インスリン産生細胞への分化のためのラット脂肪組織間葉系幹細胞の単離

間葉系幹細胞(MSC)は、間葉系間質細胞としても知られており、再生医療に最も広く使用されている細胞型の1つです^1,2。それらは成体幹細胞に分類され、多系統分化能と自己複製能によって特徴付けられる³。MSCは、脂肪組織、骨髄、末梢血、臍帯組織および血液、毛包、および歯を含む様々な供給源から単離および得ることができる^4,5。

脂肪組織からの幹細胞の単離は、その容易なアクセス、インビトロでの急速な拡大、および高収率のために、魅力的で有望であると考えられている⁶。脂肪組織由来間葉系幹細胞(Ad−MSC)は、ヒト、ウシ、マウス、ラット、およびより最近ではヤギなどの異なる種から単離することができる⁷。Ad-MSCは現在、組織工学および遺伝子/細胞療法の潜在的な候補であり、軟部組織の損傷または欠損の長期修復のための自家的代替手段を開発するためにも使用できることが証明されています^7,8。

国際細胞遺伝子治療学会(ISCT)は、完全な特性評価のためにMSCが示さなければならない3つの最小基準を定義しています⁹。まず、それらはプラスチックに付着していなければなりません。第二に、MSCは、CD73、CD90、およびCD105などの間葉系幹細胞表面マーカーを発現し、造血マーカーCD45、CD34、CD14またはCD11b、CD79αまたはCD19、およびHLA-DRの発現を欠いている。最後に、MSCは、脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞の3つの間葉系譜に分化する能力を示すべきである。興味深いことに、MSCはまた、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、および上皮細胞などの他の系統に分化することができる^10,11。

実際、MSCは、さまざまな疾患の再生治療における潜在的な治療薬として適用することを可能にするユニークな特性を持っています。MSCsは可溶性因子を分泌して、治療上の利益をもたらす免疫調節環境を誘導することができる¹²。さらに、MSCは、標的療法を提供するために、傷害部位および腫瘍微小環境に移行することができる。しかし、そのメカニズムは完全には解明されていない¹³。さらに、MSCは、エキソソーム、非コードRNA、タンパク質、および可溶性因子の積み荷を運ぶナノスケールの細胞外小胞を分泌する能力を有し、これは最近、様々な疾患におけるMSCの治療可能性の新規メカニズムとして浮上した¹⁴。

さらに重要なことに、MSCは、遺伝子改変^15,16によって、またはin vitro¹⁷培養培地中の様々な外因性誘導因子を利用することによって、インスリン産生細胞(IPC)に分化する可能性について顕著な注目を集めている。IPC誘導期間は、使用される誘導プロトコルおよび使用される外因性因子に依存するため、大きく異なる。分化のプロセスは数日から数ヶ月続くことがあり、異なる段階で追加および/または撤回しなければならない外因性誘導因子の組み合わせを必要とする。内分泌膵臓分化に使用されているこれらの因子の多くは、インスリン分泌β細胞の増殖または分化/新生を促進し、および/またはIPCsのインスリン含量を増加させることが示されている生物学的に活性な化合物である¹⁸、¹⁹、^20、21。MSCsは、セクレトームを含むいくつかのメカニズム、ならびに幅広い免疫調節作用を介して糖尿病およびその合併症において治療効果を有することがここでも報告されていることは注目に値する^22,23,24。

このプロトコルでは、ラット精巣上体脂肪からのAd-MSCの単離および特性評価のための詳細な段階的プロトコルを提示し、続いてAd-MSCsからのIPCの生成のための単純で比較的短いプロトコルを提示する。

すべての実験は承認されたガイドラインに従って実施され、すべての手順はエジプトのカイロにあるエジプトの英国大学(BUE)の薬学部の倫理委員会によって承認されました。Ad-MSC分離プロトコルは、ロペスとスペンサーから採用され、^{修正15が加えられました}。

