pH を 7.2 に調整し、QS を調整します。
    7. 2x ミトコンドリアアッセイ溶液-1 (MAS-1) を調製するには、1.199 g のスクロース、2.8 g のマンニトール、1 mL の 0.5 M KH2PO4、250 μL の 1 M MgCl2、200 μL の 0.5 M HEPES、および 100 μL の 0.5 M EGTA を 20 mL の H2O に溶解させます。pH を 7.2 に、QS を 25 mL に H2O で調整します。氷にしばらく保管してください。長期間は、沈殿を避けるために4°Cに保ちます。
    8. 1xカップリングアッセイ培地(CAM)を調製するには、2つの異なるMAS−1ベースの緩衝液を調製する:1)CAMアッセイに適したCAM+BSA、および2)アッセイ阻害剤を調製するためのCAM−BSA。ピルビン酸:リンゴ酸の比率は常に10:1に保ちます。
      注:BSAは注射ポートを詰まらせる可能性があるため、BSAフリーCAMで阻害剤を希釈してください。
      1. CAM+BSAを調製するには、0.5 Mピルビン酸300 μL、0.5 Mリンゴ酸30 μL、および2x MAS-1 7.5 mLを6 mLのH2Oで希釈します。pHを7.2に調整します。300 μL の 10% FFA BSA および QS を H2O と共に 15 mL に加えます。
      2. CAM-BSAを調製するには、120 μLの0.5 Mピルビン酸、12 μLの0.5 Mリンゴ酸、および3 mLの2x MAS-1を2 mLのH2Oで希釈します。H2OでpHを7.2に、QSを6 mLに調整します。
    9. 1x電子フローアッセイ培地(EFAM)を調製するには、BSA含有およびBSAフリーのEFAMバッファーの両方を準備します。
      1. EFAM+BSAを調製するには、0.5 M ピルビン酸 300 μL、0.5 M リンゴ酸 60 μL、20 mM FCCP 3 μL、および 2x MAS-1 7.5 mL を 6 mL の H2O で希釈します。pHを 7.2 に調整します。300 μL の 10% FFA BSA および QS を H2O と共に 15 mL に加えます。
      2. EFAM-BSAを調製するには、0.5 Mピルビン酸120 μL、0.5 Mリンゴ酸24 μL、20 mM FCCP1.2 μL、および2x MAS-1 3 mLを2 mLのH2Oで希釈します。
    10. 1x β酸化媒体(BOXM)を調製するために、BSA含有およびBSAフリーのBOXM溶液を調製する。
      1. BOXM+BSAを調製するには、50 mM パルミトイル-L-カルニチン 12 μL、0.5 M リンゴ酸 30 μL、および 2x MAS-1 7.5 mL を 7 mL の H2O で希釈します。pHを 7.2 に調整します。300 μL の 10% FFA BSA および QS を H2O と共に 15 mL に加えます。
      2. BOXM-BSAを調製するには、50 mM パルミトイル-L-カルニチン 4.8 μL、0.5 M リンゴ酸 12 μL、および 2 x MAS-1 3 mL を 2 mL の H2O に希釈します。H2O で pH を 7.2 に、QS を 6 mL に調整します。

