ランゲンドルフ調製における新生児マウス心臓の使用のための修正技術

サマリー

本プロトコールは、大動脈カニュール化および 元インビボ 新生児マウス心臓の逆行性灌流を記載する。 解剖顕微鏡と鈍い小さなゲージ針を使用した2人戦略により、信頼性の高いカニューレが可能になります。縦方向の収縮張力の定量化は、左心室の頂点に接続された力伝達器を用いて達成される。

要約

エクスビボ逆行性灌流心臓の使用は、1世紀以上前にオスカー・ランゲンドルフによって開発されて以来、長い間虚血再灌流研究の礎石となってきました。 この技術は過去25年間にわたってマウスに適用されてきたが、この種におけるその使用は成体動物に限られていた。新生児マウス大動脈を一貫してカニューレ化する成功した方法の開発は、遺伝的に改変可能で低コストの種における心臓発達の重要な時期に単離された逆行性灌流心臓の系統的研究を可能にするであろう。ランゲンドルフ調製物の改変は、虚血時間を最小限に抑えながら、新生児マウス心臓におけるカニューレおよび再灌流の確立を可能にする。 最適化には、解剖顕微鏡および改変された市販の針を用いた新生児マウス大動脈のカニューレを成功裏に可能にするために、2人技術が必要である。 このアプローチの使用は、3分以内に逆行性灌流を確実に確立する。新生児マウスの心臓および心室腔サイズの脆弱性は、バルーンを使用して発生する脳室内圧の直接測定を妨げるので、縦方向の収縮緊張を定量化するために、左心室の頂点に縫合糸によって接続された力トランスデューサの使用が必要である。この方法により、研究者は単離された定流量逆行性灌流新生マウス心臓製剤を首尾よく確立することができ、発生心臓生物学をエクスビボ方式で研究することを可能にする。重要なことに、このモデルは、新生児の心臓における虚血再灌流に対する生理学的および薬理学的応答を調査するための強力なツールとなるであろう。

概要

生体外 心臓製剤は、1世紀以上にわたり、生理学的、病態生理学的、および薬理学的研究の定番となってきた。1860年代のElias Cyonの研究に端を発するオスカー・ランゲンドルフは、単離されたカエルモデルを逆行性灌流に適応させ、大動脈根を加圧して酸素化灌流液¹で冠状動脈の流れを提供しました。ランゲンドルフは、彼の適応を用いて、冠状動脈循環と機械的機能²との間の相関関係を実証することができた。後にランゲンドルフ法と呼ばれる 元生体 逆行灌流心臓は、生理学的研究の礎石であり続けており、その単純さを利用して、潜在的な交絡因子が存在しない状態で孤立した心臓を強力に研究しています。ランゲンドルフ調製物は、心臓が排出され(いわゆる「働く心臓」)、灌流液が再循環することを可能にするようにさらに修正された³。しかし、関心のある主要な生理学的エンドポイントは変わっていません。このようなエンドポイントには、収縮機能、電気伝導、心臓代謝、および冠状動脈抵抗の尺度^{が含まれる4}。

彼の最初のカエルの心臓製剤における心機能を評価するために、ランゲンドルフは、心臓の頂点と力のトランスデューサとの間に接続された縫合糸を使用して、縦軸における心室収縮によって生じる張力を測定した。^5ア イソメトリック収縮は、心室充填の非存在下で心臓に基礎張力を加えてこのようにして定量化した。アプローチの改良は、等体積収縮中の心筋性能を評価するために、左心房 を介して 左心室に液体充填バルーンを配置する^{ことにつながった6}。心臓のリズムと心拍数を評価するために、表面リード線を心臓の両極に配置して、治験責任医師が心電図を記録できるようにします。しかし、義務的な脱神経を考えると、相対的な徐脈が期待できる。外因性ペーシングは、これを克服し、実験¹間の心拍変動を排除するのに役立ち得る。別の転帰尺度は、心筋代謝、冠状動脈灌流液および廃液中の酸素および代謝基質含有量を測定し、それらの差を計算することによって評価することができる⁷。冠状動脈流出液中の乳酸塩定量は、低酸素、低灌流、虚血再灌流、または代謝摂動に見られるように、嫌気性代謝の期間を特徴付けるのに役立ちます⁷。