1. ラット精巣上体脂肪パッドからのAd-MSCの単離

1. 生後1ヶ月以下の体重250〜300gの雄のSprague-Dawleyラットを使用してください(隔離ごとに2匹)。動物を麻酔し、子宮頸部脱臼によってそれらを安楽死させる。安楽死させた動物に70%エタノールをスプレーする。腹部の下部の皮膚と筋肉を切除し、2つの精巣を引き抜いて精巣上体脂肪パッドを露出させます。
2. 精巣上体脂肪パッドをやさしくカットし、血管を切らないように注意してください。
3. 精巣上体を囲む脂肪組織を単離し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含むシャーレに入れる。
4. バイオセーフティキャビネットで、鉗子とメスを使用してこれらの脂肪パッドを小片に切ります。これらの切断した脂肪組織片を、10mLの滅菌PBSを含む50mL遠沈管に移す。
5. ミンチした脂肪組織を毎回10mLのPBSで5回洗浄し、汚染された血液を除去した。以下の洗浄手順は細心の注意を払って行わなければなりません。
   1. 10mLのPBSを組織に加え、45秒間十分に混合する。次に、チューブを5分間放置して2つの層に分離することにより、組織が重力を介して沈降するのを許します。
   2. 10mlシリンジを使用してインフラタントからPBSを吸引し、別の洗浄のために新鮮な10mLのPBSと交換する。
   3. PBSの血液がきれいになるまで、この洗浄ステップを4〜5回繰り返します。これは、すべてではないにしても、ほとんどの血液が除去されることを示しています。
6. 洗浄後、脂肪組織を10 mLのコラゲナーゼ溶液(PBS中の0.1%コラゲナーゼ1型)に再懸濁する。チューブをパラフィルムでしっかりと密封し、次いで組織がほぼ均質になるまで振とう水浴(37°C、80rpm、45分間)中でインキュベートする。
   注:組織の完全な消化(溶液が完全に均質になり、すべての組織残留物/片が完全に消失した場合)は、その後の細胞の培養に悪影響を及ぼすため、避けてください。通常、消化には30〜45分かかります。
7. コラゲナーゼ消化が完了したら、チューブを15秒間渦巻き、次に300 x gで5分間遠心分離 します。チューブを再び10秒間渦巻き、続いてさらに5分間遠心分離を行った。その後、3つの層が観察されます。油層を注意深く廃棄し、続いて水層を、間質血管画分(SVF)ペレットを乱すことなく廃棄する。
   注:脂肪細胞を含む上清とコラゲナーゼ溶液を除去する。まず、脂肪細胞および付随する油層を10mLピペットで除去して油滴を完全に除去し、次いでその下の水層を除去する。
8. チューブの底部にあるSVFペレットを滅菌BSA溶液(1%アルブミン、PBS中のウシ血清フラクションV溶液)10mLに再懸濁し、次いでチューブを300 x gで5分間遠心分離する。
9. 遠心分離後、上清を捨て、SVFペレットをAd-MSC用の8.5mLの完全培地(10%FBS、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、0.25μg/mLアンホテリシンB、および2mM L-グルタミンを添加したダルベッコの改変イーグル培地/栄養混合物F-12[DMEM/F12]培地で構成)に懸濁します。
10. 細胞を25cm2フラスコ中で培養し、5%^CO2 下37°Cで_{培養する。} 翌日、付着した細胞を確認し、浮遊細胞を取り出し、培地を交換してください。その後、1日おきにメディアを交換してください。
11. 細胞が80%〜90%コンフルエントである場合には、トリプシン-EDTAを用いて5〜7日ごとに細胞を継代する。継代3〜5の間の細胞を、このプロトコールに記載される後続の実験に使用する。すべての絶縁ステップの概略図を 図1に示します。
    注:通常、トリピス-EDTAの効力はサプライヤーによって異なる可能性があるため、細胞への毒性作用を避けるためにトリプシン処理の時間を最小限に抑えるようにしてください。

