方法論記事

吸着性バイオプロセスは、Pseudomonas stutzeriからのメラニンの収量を改善します

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DOI：

10.3791/63339

⸱

2022年1月12日

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, National Institute of Technology, 2Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology

この記事について

サマリー

ここでは、生物学的産物、特にそれ自身の生合成を阻害し、それを生成する微生物の成長を阻害する色素を生成するための吸着バイオプロセスに関するプロトコルを紹介します。

要約

メラニンは天然色素であり、インドールリングと多数の官能基の存在により、メラニンはUV保護剤、スキンケア、化粧品などの多くの用途に理想的な選択肢となっています。海洋 性Pseudomonas stutzeri は、チロシンを添加せずにメラニンを生成します。フィードバック阻害は、メラニン産生海洋細菌 Pseudomonas stutzeriの培養物中のメラニンによって観察されました。メラニンはまた、微生物の増殖阻害を示しました。Han-Levenspielモデルベースの解析により、細胞増殖に対するメラニンの非競合型製品の阻害が特定されました。メラニンを生成するチロシナーゼ酵素は、メラニンによって阻害されました。異なるメラニン濃度の存在下での酵素反応の二重逆数プロットは、非競合的な生成物阻害を明らかにしました。メラニンによるフィードバック阻害を低減するために、吸着剤を用いた吸着バイオプロセスを開発した。メラニン吸着に最適な吸着剤を選定するために、さまざまな吸着剤を選別しました。吸着性バイオプロセスを開発するために投与量と時間を最適化した結果、チロシンと酵母抽出物を補給せずに、海洋細菌 Pseudomonas stutzeri (153 mg / L〜1349 mg / L)によるメラニン産生が8.8倍増加しました。

概要

メラニンは、モノマー単位がインドール環であるポリフェノール化合物です。メラニンは、植物、動物、微生物の黒、茶色、灰色の色のほとんどに関与しています1。最も一般的なメラニンはユーメラニンであり、脊椎動物や無脊椎動物に広く分布する暗褐色または黒色の色素です2。頭足類、植物、微生物はメラニン3の主な供給源です。微生物から得られるメラニンは、頭足類や植物からのメラニンに比べていくつかの利点があります。それらは成長が速く、季節変動の問題を引き起こしません。また、成長培地と提供される動作条件に応じて、自分自身を変更します。これらすべての事実を考慮すると、微生物源はメラニンの主要な供給源として利用されており、潜在的な商業的用途があります4,5,6。Guoらは、組換えStreptomyces kathirae SC-1を使用して、最適化された培地で最大28.8 g / Lのメラニンを生成しました7。Lagunas-Muñoz et al.組換え大腸菌8で約6g / Lのメラニンを得ました。Wangらは、中程度の最適化9の後、約4.2 g / Lの可溶性メラニンを得ました。研究者たちはまた、メラニンを生成するための海洋文化を調査しました。Kiranらは、海洋シュードモナス種10からメラニンを産生した。Kumarらは、栄養ブロス中にメラニンを生成する海藻からPseudomonas stutzeri HMGM-7を単離しました。報告されたすべてのメラニン生産者は、メラニン生産のために培地サプリメント、酵母抽出物、および/またはペプトンを必要としており、バイオプロセスのスケールアップを妨げる可能性があります。ラマンらは、高価な添加物を必要としないAspergillus fumigatus AFGRD105からのメラニン産生を調査しました11。

海藻から分離された Pseudomonas stutzeriとして知られる海洋細菌が、メラニン産生のために選択されました。この微生物は、可溶性メラニンの生成のためにチロシンと酵母抽出物の追加補給を必要とせず、海水ベースの培地で増殖するため、飲料水のフットプリントと中コストが削減されます。Thairaらは、この海洋細菌を用いたメラニンナノ色素産生のためのココナッツケーキミールを用いた最適化されたバイオプロセスを、以前の論文で報告した12。生成されたメラニンは、合成地下水から重金属を高効率で除去するために利用されました。しかし、中程度の最適化中に、成長と生成物形成に対するメラニンのもっともらしいフィードバック阻害が特定されました。したがって、このプロトコルでは、メラニンのフィードバック阻害が、一般化されたHan-Levenspielモデルを使用して調査および定量化されます。シンプルで効果的な吸着性バイオプロセスプロトコルは、フィードバック阻害を最大限に低減するために開発されています。