ランゲンドルフの独創的な研究は、ネコを主な主題として用いた、生体外哺乳類の心臓の研究を可能にした⁵。孤立したラット心臓の評価は、1967年に「働く心臓」ラットモデルを詳述したハワード・モーガンとともに1900年代半ばに人気を博した⁵。マウスの使用は、技術的な複雑さ、組織の脆弱性、および比較的小さなマウスの心臓サイズのために、わずか25年前に始まった。マウス研究に関連する課題にもかかわらず、遺伝子操作の低コストおよび容易さは、そのようなマウスのエクスビボ調製物の魅力および需要を増加させている。残念なことに、この技術の適用は成体動物に限定されており、^{ごく最近まで8,9}まで、生後4週間の幼いマウスがex-vivo研究に利用された最年少の被験者でした。幼体マウスは成体と比較して「比較的未熟」であるが、発生生物学研究の被験者としての有用性は、概して出生ダムから離乳しており、まもなく思春期が始まるため、制限されている¹⁰。思春期は、グルコースおよび乳酸から脂肪酸への心筋基質利用の出生後の移行をはるかに超えて起こる¹¹。したがって、新生児の心臓における代謝変化に関するほとんどの情報は、歴史的にウサギやモルモットなどのより大きな種におけるエクスビボ作業の結果である¹¹。

実際、ランゲンドルフ調製物に対する代替アプローチが存在する。これらには、臓器全体の機能データおよび文脈を欠いているインビトロ実験、またはインビボ研究が含まれる。これは、必要な麻酔薬の心血管および呼吸効果、神経体液性入力の影響、深部温度の結果、動物の栄養状態、および基質の利用可能性などの交絡変数によって技術的に困難で複雑になり得る^12,13。ランゲンドルフのアプローチは、そのような交絡因子の不在下で、より制御された方法で、単離灌流された心臓をエクスビボで研究することを可能にするので、それは強力な治験ツールと考えられてきました。したがって、ここで提示された技術は、新生児マウス心臓のエクスビボ研究のための実験的アプローチを研究者に与え、再灌流までの時間を制限する。

発達期間中の心臓の調査は、心筋成熟期に起こる広範囲の生化学的、生理学的、および解剖学的移行を考えると、重要な考慮事項である。嫌気性代謝から酸化的リン酸化への移行、基質利用の変化、および細胞増殖から肥大への進行は、未熟な心臓において一意に起こる動的プロセスである^11、14。発達中の心臓のもう一つの重要な側面は、必要な期間に遭遇するストレッサーが新生児の心臓により高い反応を生み出し、成人期の侮辱に対する将来の感受性を変える可能性があることです¹⁵。これまでの研究では、ランゲンドルフ灌流型新生児心臓を研究するために新生児のラット、子羊、ウサギを利用してきたが、発生生物学研究におけるこの種の重要性を考えると、マウスの使用を許可する進歩が必要である¹⁶。このニーズに対処するために、10日齢の動物を用いた最初のマウスランゲンドルフ灌流新生児心臓モデルが最近確立されました⁶。ここで提示されるのは、成功した大動脈カニューレーションを可能にし、単離された新生児マウス心臓の逆行性灌流を確立する方法である。このアプローチは、全器官機能に焦点を当てた薬理学、虚血再灌流、または代謝研究に利用され得るか、または心筋細胞の単離に適合させることができる。

プロトコル

コロンビア大学医療センターの施設動物ケアおよび使用委員会の承認は、記載されているすべての方法について得られた。野生型C57Bl/6雄生後10匹のマウスを本研究に使用した。

1. ランゲンドルフ装置の作製

1. 複雑さを最小限に抑えるには、ランゲンドルフ装置( 材料表を参照)内で、一定の流量または一定の圧力 を介して 、非再循環酸素化灌流液を使用してください。
   1. 120 mmol/LのNaCl、4.7 mmol/LのKCl、1.2 mmol/LのMgSO4、1.2 mmol/LのKH_{2 PO4}、1.25 mmol/LのCaCl_2、25 mmol/LのNaHCO₃、および11 mmol/Lのグルコースを含むKrebs-Henseleit緩衝液(KHB)を使用し(材料表を参照)、ランゲンドルフ装置内で95%のO2および5%の_CO2と平衡化し、37°Cで維持する。
2. 定流量アプローチでは、連続流量を約 2.5 mL∙^min-1 に維持します。
   注:この流量は、10日齢(P10)マウス心臓の平均体重が〜30mg ^17,18であることを考えると、〜⁷⁵〜^80mL / g∙minの冠状動脈流量に近似する。