2. フローサイトメトリー解析を用いたイムノフェノタイピングによるAd-MSCのキャラクタリゼーション

1. 継代3で、トリプシン-EDTAを用いて細胞を分裂させた。PBSで2回洗浄し、血球計数器で細胞を計数する。
2. 100,000個の細胞を、フルオレセイン−イソチオシアネート(FITC)で標識したマウス抗ラットCD90またはCD105(間葉系マーカー)またはCD34(造血マーカー)モノクローナル抗体のいずれかと共に暗所で4°Cで20分間インキュベートする。
3. 細胞を洗浄し、500 μLのFACSバッファーに懸濁します。フローサイトメ^トリー25により分析する。

3. 単離されたAd-MSCの様々な間葉系への分化能の評価

1. 脂肪原性分化
   1. 細胞を完全な培地に再懸濁し(ステップ1.9に記載)、次いで、²⁴ ウェル組織培養プレート中で3.7 x 104細胞/ウェルの密度で細胞を培養する。5%_CO2の加湿雰囲気中37°Cでインキュベートする。次に、細胞がほぼ100%コンフルエントに達するまで3日ごとに培地を交換しますが、通常は3日かかります。
   2. 細胞が所望のコンフルエントに達したら、増殖培地を脂肪生成分化培地(10%FBS、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、0.25μg/mLアンホテリシンB、および2mM L-グルタミンを1x脂肪生成サプリメントで添加したLG-DMEM培地からなる)と交換し、間葉系幹細胞機能識別キットを付属する。その後、3 日ごとに培地を交換します (0.5 mL/ウェル)。脂質液胞を乱さないように培地交換を穏やかに行うように注意してください。
   3. 21日後、脂質液胞外観の顕微鏡検査およびオイルレッド染色により脂肪生成分化を評価した。
   4. オイルレッド染み30mgをイソプロパノール10mLに溶解してオイルレッドの原液を調製し、室温で少なくとも20分間保持する。その後、原液3部と二重蒸留水2部(_ddH2O)を混合して作業液を調製し、よく混合し、室温で10分間保持した後、ろ紙でろ過する。
   5. 脂肪分化を文書化するには、細胞をPBSで2回洗浄し、中性緩衝ホルマリン10%(0.75ml/ウェル)を使用して15分間固定します。その後、1mL/ウェルを用いてPBSで細胞を2回洗浄し、毎回5分間インキュベートする。オイルレッドの作業溶液を追加する前に、PBSを完全に吸引することが重要です。
   6. 最後の洗浄後、オイルレッド作業溶液を細胞に加え、37°Cで60分間インキュベートします。 その後、染色液を除去し、PBSで細胞を2回穏やかに洗浄する。染色された脂肪滴を顕微鏡下で観察する。
2. 骨形成分化
   1. 24ウェルプレートに7.4 x¹⁰³ 細胞/ウェル(0.5 mL培地/ウェル)をシードし、それらを完全培地(ステップ1.9に記載)中の5%_CO2 の加湿雰囲気中で37°Cで3日間インキュベートし、ほぼ70%コンフルエントに達する。
   2. 10% FBS、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、0.25 μg/mL アンホテリシン B、および 2 mM L-グルタミンを添加した LG-DMEM 培地で、骨形成サプリメント (キットに付属) で細胞を誘導します。
   3. 骨形成誘導を21日間継続し、3日ごとに分化培地を交換した。
   4. アリザリンレッドS染色剤200mgを9mLのddH2O_に溶解してアリザリンレッドS染色剤の作業液を調製し、水酸化アンモニウムおよびHClを用いてpHを4.1〜4.3に調整する。次に、_ddH2Oで体積を10mLに構成する。これに続いて、ろ紙を用いた濾過により析出物を除去した。
   5. 細胞をPBSで2回洗浄し、10%緩衝ホルマリン(0.75mL/ウェル)を使用して15分間固定します。その後、PBS(1mL/ウェル)を用いて細胞を2回洗浄する。毎回、細胞を5分間インキュベートする。
   6. 固定細胞を調製した2%アリザリン-Red S溶液と共に37°Cのインキュベーター内で30分間インキュベートする。
   7. その後、染色液を除去し、細胞をddH2Oで2回、PBSで₁回洗浄した後、染色したカルシウムリッチ細胞外マトリックスを観察し、顕微鏡下で骨形成分化を評価した。
3. 軟骨形成分化
   1. 24ウェルプレートに7.4 x¹⁰³ 細胞/ウェル(0.5 mL培地/ウェル)をシードし、これらを完全培地(ステップ1.9に記載)中の5%_CO2 の加湿雰囲気中で37°Cで3日間インキュベートし、ほぼ70%コンフルエントに達する。
   2. 所望のコンフルエントに達したら、インスリントランスフェリンセレン(ITS)、軟骨形成サプリメント(キット付属)、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、0.25μg/mLアンホテリシンB、および2mM L-グルタミン21を含む無血清DMEM/^F12を用いて細胞の軟骨形成分化を誘導する。
   3. 細胞を軟骨形成培地と共に21日間インキュベートし、3日ごとに軟骨形成分化培地を交換した。
   4. アルシアンブルー8GX染色剤の作業溶液を以下のように調製する:まず、97mLのddH2Oに3mLの氷酢酸を加えて_ddH2O中の3%氷酢酸溶液を調製する。次いで、100 mLの3%氷酸溶液に0.1 gを混合してアルシアンブルー8GX染色剤の作業溶液を調製し、ろ紙を用いた濾過により析出物を全て除去した。
   5. 細胞をPBSで2回洗浄し、10%緩衝ホルマリン(0.75mL/ウェル)を使用して15分間固定します。その後、PBS(1mL/ウェル)を用いて細胞を2回洗浄する。毎回、細胞を5分間インキュベートする。
   6. 次のステップは、調製した0.1%アルシアンブルー8GX染色剤中の細胞を3%氷酢酸中で37°Cで60分間インキュベートすることである。 染色した細胞をddH2Oで2回、PBSで₁回洗浄し、染色した硫酸化プロテオグリカンを顕微鏡下で観察した。