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プロトコル

1. Pseudomonas stutzeri 培養物の成長と維持

  1. MTCCチャンディーガル(凍結乾燥アンプルとして供給)から細菌 Pseudomonas stutzeri を入手します。
    1. アンプルの表面をアルコール(70%)で消毒します。ゲージの中央付近でアンプルに印を付け、印を付けた部分で破断します。
      注:内容物は真空中であるため、アンプルを開く際には注意が必要です。スナップ開口部が綿栓を一端に引き寄せ、急いで開口部を開くと微生物の凍結乾燥された微粒子が空気中に放出されるため、アンプルを壊すときは注意してください。
    2. 滅菌したピンセットで綿栓を慎重に取り外し、アンプルに0.3mLのLuria Bertani(LB)ブロスを加えます。30分間放置します。
    3. 懸濁液100μLを10 mLのLBブロス(100 mLコニカルフラスコ中)に接種し、37°Cに維持した180 rpmのインキュベーターシェーカーに入れます。 懸濁液100μLを固体LB寒天に同時に移し、広げて単離コロニーを得ます。37°Cで一晩インキュベートします。
  2. 培養物が成長したら、4°Cで保存します。
  3. 4週間ごとに、コロニーを新鮮なLB寒天プレートにストリーキングし、プレートを37°Cで一晩インキュベートしてコロニーが出現するまでサブカルチャーを行います。

2. メラニンの増殖と酵素活性の阻害に関する研究

  1. 人工海水に51.4 g/Lのグルコース、49.8 g/Lのココナッツケーキミール、0.09 g/L、0.03 g/L、0.05 g/LのCuSO4、FeSO4、MgSO4を添加して培地を調製します(材料表)。すべての実験は、200 rpm、37 °C、初期pH 7で15 mLの充填量を持つ250 mLの振とうフラスコで行います。
  2. バイオプロセスの開始時に、異なる濃度のメラニン(100 mg/L、200 mg/L、500 mg/L、1000 mg/L)を各培地に加えます。
  3. 追加されたメラニン濃度ごとに、バイオプロセスの異なる時間間隔で比増殖速度、細胞の酵素活性、およびメラニンを測定します(セクション3.2)。

3. メラニン阻害動態のモデル化

  1. 次のHanとLevenspiel13の一般化方程式を使用して、メラニン生成の阻害速度論をモデル化します。
    figure-protocol-1 (1)
    どこ
    μ = 見かけの比成長率 (1/h)
    μ max = 最大比成長率 (1/h)
    p = 製品濃度 (g/L)
    p *=成長が停止する臨界製品濃度(g / L)
    s = 基質濃度 (g/L)
    m,n = パラメータ
    上記の式は次のように書き直すことができます
    figure-protocol-2 (2)
    どこ
    figure-protocol-3 (3)
    および figure-protocol-4 (4)
    上記の方程式は、以下に示すように、1/μ と 1/s の二重逆数プロットに再配置できます
    figure-protocol-5 (5)
  2. 上記の式を使用して、さまざまな比成長速度と基質濃度のデータを使用して直線を描きます。Y軸とX軸の切片は、それぞれμ maxとKsを与え、これをそれぞれeqution 3と4で代入してμobsとKobsを得ることができます。
    式(3)は次のように書くことができます
    figure-protocol-6 (6)
  3. ステップ 2.2 で培養した培養物の比成長率を計算し、 μobs と名付けます。
  4. 式(6)のステップ3.3で取得した比成長率の値を使用します。データを線形方程式に当てはめ、傾きと切片を計算します。
  5. 式(3)を使用して、メラニンがない場合の最大比成長率を計算します。