2. 大動脈カニューレの作製

1. 26Gのステンレス製の針から新生児マウス大動脈カニューレを作製する( 材料表を参照)。鋭いはさみを使用して、針の先端を切り取って端を鈍らせます。針内腔の直径を圧着したり制限したりしないように注意してください。切断エッジを滑らかにし、実験室のベンチトップの鈍い端を前後の動きで優しくこすりながら、バーを取り除きます。
   注:微視的な毛穴や鋭い縁は、新生児マウスの大動脈を引き裂き、大動脈弁を損傷する可能性があるため、取り外す必要があります。あるいは、細かい砂紙を使用してください。
2. 作製したカニューレをランゲンドルフ装置に取り付け、流量と抵抗を評価します。カニューレを通る流量を測定するには、既知の期間にわたってバッファー量を収集して測定します。実際の流量が 2.5 mL ^min-1 の設定流量に等しいことを確認します。
3. 以下の手順に従って、KHBが流れるカニューレ全体の圧力差を定量化します。
   1. 製作されたカニューレが取り付けられた場合と取り付けられていない状態で、システム内の圧力を測定します。
   2. カニューレを横切る圧力差を流量で除算し、オームの法則¹⁵に従ってカニューレ抵抗を求めます。
   3. 作製されたカニューレ抵抗が^全抵抗6の約16.0±1.9mmHg∙min∙^mL-1を含むことを確認してください。過度の抵抗は、潜在的に損なわれたカニューレ内腔を示唆している。
      注:サンプル計算:カニュー_レ付きP-_{カニューレなし}のP=ΔP。P が = 48_で、P が = 8_の場合、ΔP = 40 になります。流量(Q)が2.5mLの^min-1および40カニューレ抵抗のΔPは、R = ΔP/Q = 40 / 2.5 = 16を使用して16mmHg∙min∙^mL-1に等しくなります。
4. 26Gカニューレを取り外し、高圧チューブ( 材料表を参照)をランゲンドルフ装置のカニューレ部位に取り付けます。大動脈カニューレをチューブの遠位端に取り付けます。チューブとカニューレを酸素化バッファーで脱気し、すべての気泡が除去されるようにします。
   注:この方法で高圧チューブを使用すると、カニューレをより離れた位置に拡張できます。これは、セットアップに隣接する解剖顕微鏡による大動脈カニューレを可能にするために必要です(図1)。

3. 臓器摘出

1. 1mLシリンジ上の26G針を用いて冠状動脈ミクロ血栓の形成を防ぐために、ヘパリン(10kU/kg)の腹腔内(IP)注射(材料表を参照)を介してマウスを抗凝固させる。麻酔薬の注射を進める前に、ヘパリンが循環するまで数分待ちます。
2. 1mLシリンジ上の26G針を使用してIP注射で動物を麻酔する。
   注:無呼吸とその後の低酸素症を避けるために、麻酔薬注射後に動物を注意深く監視することが不可欠です。ペントバルビタール(70mg / kg)は、無呼吸^19,20を誘発することなく鎮静剤の迅速な発症を可能にするため、麻酔薬の信頼できる選択肢である。使用される用量が無呼吸²¹を引き起こさないことを条件として、他の麻酔薬を利用することができる。治験責任医師は、心機能に対する代替鎮静催眠薬の効果を考慮する必要があります^22,23。安楽死の主な様式としての子宮頸部脱臼は、カニューレ前の低酸素症および虚血を延長し得る。
3. マウスを仰臥位に置き、意識を失ったらすぐに手足を固定します。小さなゲージの皮下注射針を使用して、各手足を固定します。動物がつま先のピンチに反応しなくなるとすぐに収穫を始めます。動物は最初の解剖中に自発的に呼吸するべきです。
4. 動物の幅を横切って横方向の亜剣状切開を行い、まっすぐな解剖ハサミを使用して腹腔を露出させる( 材料表を参照)。
   注:手順が非生存手術を表すことを考えると、滅菌技術は必要ありません。
   1. 横隔膜を優位に識別し、前部を完全に切開する。胸郭を中腋窩線に沿ってセファラド方向に両側に切断する。アシスタントに鉗子で剣状突起を把握し、胸骨と肋骨を頭蓋に反射させて胸部器官を露出させるように依頼します。
5. 肝臓の上にある横隔膜下大静脈(IVC)を特定する。IVCを湾曲した虹彩はさみでトランセクトし、虹彩鉗子で近位セグメントのわずかな前部およびセファラド張力を維持する( 材料表を参照)。
   1. IVCを胸腔から引き上げながら、湾曲した虹彩はさみを使用して脊椎の前面に沿って後方に切断する。心臓が動員されたら、はさみを前方に傾け、心臓と肺を完全に取り除くために、大きな血管を優れて切断します。
      注:この方法は、心臓および肺のブロックの迅速な移植 を可能にする。
6. 直ちに試料を氷冷KHBまたは生理食塩水に沈める。心臓は数秒以内に鼓動を止めるはずです。