4. アドMSCとIPCの差別化

1. 継代3で、トリプシン-EDTAを用いてAd-MSCを分割する。まず、培地を除去し、次いで、培養フラスコに付着したまま細胞を5mLのPBSで洗浄する。次に、5mLのトリプシン-EDTAを75cm2フラスコに加え、37°Cで3〜10分間インキュベートする。
   注:遅い継代は細胞の性質および分化能力に悪影響を及ぼすので、早期継代、通常はP3〜P5の間に細胞を誘導してみてください^17,24。
2. その後、細胞が剥離していないか、および単一細胞懸濁液であるかを検査する。5mLの完全DMEM/F12培地をフラスコに加え、トリプシン作用を阻害する。細胞懸濁液を集めて15 mLチューブに移し、さらに5 mLのDMEM/F12培地をチューブに加えます。
3. 細胞を300 x gで2分間遠心分離し、細胞をペレット化する。
4. PBSで細胞を一度洗浄し、300 x gで2分間再び遠心分離し、細胞ペレットを3〜5mLの完全DMEM/F12培地に再懸濁した。
5. トリパンブルー排除色素および血球計数器を用いて細胞を計数する。
6. 次いで、細胞を6ウェルプレート(1 x 106細胞/プレート)および12ウェルプレート(GSISアッセイ用;1 x¹⁰⁶細胞/プレート)に播種し、37°C、5%_CO2インキュベーター内で完全培地(ステップ1.9に記載)中で3日間インキュベートし、ほぼ90%コンフルエントに達する。
7. 誘導当日に、培地を取り出し、PBSで細胞を洗浄した後、誘導前培地(10%FBSを添加したDMEM/F12、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、0.25μg/mLアンホテリシンB、2mM L-グルタミン、10mMニコチンアミド[NA]、および1mM β-メルカプトエタノール[β-ME])により、細胞を2日間前誘導する。
8. 2.5% FBS、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、0.25 μg/mL アンホテリシン B、2 mM L-グルタミン、10 mM NA、および 1mM β-メルカプトエタノールを添加した高グルコース DMEM(HG-DMEM、4.5g/L グルコース) を使用して、さらに 1 日間細胞を誘導します。この段階の終わりに細胞ペレットを採取する(このプロトコルではD3細胞と指定)。
9. 2.5% FBS、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、0.25 μg/mL アンホテリシン B、2 mM L-グルタミン、10 mM NA、1mM β-メルカプトエタノール、および 10 nM エキセンディン-4 を添加した HG-DMEM からなる最終分化誘導培地で、細胞をさらに 7 日間インキュベートします。
10. 指定された期間の終わりに、細胞ペレット(このプロトコールではFinalと命名)を収集し、DTZ染色およびGSISアッセイによって細胞の分化の成功を評価する。
11. 生成された IPC を評価するには、以下の手順 5 と 6 に従います。