4. 吸着性バイオプロセスの開発

  1. すべての実験は、200 rpm、37 °C、初期pH 7で15 mLの充填量を持つ250 mLの振とうフラスコで行います。
  2. ファイリング量が 3 L の 5 L 攪拌タンクバイオリアクターで、最適化された最終的なバイオプロセスを実施します。バイオリアクター研究において、培養物のpHを7〜7.5、溶存酸素を飽和度の50〜60%に維持します。

5.利用可能なさまざまな吸着剤から最適な吸着剤の選択

  1. アルミナ、ゼオライト、セライト、フラーズアース、活性炭などのさまざまな吸着剤を、培養ブロスを含むさまざまなフラスコに加えます。
  2. 各吸着剤を1 g / Lの濃度で別々に培養液に加え、150 rpmのロータリーシェーカーで12分間保持します。
  3. 吸着剤を5000 x g で10分間遠心分離し、分光光度計を使用して400 nmで上清の吸光度を測定します。
  4. 培養液からメラニンを最大限吸着する吸着剤を選択します。

6. 吸着剤の投与時間の影響

  1. バイオプロセスを開始し、吸着剤を添加して、培養物からのメラニンの吸着率が最も高い(セクション5の後に選択)。最初のステップで選択した濃度は1 g / Lです。
  2. 以前に公開されたプロトコル12に従って最大メラニン産生を測定します。
  3. バイオプロセスの開始から12時間後に吸着剤を追加してステップ6.1を繰り返し、バイオプロセスの異なる時間でのメラニン産生を測定します。
  4. バイオプロセスの開始から24時間後、36時間後、および48時間後に吸着剤を追加して、ステップ6.3を繰り返します。
  5. 各バイオプロセスランで生成されるメラニンを比較し、メラニンの生成と回収を最大化するための最適な投与時間を特定します。

7. 吸着剤の投与量の影響

  1. セクション6で特定した時点で、異なる濃度の最良の吸着剤(0.5、1、2、4、6、8、および10 g / L)を培養物に加えます。
  2. バイオプロセスを5000 x g で10分間遠心分離して回収します。
  3. 上清を採取し、400nmの吸光度を測定してメラニン量を算出します。
  4. 吸着剤を含むペレットを蒸留水とエタノールで各2回洗浄し、吸着剤に付着した細胞やその他の化合物を取り除きます。洗浄ステップは、5000 x g で10分間遠心分離して行います。
  5. 洗浄した吸着剤に0.1 M NaOH溶液を添加し、メラニンを脱離します。
  6. 混合物を5000 x g で10分間遠心分離し、分光光度計で400 nmの上清中のメラニン量を測定します。
  7. 脱着プロセスを3回、または吸着剤が通常の色に戻るまで繰り返します。
  8. この濃縮脱着メラニン溶液のpHを3以下に下げるには、磁気ビーズ付きスターラーを使用して1 N HClを添加してメラニンを沈殿させます。必要に応じて、酸性溶液を冷蔵庫に1時間保存して、降水量を増やします。
  9. このようにして得られた沈殿したメラニンを蒸留水で5000× g で10分間遠心分離することにより、蒸留水で3回洗浄し、乾燥させ、4°Cで保存する。