4. 年金

1. ペーパータオルを切って浅いペトリ皿の底に置き、カニューレ中に心臓を安定させる摩擦を与えます。氷のように冷たいKHBで湿らせて、心臓が付着するのを防ぎます。
   1. 準備したペトリ皿を解剖顕微鏡の下に置き、焦点を調整します。高圧延長チューブに取り付けられた大動脈カニューレを、そのハブの周りにゆるやかに結ばれた5-0シルク縫合糸とともに、解剖顕微鏡の下に置きます( 材料表を参照)。
      注:空気で満たされた肺が浮遊し、切除された臓器が動く可能性があるため、ペトリ皿内の液体の量を制限するように注意する必要があります。
2. 切除した胸部器官をペトリ皿に入れる。顕微鏡下で、その白い光沢と2つの葉によって胸腺を特定し、胸腺が前方および優位に立つように標本を配向させる²⁴。これにより、心臓の適切な向きが保証されます。
3. 鉗子を使用して、胸腺の葉を鈍く分離して大きな血管を露出させます。大動脈弓の際立った分岐特徴を見つけることによって大動脈を識別する。
   注:濃い紫色の色相は、しばしば右心室と肺動脈を区切る。上行大動脈は、主肺動脈と右心房の間に位置する。
4. 鎖骨下動脈離陸のすぐ近位にある細かい鋭いはさみ( 材料表を参照)で大動脈をトランセクトします。
   注:大動脈が大動脈弁に近すぎると、カニューレを固定するのに十分な大動脈組織がなくなります。あるいは、大動脈が高すぎると、灌流液が1つ以上の大動脈枝(鎖骨下動脈など)から漏れ出す可能性がある。
5. ジュエラースタイルの細かい湾曲した鉗子を使用して、トランスセクトされた大動脈を優しくつかみます( 材料表を参照)。大動脈弁を損傷しないように注意しながら、26Gの鈍い針で大動脈を慎重にカニューレします。カニューレの周りの細かい湾曲した鉗子で大動脈をつかんで所定の位置に保持します。大動脈の制御が確立されたら、逆行性灌流を開始して虚血時間を制限する。
   注:心臓は鼓動し始め、心臓筋から血液が排出され、KHBが冠状動脈を灌流すると青白くなります。自発的に鼓動する障害、心室充血の存在、または心臓の色の変化の欠如は、誤った位置にあるカニューレを示す。
6. ゆるく結ばれた縫合糸の端をつかみ、カニューレの周りの大動脈を慎重に罠にかけるように助手に依頼します。大動脈組織の量と解剖学的考慮事項に応じて、湾曲した微細な鉗子の上または下に縫合糸を締める(カニューレを所定の位置に保持する)。縫合糸を締め付け、冠状動脈流の妥当性を確認する。
7. 高圧チューブをランゲンドルフ装置から外します。カニューレのハブをつかみ、高圧延長チューブから鈍い針を外します。カニューレのハブを装置に素早く取り付ける。
   注:心臓をはがしたり、カニューレに空気を巻き込まないように注意する必要があります。
8. 心臓が通常の位置でランゲンドルフ装置に掛けられ、適切な灌流が確認されたら、肺、胸腺、および過剰な組織を慎重にトリミングします。右心房を切開して、冠状動脈洞排水が自由に滴下できるようにします。

5. 機能測定

1. 5-0のシルク縫合糸(湾曲した針に取り付けられた)の端に小さな結び目を作ります。パラフィンフィルム(2-3 mm x 2-3 mm)の小片を針で突き刺し、パラフィンを結び目の端にスライドさせます。慎重に心室の頂点に針を通し、パラフィン膜が心室の側壁にぴったりと収まるまで縫合糸を心臓を通して引っ張る。
   注:パラフィンフィルムは、結び目が心臓を引き裂いて心室を引っ張るのを防ぐのに役立ちます。
2. ランゲンドルフ装置の水で満たされた温暖化ジャケットの開口部に針を通す。心は今、包み込まれ、温められます。
3. 針を力伝達器( 材料表を参照)に、冠状動脈洞の滴下を避けるように取り付けます。縫合糸を調整して、張力トレースにおける拡張期張力または天底によって示されるように、1〜2gの基礎張力を適用する。
   注:カニューレから心臓を引き抜いたり、大動脈をひねったりして冠状動脈灌流を危険にさらさないでください。
4. 心臓の上極と下極に表面電極を配置して心電図を記録します。
   注:Bio Ampに接続された柔軟な表面電極のために、針を外した状態で小児用一時的な心外膜ペーシングワイヤを使用してください( 材料表を参照)。
5. 24 G IVカテーテルを使用して分析のために冠状動脈洞流出液 をサンプリングする(材料表を参照)。
6. 全系抵抗からカニューレ抵抗を差し引いて、キルヒホッフの法則²⁵に従って冠状動脈抵抗を求める。