2. 筋肉解剖、均質化、ミトコンドリア隔離

  1. すべての材料とバッファーを氷の上に置きます。ミトコンドリアを損傷から保護するために、手順全体を通してすべての材料が氷冷であることを確認してください。
  2. 1サンプルあたり3つの50 mLビーカーを氷上に置き、ビーカー1に10 mLのPBS、ビーカー2に10 mLの10 mM EDTA/PBSを、ビーカー3に4 mLのIB1を加えます。
  3. 子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。骨格筋が低酸素になり、呼吸分析を妨げる可能性があるため、CO2 安楽死を避けてください。
  4. 毛皮が脱落するのを防ぐために右後肢に70%エタノールをスプレーし、コルク解剖板に四肢をテープで固定します。左前肢にもテープを貼ります。
  5. 膝からつま先までの皮膚を通して滅菌使い捨てメスで切開を行います。
  6. 足首の高さで歯付きの鉗子で皮膚をつかみ、足首の周りを細かいはさみで切ります。
  7. 片手に細かい先端ピンセットで皮膚を下層の筋肉組織から離し、もう片方の手に歯付きの鉗子で引き上げます。
  8. 足首から膝までのすべての骨格筋を解剖します(図2)。
    1. 脛骨前脛骨(TA)筋上のすべての結合組織を除去し、細かいピンセットとハサミを使用して筋肉の抽出を容易にします。
    2. EDL筋肉の4つの遠位腱を見つけ、つま先の挿入の近くにそれらを切断する。TA遠位腱の位置を特定し、挿入の近くで、常に足首の下に切断します。
    3. TAとEDLの腱を足首の上に慎重に引いて、緩んだ端を解放します。
    4. 腱の緩んだ端をつかみ、筋肉を引き上げて筋肉組織や骨の残りの部分から遠ざけます。細かいピンセットやはさみを使用して、プロセスを容易にします。筋線維の収縮を避けるために注意して進めてください。
    5. EDLの近位腱とTA筋を膝蓋骨にできるだけ近づけて切断する。
    6. マウスを逆さまにして、腓腹筋(GA)とヒラメの筋肉の抽出を進めます。
    7. 大腿二頭筋とGAの間に形成されたポケットを歯付き鉗子でつかむ。細かいはさみを使用してこれらの筋肉を分離し、近位GA腱を視覚化します。
    8. 細かい鉗子でアキレス腱をつかみ、細かいハサミで丁寧に切る。GAとヒラメの筋肉を腱を通して引き上げることによって、基礎となる骨から解放します。近位GA腱を切断し、基底ヒラメと一緒に解放する。
    9. 骨だけが残るまで、同じ手順で腱から腱までの残りの筋肉を慎重に解剖します。
    10. マウスを初期位置に再ピン留めして、大腿四頭筋を解剖します。
    11. 歯のある鉗子と細かいはさみを使って近位側の大腿四頭筋の上に脂肪組織を捨てる。
    12. 大腿四頭筋と大腿骨の間に細かいピンセットを挿入し、大腿骨軸に沿って両方向に動かして筋肉を骨から分離します。
    13. 遠位大腿四頭筋腱を歯付き鉗子で掴み、膝蓋骨にできるだけ近い細かいハサミで腱を切ってください。
    14. 大腿四頭筋を引き上げ、近位挿入時に細かいはさみで解放します。
  9. このセクションの手順 4 ~ 8 を左の後肢で繰り返します。
  10. 最初にビーカー1ですべての筋肉をすすぎ、次にビーカー2ですすぎます。
  11. すべての筋肉をビーカー3に移し、氷の上の鋭いはさみですべての筋肉を細かく刻みます。
  12. サスペンションをCチューブ(紫色の蓋)に移し、常に氷の中に保管します。
  13. Cチューブをしっかりと閉じ、ホモジナイザーのスリーブに逆さまに取り付けます。サンプル材料が回転子/ステータの領域にあることを確認してください。 m_mito_tissue_01 という 1 分間のプログラムを選択します。
  14. ホモジネートを2本の2 mL予冷微量遠心管に分割し、卓上遠心分離機で700 × g で4°Cで10分間遠心分離した。
  15. 上清を新しい2mLプレチルドチューブに移し、脂肪および非均質化組織を慎重に回避する。断片化純度測定(画分N)のためにペレットを-80°Cで保存する(図3)。
  16. 上清を10,500 × g で4°Cで10分間遠心分離する。
  17. 上清を新しい2mLプレチルドチューブに移し、上清番号1(SN1)としてラベル付けします。フラグメンテーション純度測定のために-80°Cで保存してください(図3)。
  18. 両方のペレットを再懸濁し、氷中のIB2の総容量500μLで組み合わせる。
  19. 10,500 × g で 4°C で 10 分間遠心分離します。
  20. 上清を新しい2mLプレチルドチューブに移し、上清番号2(SN2)としてラベル付けする。フラグメンテーション純度測定のために-80°Cで保存してください(図3)。
  21. 最終ミトコンドリアペレットを200μLのRBに再懸濁する。タンパク質定量のために10 μLを素早く取っておき、損傷を防ぐために残りのミトコンドリア懸濁液に10 μLの10%FFA BSAを直ちに加えます。
  22. ブラッドフォードアッセイを用いてタンパク質濃度を決定する。
    1. 標準曲線のために、RB緩衝液中の既知濃度のタンパク質の段階希釈液30μLを調製する。たとえば、1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL、および 0 mg/mL の BSA を使用します。
    2. RBバッファー中のミトコンドリアサンプルの1:3および1:6の段階希釈液を調製する。
    3. 96 ウェルの平底プレートで、まず 1 ウェルあたり 2.5 μL のサンプル/標準をロードします。次に、各サンプルに10 μLの1 M NaOHを添加し、最後に200 μLの1xブラッドフォード試薬を加える。気泡を避けてよく混ぜる。サンプルの色が校正ライン内にあることを視覚的に確認します。解析は常に 3 連で実行します。
    4. プレートを暗所のRTで5分間インキュベートし、マイクロプレート分光光度計で595nmの吸光度を読み取った。
    5. このセクションのステップ22.1で調製した希釈液の対応するタンパク質濃度(x軸)に対して吸光度値(y軸)をプロットすることによって標準曲線を計算する。
    6. ミトコンドリアサンプル中のタンパク質の総量を、標準曲線による外挿により計算する。