8. バイオプロセスの数理モデリング

  1. バイオマス成長速度論
    1. 以下の式14,15,16,17で説明されるように、製品の阻害のために開発された次の修正Verhulsetモデルを使用して、バイオマス成長率を定量化します。
      figure-protocol-7 (7)
      どこ
      x = バイオマス濃度 (g/L)
      xm = 最大バイオマス濃度 (g/L)
      μobs = 式 (2) で与えられる最大比成長率 (1/h)
      Vazquesら(2008)は、式(7)からバイオマス濃度についてさらに次の式を導き出しました
      figure-protocol-8 (8)
      どこ
      vx = バイオマス成長率 (g/L/h) = μOBS·X
      μobs       = 観測された比成長率 (1/h)
      τx = ラグタイム (h)
      t = 時間 (h)
    2. 式(8)を使用して、バイオプロセスのさまざまな時間におけるバイオマス濃度を計算し、 Pseudomonas stutzeriの成長プロファイルをシミュレートします。
  2. 基質消費動態
    注:この基質は、バイオプロセスにおけるバイオマスの成長、製品形成、およびメンテナンスに使用されます。
    1. 次の式を使用して、バイオプロセスにおける基質の利用率のバランスを取ります。
      figure-protocol-9 (9)
      グルコースの大部分はバイオマス生成に使用されます。したがって、単純化するために、製品形成のための基質消費を無視すると、式(9)は次のように減少します。
      figure-protocol-10 (10)
      どこ
      S = 基質濃度 (g/L)
      YP/S = 製品収率係数、すなわちメラニン収率(g/g)
      P = 製品濃度 (g/L)、すなわち、メラニン濃度 (g/L)
      YX/S = バイオマス降伏係数 (g/g)
      ms = 維持係数 (g/g/h)
      上記の式を時間t=0から時間t=tまで積分し、式(8)から x の値に代入すると、基質濃度プロファイル17について以下の式が得られ、
      figure-protocol-11 (11)
      ここで、 s0 = 初期基質濃度 (g/L)、 x0 = 初期バイオマス濃度 (g/L)
    2. 式(11)を使用して、バイオプロセスの異なる時間間隔での基質濃度を計算するか、基質濃度がわかっている場合は、同じ式を使用して方程式で与えられるパラメータを推定します。
  3. メラニン産生速度論
    1. Ludeking-Pirate方程式を使用して、メラニンの生成をシミュレートします。ただし、メラニンは成長に関連しているため、成長に関連しない生成物形成用語は無視され、簡略化された方程式は次のように書くことができます。
      figure-protocol-12 (12)
      どこ
      α = 成長関連製品形成に関連するLudeking-Pirate定数(g / g)
      式 (12) を時間 t = 0 から t = t に積分すると、製品濃度プロファイルの式は次のようになります
      figure-protocol-13 (13)
    2. 式 (13) を使用して αを計算します。
  4. 動力学パラメータ推定
    1. 上記のすべてのパラメータは、適切なソフトウェアツール(Microsoft Excelソルバーツールなど)を使用して、パラメータ推定の非線形最小二乗法によって推定します。
    2. バッチ実験データをパラメーター推定に使用し、ソルバーツールを使用して二乗誤差和 (SSE) を最小化します (次式で与えられます)。
      最小化する
      figure-protocol-14 (14)
      どこ
      xsim = シミュレーション値、 xexp = 実験値