結果

P10マウスを用いて、ヒト乳児期^26、27における時点をモデル化した。15匹の単離されたC57Bl/6新生児マウスの心臓が収穫され、カニューレ処理に成功した。心臓を、加温した酸素化KHBの2.5mL分^-1 の連続流で灌流した。グルコース抽出、酸素消費量、乳酸産生、および心拍数、灌流圧、冠動脈抵抗などの生理学的パラメータを含む代謝パラメータを測定した。表面電極を使用して連続心電図を記録し、固有の速度とリズムを決定することができました(図2)。長手方向軸における収縮力は、ランゲンドルフ ²⁸によって記載された方法を用いて決定した。

代謝評価を、灌流の妥当性について評価するために行った。酸素抽出パーセントは、灌流液から冠状動脈廃液中の酸素含有量を差し引くことによって計算した。心筋酸素消費量は、冠動脈流量に灌流液と冠動脈流出液の酸素含有量の差に酸...

ディスカッション

本研究は、単離された新生児マウス心臓における成功した大動脈カニューレーションおよび逆行性灌流について記述する。重要なことに、それは研究者が若いマウスの年齢と小さな心臓サイズが以前に提示した障壁を克服する^{ことを可能にします 8}.設計は複雑ではありませんが、このアプローチにはかなりの技術的スキルが必要です。最も技術的に熟練した研究者でさえも必然的に挑戦する重要なステップは、大動脈のカニューレとカニューレを所定の位置に固定することです。新生児カニューレの困難さは、大動脈内腔のサイズが小さいことだけによるものではない。上行大動脈(大動脈弁と右鎖骨下離陸の間の大動脈組織)の長さが比較的短いため、研究者は大動脈カニューレを正確に制御する必要があり、チームメイト間の慎重な調整が必要になる可能性があります。この領域内でカニューレを適切に配置して固定しないと、調製物が台無しになる可能性があります。例えば、カニューレを深く進めすぎると、大動脈弁を損傷したり、脳室内カニューレを引き起こしたりする可能性がある。カニューレを大動脈弓内に浅すぎると、鎖骨下動脈などの枝の1つから灌流液が漏れる可能性があります。さらに、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
げっ歯類ランゲンドルフ装置	Radnoti	130102EZ
24 G カテーテル	BD	381511
26 G 針 1 mL シリンジコンボ	BD	309597
26 G スチール針	BD	305111
5-0 シルク縫合	Ethicon	S1173
バイオアンプ	ADInstruments	FE135
バイオケーブル	ADInstruments	MLA1515
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901-100G
循環加熱水 バス	Haake	DC10
湾曲した虹彩はさみ	Medline	MDS10033Z
解剖顕微鏡	Nikon	SMZ-2B
春のはさみを見つける	ケント
力トランスデューサ	ADInstruments	MLT1030/D
グルコース	Sigma-Aldrich	G8270-100G
ヘパリン	Sagent	400-01
高圧チューブ	Edwards Lifesciences	50P184
虹彩ドレッシング鉗子	ケント	INS650915-4
ジュエラースタイル 湾曲細かい鉗子	ミルテック	17-307-MLTX
KCl	シグマアルドリッチ	P3911-25G
KH<サブ>2PO<サブ>4	シグマアルドリッチ	P0662-25G
MgSO<サブ>4	シグマアルドリッチ	M7506-500G
NaCl	グマアルドリッチ	S9888-25G
NaHCO<サブ>3	Sigma-Aldrich	S6014-25G
ローラーポンプ	Gilson	Minipuls 3
ストレート解剖ハサミ	Kent	INS600393-G
一時的な心臓ペーシングワイヤー	Ethicon	TPW30
ワイドレンジフォーストランスデューサ	ADInstruments	MLT1030/A