5. ジチゾン染色

1. ジチゾン(DTZ)染色ストック溶液を以下のように調製する:25mgのDTZを2.5mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に完全に溶解させ、アリコートに分割し、使用時まで暗所で−20°Cで保存する。
2. 染色のために、ストック溶液を完全な培養培地(5%FBSを添加したHG-DMEM、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、0.25μg/mLアンホテリシンB、および2mM L-グルタミン)で希釈することによって、1:100(容量/容量)の作業溶液を調製する。次に、0.2μmのシリンジフィルターで作業溶液をろ過します。
3. 次に、6ウェルプレート中の培養細胞を同定したDTZ染色について、培養培地を吸引した後、PBSで細胞を1回洗浄し、次いで2mLのDTZ作用溶液を各ウェルに加える。CO2インキュベーター内で37°Cで少なくとも₂ 時間インキュベートする。
4. 細胞をPBSで2回慎重に洗浄する。最後の洗浄後、各ウェルに2mLのPBSを加える。その後、真紅に染色されたIPCを倒立顕微鏡で観察する。完全増殖培地(10% FBS - DMEM/F12)で最初に培養した非誘導Ad-MSCを対照として使用してください。

6. RT-qPCRによるβ細胞マーカーの遺伝子発現

1. RNA抽出
   1. 分化後、細胞ペレットを収集し、使用時まで−80°Cで保存する。各細胞ペレット(プールされた1つの6ウェルプレートの6つのウェルに由来する)を1.5mLヌクレアーゼフリーチューブ内の1mLのチオシアン酸グアニジウムRNA抽出試薬に懸濁し、数回上下にピペッティングする。溶解したサンプルを室温で5分間インキュベートして、核タンパク質複合体の完全な解離を可能にする。
   2. RNA抽出試薬1 mLあたり200 μLのクロロホルムを加え、チューブをしっかりとキャップして手で15秒間激しく振とうします。次に、室温で3分間インキュベートする。
   3. サンプルを 13,800 x g で 4 °C で 15 分間遠心分離します。 これにより、混合物が下部クロロホルム相、間相、および無色の上部水相に分離され、RNAは水相に残ります。
   4. 上部水相を新しいチューブに入れ、相間に触れないように注意する。
   5. 600μLの100%イソプロパノールを水相(1:1容量)に加え、次いで、サンプルを25回反転させて十分に混合し、室温で10分間インキュベートする。
   6. サンプルを 18,800 x g で 4 °C で 30 分間遠心分離します。 沈殿したRNAはチューブ側で小さなゲル状のペレットを形成する。
   7. 上清を除去し、ペレットを1mLの80%氷冷エタノールで洗浄する。エタノールを加えた後、RNAペレットの複数回のピペッティングを10秒間ゆっくりと行う。
   8. サンプルを4°Cで9,600 x g で5分間遠心分離します。 上清を捨て、RNAペレットを5〜10分間風乾させておく。
   9. 乾燥後、1.5 mL ヌクレアーゼフリーチューブで完全に可溶になるまで数回上下にピペッティングすることにより、RNaseフリー水 25 ~ 100 μL (初期ペレットサイズによる) に RNA ペレットを溶解します。RNAペレットの過度の乾燥を避けてください。
      注:通常、ペレットは乾燥すると透明になります。ただし、透明になったら、ペレットの過度の乾燥を避けるために、速やかに再懸濁してください。
   10. ヌクレアーゼを含まない水をブランクとして使用して、260nmおよび280nmにおける光学密度(OD)を決定することによってRNAを定量する。
   11. サンプルの OD260/OD280 = 1.8-2.0 であることを確認します。