マイクロプレートベースの呼吸数測定アッセイの調製

  1. 実験の少なくとも12時間前に呼吸測定アッセイセンサーを1ウェルあたり1mLの校正バッファーで水和させる。37°C(CO2なし)でインキュベートします。
    メモ:ハイドレートセンサーは最大72時間使用できます。このステップでは、カートリッジは慎重に取り扱う必要があります:何かがセンサーに触れると、測定感度が影響を受ける可能性があります。
  2. 分取遠心分離機を、スイングバケットマイクロプレートローターおよび対応するマイクロプレートアダプターで4°Cで予冷します。
  3. コンピュータの電源を入れ、解析ソフトウェアを開き、目的のプロトコルを選択します。
    メモ: ソフトウェアが酸素消費量測定器に接続すると、カチッという音がします。加熱センサーは緑色で、実験開始前に 37 °C にする必要があります。
  4. セクション1、ステップ2に示されたストックからインヒビター溶液を調製し、実施されるアッセイに従って。各溶液に十分な容量を用意する。参考までに 、表 1 および 表 2 を参照してください。
  5. 各ポートに各インヒビターの適切な量を追加し、カートリッジを酸素消費量測定器に挿入し、キャリブレーションを開始します。
    メモ:カートリッジにインヒビターを追加し、カートリッジを器具に挿入するには15〜20分かかります。カートリッジ・コンポーネントが正しく取り付けられていることを確認します。カートリッジの蓋とハイドロブースターは、センサーカートリッジとユーティリティの場所が必要なときに捨てることができます。
  6. セクション2の濃縮ミトコンドリア懸濁液を、ステップ21で10,500× g で4°Cで10分間遠心分離する。
  7. ミトコンドリアペレットを、実行するプロトコルに応じて、1x CAM+BSA、1x EFAM+BSA、または1x BOXM+BSAの100 μLに再懸濁する。
  8. 濃縮ミトコンドリアサンプルをさらに希釈して、対応するアッセイ培地で最終0.2 μg/μL濃度にします。
  9. 氷上で予冷した24ウェルマイクロプレート中の1ウェルあたり50μLの懸濁液(合計10μgのタンパク質)を種子とする。バックグラウンド矯正井戸にミトコンドリアを追加しないでください。対応するアッセイ培地を添加するだけである。残りのミトコンドリア懸濁液を-80°Cで保存し、フラグメンテーション純度を測定します(図3)。
  10. マイクロプレートを2,000 × g で4°Cで20分間予冷した分取遠心分離機で回転させる。 それに応じてバランスをとるためのカウンターウェイト。
  11. マイクロプレート遠心分離中に残りのアッセイ培地を37°Cで加温する。
  12. 遠心分離後、マイクロプレートをベンチに5分間放置して平衡化します。RTで1ウェルあたり500μLの最終容量を得るために、450μLの温かいアッセイ培地を加える。ミトコンドリアが剥離するのを避けるために、井戸の壁に培地を加えて、これをゆっくりと慎重に行います。
  13. マイクロプレートを蓋のない酸素消費量測定器に直ちに入れ、プロトコールを開始する(表3)。最初のステップがマイクロプレートを温めるために10分間のインキュベーションであることを確認してください。
  14. 実験が終了したら、カートリッジとマイクロプレートを取り外し、機器の電源を切って分析を開始します。