9. 分析技術

  1. メラニン抽出
    1. 増殖培養物を5000 x g で10分間遠心分離し、バイオマスを除去します。
    2. 等量の1 M NaOHを上清に加えます。
    3. アルカリ性上清をpH 2に酸性化し、1 N HClを加えてメラニンを沈殿させます。
    4. 酸性化した上清を12000 x g で20分間遠心分離し、メラニンを収集します。
    5. 採取したメラニンを5mLの蒸留水で3回洗浄し、室温(RT)で一晩乾燥させ、4°C18で保存します。
  2. メラニン定量
    1. 人工海水(pH 8)に適量のメラニンを溶解することにより、さまざまな濃度のメラニン溶液(0〜500 mg / L)を調製します。
    2. 分光光度計18を使用して400nmでの吸光度を測定します。
    3. 上記のデータを使用して検量線を調製します。
    4. 増殖培養物を5000 x g で10分間遠心分離してバイオマスを除去し、400 nmで上清の吸光度を測定します。ステップ9.2.3で調製した検量線を使用して、増殖培養物中のメラニン濃度を計算します
  3. チロシナーゼアッセイ
    1. Renら(2013)19によって開発されたチロシナーゼ酵素アッセイについては、以下に示すプロトコルに従って、 Pseudomonas stutzeri 培養ブロスから抽出されたチロシナーゼの酵素活性を決定します。
    2. 細菌培養物を5,000 x g で遠心分離し、細胞を回収します。
    3. pH 6.5の冷100mMリン酸緩衝液で細胞を超音波処理し、ホモジネートを9000× g で15分間遠心分離し、チロシナーゼ酵素の供給源である上清を収集します。
    4. 上記ステップで得られた酵素溶液0.2mLを、1mMのL-チロシン(基質)を含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)2.8mLに加えます。
    5. 475nmの吸光度を測定することにより、ドーパクロームの形成を観察します。
    6. チロシナーゼ活性を次のように計算します。チロシナーゼ活性の1国際単位(IU)は、1分間に1μmolのL-チロシンをドーパクロムに酸化するために必要な酵素の量として定義されます。これをドーパクロームのモル吸光係数(3600L・M-1・cm-1)を用いて次式で計算します。
      figure-protocol-15 (15)
  4. バイオマスの推定
    1. 5 mLのサンプルを4時間間隔でBiosafetyキャビネットに収集し、無菌性を維持します。サンプルを採取する前後にフラスコの綿栓を炎にかけ、汚染の可能性を減らします。これらすべてのサンプルについて、660 nmでサンプルの光学密度(OD)を測定します。
      注:接種されていないメディアはブランクとして機能します。これらの測定値は、微生物の成長を研究するために使用されます。
    2. 培養液を5000 x g で10分間および4°C遠心分離し、細胞ペレットを回収し、ペレットを熱風オーブンで60°Cで8時間乾燥させて、乾燥細胞塊を得ます。
    3. ステップ 9.4.1 で測定した OD とステップ 9.4.2 で取得した対応するバイオマスを使用して、検量線を調製します
    4. 検量線(OD = 0.82μBiomass (g/L))を使用して、任意の時点での培養液の光学濃度を測定することにより、未知のバイオマス量を測定します。
  5. DNAの推定
    1. 260nmの光学密度を測定することにより、サンプル中のDNA量を推定します。
    2. 次の式を使用してDNAを計算します。
      figure-protocol-16 (16)
      どこ
      A260 = 260 nmでの吸光度
      0.1 = サンプルの体積
      1 = 濃度 50 μg/mL の DNA 標準液の吸光度、260 nm
  6. タンパク質の推定
    1. Bradfordタンパク質推定キット(Table of Materials)を使用して、サンプル中のタンパク質量を推定します。
    2. 上清0.1 mLにBradford試薬5 mLを加え、5分間保存します。上清中に存在するタンパク質は、ブラッドフォード試薬と反応して着色複合体を形成します。
    3. 分光光度計を使用して595 nm20での吸光度を測定します。
  7. 総還元糖(TRS)の推定
    1. ジニトロサリチル酸(DNS)法21によりTRSを測定する。
    2. 1 gのDNSを50 mLの蒸留水に溶解して、DNS溶液を調製します。この溶液に酒酸カリウムナトリウム30gを少量加え、溶液の色が乳白色になるまで加え、続いて透明なオレンジイエローに20mLの2N NaOHを加えます。蒸留水を使用して容量を最大100mLにし、暗所で保管します。
    3. グルコースワーキング溶液(0.01 M)を調製するには、標準フラスコで180 mgのグルコースを100 mLの蒸留水に溶解します。
    4. 標準的なグルコース溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL)を5つの別々の試験管にピペットで取り出します。蒸留水(1mL)を入れた試験管をブランク溶液として使用します。
    5. 蒸留水を使用して、各試験管の容量を最大2mLにします。
    6. 各試験管に1 mLのDNS試薬を加え、アルミホイルで覆います。
    7. 試験管を沸騰水浴で5分間加熱し、RTまで冷却します。
    8. 各試験管に9mLの蒸留水を加え、よく混ぜます。分光光度計を使用して、575 nmで内容物のODを測定します。
    9. X軸のグルコース量とY軸の575nm(A575)の吸光度で作成したキャリブレーションチャートを使用して濃度を測定します。
  8. 粒度解析
    1. 生合成したメラニンをソニケーターを使用して蒸留水(1mL)に分散させます。
    2. 分散したサンプル溶液(1mL)をナノ粒子分析装置に加え、メーカーのプロトコルに従って粒子サイズを測定します。
  9. 透過型電子顕微鏡(TEM)解析
    1. 抽出後に得られたメラニン粉末を60°Cで8時間保持して乾燥させます。
    2. メラニン粉末をTEMサンプルマトリックスにロードし、オペレータープロトコルに従って透過型電子顕微鏡を使用してサイズを測定します。