2. cDNA合成
   1. cDNA合成キットを用いて単離された全RNAからcDNAを合成する。
   2. 製造元の指示に従ってcDNA合成反応を行う。200 μL PCRチューブで、0.5 μgの総RNAを含む容量のRNA溶液を 表1に示す反応マスターミックスに加える。
   3. RNAをマスターミックスに加えた後、サーマルサイクラーを用いて、50°Cで30分間のサイクルプログラムを通して混合物を1サイクル、続いて95°Cで2分間の不活化サイクルを通して混合物に入る。
   4. ヌクレアーゼを含まない水を使用して cDNA を終濃度 2 ng/μL に希釈し、その後の RT-qPCR のために -20 °C で保存します。
3. SYBR グリーンマスターミックスを使用した RT-qPCR
   1. 表2に示す反応ミックスに従ってcDNA鋳型を用いて各標的遺伝子についてRT-qPCR反応を行った。すべての対策を3連で行います。
   2. 用いたプライマーのセットを 表3に示す。すべての RT-qPCR 手順を氷上で実行します。
   3. デフォルトのプログラム設定でリアルタイムPCRマシンを使用してRT-qPCR反応を行います。熱サイクル条件は、初期変性95°Cで10分間、その後45サイクルの変性(95°C、15秒)と複合アニーリング/伸長(60°C、1分)でした。
   4. _Ct値を決定し、^2-ΔΔCtに従って発現レベルを検出し、内部対照としてβ-アクチンを用いた。

表1:cDNA合成マスターミックス容量。

表2:RT-qPCR反応混合物。

表3:フォワードおよびリバースプライマー配列。

7. グルコース刺激インスリン分泌

1. クレブのリンゲル重炭酸塩(KRB)バッファーの調製
   1. グルコース刺激インスリン分泌(GSIS)アッセイ用に、2 mM グルコース (低グルコース) および 20 mM グルコース (高グルコース) 濃度の両方を含む Kreb のリンゲル重炭酸塩 (KRB) バッファー溶液を調製します。KRB緩衝液調製に用いた成分を 表4に示す。
   2. 1 N HClを使用して緩衝液のpHを約7.25〜7.35(すなわち、濾過中に上昇する可能性があるため、所望のpH 7.4より0.1〜0.2単位低い)に調整する。
   3. ウシ血清アルブミン(BSA)を0.1%(重量/体積)の濃度で新鮮に加える。
   4. その後、グルコースを加える(50 mLのKRBに対して18 mgを2 mM低グルコースKRB緩衝液を調製し、50 mLのKRBに対して180 mgを20 mM高グルコースKRB緩衝液を調製する)。
   5. 調製したLGおよびHG KRB緩衝液を0.2μmのシリンジフィルターでろ過して滅菌し、GSISアッセイの準備を整えます。
2. GSISアッセイ
   1. 最初に12ウェル細胞培養プレートに1 x¹⁰⁵ 細胞/ウェルをシードし、まったく同じ分化誘導プロトコールを使用してこれらの細胞を誘導する。
   2. 誘導プロトコルの最後に、生成されたIPC(プレート内)をPBSで2回、LG-KRBで1回静かに洗浄します。
   3. その後、IPCを300μLのLG-KRB/ウェルとともに1時間インキュベートし、このバッファーを廃棄します。
   4. 次に、IPC を 300 μL の 2 mM (LG) または 20 mM (HG) KRB バッファーと共にさらに 1 時間インキュベートします。インキュベーション期間の終わりに、上清を収集し、市販のELISAキットを使用し、製造業者の指示に従って、その後の分泌インスリンアッセイのために−80°Cで保存する。
      注: GSIS アッセイを行うときは、PBS および KRB バッファーを吸引または添加しながら、できるだけ穏やかにしてください。