4. 結果の分析

  1. CAアッセイおよびBOXアッセイの場合、以下の分析を行う:
    1. アンティマイシンAおよびロテノン注射後に得られた値の平均に対応する非ミトコンドリアO2 消費を記録する。
      注:アンチマイシンAおよびロテノンは、それぞれ複合体IIIおよびI阻害剤である。
    2. 基礎値から非ミトコンドリアO2 消費量を差し引いて基礎呼吸を計算します(測定点1と2)。
    3. 複合体V基質ADPの注入(注入A)後の値から非ミトコンドリアO2 消費量を差し引いて、ミトコンドリア状態IIIを決定した。
    4. 複合体V阻害剤オリゴマイシンの注射後の呼吸値から非ミトコンドリアO2 消費量を差し引いて(注射B)、ミトコンドリア状態IVoを得た。
    5. FCCP注射後の呼吸から非ミトコンドリアO2 消費量を差し引くことにより、ミトコンドリア状態IIIuを計算する(注射C)。
      注:FCCPは強力なミトコンドリア酸化リン酸化アンカプラーである。ATP合成はその存在下でバイパスされ、ETCは最大の活性を達成する。
    6. ミトコンドリア状態IIIu値から基礎呼吸値を差し引いて、エネルギー需要が増加した場合に余分なATPを生成する能力であるミトコンドリア予備容量を得る。
    7. ミトコンドリア状態IIIuを状態IVo値で除算し、呼吸制御比(RCR)を求める。
      注: 負またはヌルの RCR 値は、ミトコンドリア結合が影響を受けることを示します。
  2. EFA を参照して、次の計算を実行します。
    1. ロテノン及びアンチマイシンA注射(注射剤A及びC)後の平均値を算出することにより残存活性を求める。
    2. 基礎値から残存活性を差し引くことにより複合体I対IV(CI-CIV)活性を算出する(測定点1、2)。
    3. CII基質コハク酸塩の注入後の値(注入B)から残存活性を差し引いて、CII−CII−CIV活性を得た。
    4. シトクロムc還元剤、アスコルビン酸およびTMPDを注入した後に得られた値から残存活性を差し引くことによってCIV活性を計算する(注射D)。
  3. 図4のように棒グラフを使用してすべての結果を表し、適切な結論を導き出します。

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結果

ここに提示されたプロトコルは、マウス骨格筋からのミトコンドリアの単離によるミトコンドリア呼吸の in vivo 分析を可能にする。この方法の概要を 図 1 に示します。後肢から骨格筋を解剖した後(図2)、組織は均質化され、ミトコンドリアは等張条件下で連続遠心分離によって精製される。単離プロセス中に得られた異なる画分の純度は、異なる細胞小器官マーカーに対する抗体を用いたウェスタンブロットによって分析することができる。 図3A は、単離された画分における別個のタンパク質集団を示す異なる画分からの一般的なタンパク質プロファイルを示す。

図3Bは、すべてのミトコンドリア含量がミトコンドリア画分中にあることを示しており、外側(VDACおよびTOMM20)および内側(TIMM23)のミトコンドリア膜のマーカー、さらにはヌクロイド関連タンパク...

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ディスカッション

ミトコンドリア呼吸を研究するために使用されるすべての方法には限界があります。したがって、特定の実験的な質問に最も適した方法を選択することが重要です。この研究は、ミトコンドリア機能を調査するためにさまざまな呼吸アッセイを実行するために、マウス骨格筋からミトコンドリアを単離するための最新かつ詳細なプロトコルを提供する。実際、マイクロプレートベースの技術を用いた単離ミトコンドリアにおけるミトコンドリア生体エネルギー学の研究は、再現性、信頼性、および複雑さの点で組織特異的呼吸を研究するのに価値がある。さらに、単離されたミトコンドリアの使用は、基質の利用可能性に対する制御を与え、基礎となる生物学的プロセスの理解を容易にする。単離されたミトコンドリアを使用することのもう一つの肯定的な側面は、膜貫通ATPアーゼの大部分が失われるため、ADP注射後に生成されたATPが再び新しいADPに変換されないため、状態IIIを研究することが可能であることである。さらに、本明細書に記載のアッセイにおいて、オリゴマイシンは、非特異的ATP合成の可能性をブロックするために添加される20。