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結果

図1A、B は、異なる初期メラニン濃度の影響下での成長とメラニン産生を示しています。細胞増殖とメラニン産生は、メラニンの初期濃度の増加とともに大幅に減少しました。培地中のメラニン初期濃度が500 mg / Lの場合、バイオマスとメラニンは制御で得られた最大値のほぼ50%に減少しました。1000 mg / Lの初期メラニン濃度では、メラニン産生がわずかでした。.バイオマスの成長率は、1000 mg/Lの初期メラニン濃度で大幅に低下しました。 図1C は、異なる初期メラニン濃度での培養ブロスの細胞内チロシナーゼ活性を示しています。図で述べたように、チロシナーゼ活性は、ブロス中の1000 mg / Lの初期メラニン濃度の存在下で、対照と比較して4倍に減少しました。これらの結果は、培養中のメラニン濃度が高いほど、チロシナーゼ酵素活性と細胞増殖に悪影響を与えることを明確に示しています。

それに応じて解決策を得ることができるように、阻害の種類...

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ディスカッション

製品の阻害は、バイオプロセシングにおける主要なボトルネックであり、生産性の低下につながります。製品の阻害を減らすために、連続バイオプロセスやin situ製品除去技術など、いくつかの方法が存在します。しかし、これらの選択肢は、既存のバイオプロセシング施設23,24,25,26,27,28の完全なオーバーホールを必要とする。吸着型バイオプロセスは、既存の施設で大幅なオーバーホールを必要とせず、非常に簡単に実装できます。メラニンはチロシナーゼに対するフィードバック阻害を示し、Pseudomonas stutzeri培養物の成長を減少させました。成長...

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開示事項

著者には利益相反はありません

謝辞

私たちは、上記のプロトコルの開発に資金を提供してくれた科学技術省(DST/TSG/WP/2014/58)、インド、およびカルナータカ工科大学に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
 アルミナ+A15A26A3:A13A3:A16A3:A17HiMediaGRM1909
活性炭HiMediaPCT1001
人工海水媒体HiMediaM1942
ブラッドフォード試薬キットHiMediaML106
CeliteHiMediaGRM226
遠心分離機REMICM-8
遠心分離管HiMediaPW1207
ニトロサリチル酸HiMediaGRM1582
三角フラスコBorosil4980021
fuller's earthヒメディアGRM232
コースHiMediaメガバイト037HCl
ヒメディアAS004
L-チロシンHiMediaRM069
Microsoft Excelマイクロソフト
ナノ粒子分析装置HORIBA Scientificナノパルティカ SZ-100
栄養寒天培地HiMediaM001
ペトリプレートHiMediaPW054
リン酸緩衝液HiMediaM1452
水酸化ナトリウムHiMediaMB095
分光光度計サーモフィッシャーGenesys 10
攪拌タンク バイオリアクターScigenicsBioferm LS
TE バッファーHiMediaML060
透過型電子顕微鏡JEOLJEM-2100
ゼオライトHiMedia GRM3834
ジグル

参考文献

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