表4:KRB緩衝液調製に用いた成分。

8. 統計解析

1. 全てのデータを平均±平均の標準誤差(SEM)として表す。すべての比較は、一元配置分散分析(ANOVA)と統計ソフトウェアを使用したTukeyのポストホック検定を使用して行われました。p値 ** pが0.01、 *p が0.05≤結果≤統計的に有意であると考えられた。

広告MSCの分離と特性評価
図 2に示すように、脂肪組織から単離された細胞は、単離の翌日から始まる丸みを帯びた線維芽細胞様細胞の不均一な集団を示した(図2A)。単離後4日目に、線維芽細胞は、継代1によって均質な集団として増殖し、数およびサイズの増加を始めた(図2B、C)。これらの細胞は、継代3まで示されるように塑性接着性線維芽細胞様細胞として増殖し続け、MSC特性の第1の基準を満たした(図2D)。これらのAd-MSCは非常に良好な培養特性を示し、このプロトコルは、精巣上体脂肪パッドからAd-MSCを単離するための関連性があり、簡単で、比較的速いプロトコルであることが判明した。

次のステップは、孤立したAd-MSCを特徴付けることでした。ISCTによると、MSCは、可塑性接着、造血マーカーの欠如を伴う間葉系CDの発現、および脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞への分化能力の3つの基準に従うべきである。 図3Aに示すように、フローサイトメトリー分析は、これらの細胞のほとんどがCD90およびCD105(それぞれ76.4%および73.6%)を発現することを示した。一方、CD34(0.1%)についてはほぼ陰性であった。

また、これらの細胞を分化誘導すると、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞への分化能を示した。 図3B (上パネル)に示すように、脂肪細胞は、対照非誘導細胞と比較した場合に脂質液胞のオイルレッド染色を示した。この骨細胞は、対照細胞と比較したときに特徴的なアリザリンレッド染色(図3B、中央パネル)を示した。最後に、軟骨細胞誘導細胞は、対照非誘導細胞と比較した場合に細胞外マトリックスの青色染色を示した(図3B、下部パネル)。

これらのデータは、脂肪組織から単離された細胞が良好な培養特性を示すだけでなく、MSCに対して提案されたすべての基準を示すことを明らかに示している。

Ad-MSCのインスリン産生細胞(IPC)への分化
図 4A に示すように、Ad-MSC を IPC に区別するために、比較的単純で短いプロトコルを使用しました。分化誘導後、誘導されたIPCsをいくつかの方法で評価した。誘導された細胞は顕著な形態学的変化を示した。図4B(上パネル)に示すように、誘導細胞は、Ad−MSCsの正常な線維芽細胞様形態と比較した場合に丸みを帯びたクラスター様形態を示した。興味深いことに、ジチゾンで染色した際、これらのクラスターは、β細胞染色の亜鉛顆粒の特徴である真紅染色を示した(図4B、下パネル)。

その後、生成されたIPCを、非誘導対照細胞と比較した場合の特異的β細胞マーカーの発現について遺伝的に評価した。図5A−Eに示すように、誘導された細胞は、種々の特異的β細胞マーカーを発現することができ、IPCを生成するそれらの能力を示す。また、FOXA2-おける内胚葉マーカー(図5Aに示すように)-については、コントロールと比較するとD3分化時に高発現しており、ほぼ30倍に達し、その後、最終分化細胞においてコントロールのわずか10倍に減少した(D3:28.37±0.88;決勝: 12.10 ± 1.27;p<0.05)。Pdx-1(β細胞の初期マーカーと考えられている)に関しては、D3および最終分化細胞の両方で上昇し、対照の非誘導細胞と比較するとほぼ20倍に達した(D3:22.39±5.14;決勝: 17.13 ± 0.342;p< 0.05;図5B)。他のβ細胞マーカー、すなわちNKX6.1、MafA、およびインスリン-1(Ins1)に関しては、それらはすべて、対照の非誘導細胞と比較した場合、D3から最終分化までの上昇を示し、それぞれほぼ8倍、12倍、および300倍に達し±(NKX6.1:D3:1.94 ± 0.86、最終:7.97<1.34、p0.05;MafA: D3: 6.59 ± 0.4, ファイナル: 11.54 ± 2.40, p < 0.05;Ins1:D3:27.29±20.27、最終:318.20±76.09、p<0.05)(図5C-E)。このことは、これらのAd-MSCがβ細胞マーカーを発現するIPCに分化できることを示している。