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開示事項

著者らは、開示すべき利益相反がないことを宣言する。

謝辞

ホモジナイザーとCABDプロテオミクスおよび畜産施設を技術サポートに使用してくれたJuan J. Tenaに感謝します。この研究は、スペイン教育文化スポーツ省のJ.D.H.へのフェローシップFPU16/03264、C.V.-G.へのフェローシップ助成金#22450、制度助成金MDM-2016-0687(CABDの遺伝子規制および形態形成省マリア・デ・マエズトゥ・エクセレンス・ユニット)、BFU2017-83150-PからJ.J..Cへのフェローシップ・フランセーズ・コントル・レ・ミオパシー協会(AFM)を通じて支援されまし.C。アンダルシア暫定軍事政権はP18-RT-4572、欧州連合(EU)のFEDER資金提供プログラム、スペイン科学・イノベーション・大学省はRED2018-102576-TをPNに助成金を支給しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ADPSigmaA5285ストックは -20 °C;C
AKT 抗体Cell Signaling TechnologyC67E7Rabbit (宿主種)
抗ヤギ HRPSigma401504ウサギ (宿主種)
anti-Mouse HRPCell Signaling#7076Horse (Host species)
Antimycin ASigmaA8674Stock at -20 °C
anti-Rabbit HRPCell Signaling#7074ヤギ (宿主種)
アスコルビン酸SigmaA5960Stock at RT
Bactin antibodySigmaMBS4-48085ヤギ (宿主種)
Bio-Rad Protein Assay Kit IIバイオ・ラッド50000025x Bradford 試薬と、標準曲線
BSA、フラクション V、脂肪酸を含まないCalbiochem1265754°Cでストック。C
C チューブMiltenyi Biotec130-093-237紫色の蓋
カルネキシン抗体ThermoFisherMA3-027マウス (宿主種)
D-マンニトールSigmaM4125RT
EDTABDH280254D4 °Cでストック;C
EGTASigmaE-4378RT
FCCPSigmaC2920ストック -20 °C;C
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235ホモジナイザー
HEPESSigmaH3375RT
HSP70抗体Proteintech10995-1-APウサギ (宿主種)
LDH-A 抗体Santa Cruz バイオテクノロジーSC27230ヤギ (宿主種)
塩化マグネシウムChemCruzsc-255260ARTでの在庫
リンゴ酸SigmaP1645RT
の在庫 マイクロプレート分光光度計BMG LABTECH GmbHPOLARstar OMEGA S/N 415-0292RT
Milli-Q 水ミリポアシステムF7HA17757A超純水
mtTFA 抗体サンタクルーズバイオテクノロジーSC23588ヤギ (宿主種)
Na+/K+-ATPase & alpha;1Novus BiologicalsNB300-14755マウス (宿主種)
オリゴマイシンSigmaO4876ストック -20 °C;C
パルミトイル-L-カルニチンSigmaP1645ストック -20 °;C
PBS錠SigmaP4417-100TABRTの1倍ストック
リン酸二水素カリウムChemCruzsc-203211RTのストック
水酸化カリウムシグマ60377RTピル
ビン酸シグマ1073604°Cのストック;C
ロテノンΣR8875ストック -20 °;C
Seahorse XF24 ミトコンドリアフラックス分析装置Agilent Technologies420179XFe24 model
Seahorse XFe24 FluxPak miniAgilent Technologies102342-100キットには、カートリッジ、マイクロプレート、および校正液が含まれています
コハク酸シグマS7626RT
スクローシグマS9378
TIMM23 抗体のストックAbcamab230253(宿主種)
TMPDSigmaT7394ストック-20°C;C
TOMM20Abcamab56783マウス(宿主種)
VDAC抗体Abcamab15895ウサギ(宿主種)
抗体 ス RT ウサギ抗体

参考文献

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呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離
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