最後に、これらの細胞を、グルコースの濃度の増加で挑戦したときのインスリンの分泌について評価した。 図5Fに示すように、誘導されたIPCの上清中に分泌されたインスリンは、20mMグルコースでチャレンジされたときに分泌されたインスリンよりも有意に高かった(HG:390pg/mL±33pg/mL;LG: 234 pg/mL ± 32 pg/mL, p < 0.05; 図5F)

これらのデータは、使用されたプロトコルがAd-MSCをIPCに分化させることに成功したことを確認し、遺伝的および機能的に確認された。

図1:Ad-MSCの絶縁と特性評価に使用されるプロトコルの手順の概略図。Biorender.com によって生成されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

(A)プラスチック接着性、線維芽細胞様形態を示す単離細胞は、単離の翌日に現れ始める。(B)時間の経過とともに、これらの付着性Ad−MSC(線維芽細胞様形態を有する)は増殖および数の増加し、(C)P1および(D)P3においてより均質な線維芽細胞様集団に到達する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

(A)Ad-MSCのフローサイトメトリー分析は、これらの細胞がCD34に対してほぼ陰性であるのに対し(上のパネル)、大多数の細胞はCD90およびCD105を発現している(下のパネル)。Ad-MSCは、3つの間葉系、すなわち(B)脂肪細胞(油滴が油赤で染色される)、(C)アリザリンレッドで染色された骨細胞、および(D)アルシアンブルーによって染色された軟骨細胞(対照の非誘導細胞と比較した場合)に分化することができる。対照:未誘導細胞、差分:分化細胞。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:Ad-MSCからIPCへの分化(A)Ad-MSCからIPCを生成するために使用される分化プロトコルの概略図と、IPCへの分化誘導中の各段階の細胞の顕微鏡写真。分化すると、細胞は線維芽細胞の形態を失い、凝集してクラスターを形成する傾向があり、クラスターは懸濁培地中で剥離および増殖する傾向がある。(B)顕微鏡写真は、非誘導のAd−MSCの線維芽細胞様形態(左パネル)、未染色(上パネル)、またはDTZ染色(下パネル)と比較した場合、丸いクラスター形態学的変化(右パネル)を示す上記のプロトコルによって生成された対照Ad−MSCおよびIPCを示す。
対照:未誘導細胞;IPCs:インスリン産生細胞;NA:ニコチンアミド;β-ME:ベータメルカプトエタノール;D3:IPCsへの分化誘導中の3日目に誘導された細胞;D10:誘導プロトコルの最後に最終分化したIPCs;Ex-4: エキセンディン-4. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:IPCのβ細胞マーカーおよびGSISの相対発現レベル。 (A)FOXA2、(B)Pdx-1、(C)NKX6.1、(D)MafA、および(E)Ins-1に対するqRT-PCRによる相対発現レベル。(f)生成されたIPCsを2mMグルコース(LG)または20mMグルコース(HG)で挑戦したときの上清中の分泌インスリンのレベル。対照:未誘導のAd-MSCs、3日目:D3で収集された分化細胞;最終: 最終的な差別化された IPC です。LG:低グルコース;HG:高グルコース。a:p<0.05において平均が対照と異なる;b:p<0.05において平均が3日目と異なる;*:LGの平均はp<0.05でHGと異なる。比較は、独立サンプルt検定を用いて行った。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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