方法論記事

ラットの視力を測定するための新しい光運動学的試験法

DOI：

10.3791/63357

⸱

2022年7月27日

 ,  , 
1Roski Eye Institute, Department of Ophthalmology, Keck School of Medicine, University of Southern California, 2USC Ginsburg Institute for Biomedical Therapeutics, University of Southern California

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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視運動性眼振(OKN)行動試験法は、げっ歯類の視力の評価に使用されます。ここでは、正常なラットと実験ラットの両方の視覚機能を確実に評価するために、研究室で簡単にセットアップできる簡単な方法が実証されています。

要約

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視運動性眼振(OKN)は、視野内の視覚刺激の動きによって開始される反射的な眼球運動です。OKNに関連するヘッドトラッキング運動は、げっ歯類の視覚機能の尺度として一般的に使用されます。正常ラットと実験ラットのOKN応答を記録するために、シンプルで安価な装置が開発されました。このセットアップでは、2つのタブレット画面を使用して、無料で入手できるソフトウェアであるOKN Stripes Visualization Webアプリケーションを使用して生成された高コントラストの黒と白のストライプで構成されるOKN視覚刺激を表示します。ラットは、ラットの頭がOKNディスプレイ画面に絶えず向くように動きを制限する透明なプレキシガラスホルダーの中に置かれます。ラットホルダーの位置を変更して、ラットと表示画面との距離を調整できます。ラットホルダーの上に配置されたマイクロカメラを使用して、ラットの視覚活動を記録します。これらの記録は、定量的評価に使用できます。明確なヘッドトラッキングの有無に基づいて、異なる空間周波数でのOKN応答を決定できます。収集されたデータは、正常および網膜変性ラットの視力を確実に測定するための新しい技術を示しています。

概要

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眼が持続的な全視野視覚運動にさらされると、視運動神経眼振(OKN)1,2と呼ばれる、高速でスムーズな追跡眼球運動と低加速頭運動の明確なパターンが視覚運動の方向に現れます。OKNの神経経路は、網膜から外側膝状体、後頭葉、小脳凝集体に至り、眼の運動ニューロン3に繋がっている。これらの神経経路に沿ったどこかの神経損傷は、OKN応答の変化につながる可能性があります。OKN応答は、ヒト患者の脳対称性、心因性失明、および視力を評価するためのツールとして使用されます4,5。視力は、機能的反応を定量化することによって評価され、これは、神経変性疾患3,6,7により失われた視力の回復を中心とした治療および実験の成功を決定する上で不可欠であり得る。動物では、OKN応答を使用して視力を正確に評価できるため、研究者は視覚機能に関する定量的および定性的データを収集することができます。げっ歯類では、縞模様の回転方向を時計回りと反時計回り8の両方に基づいて、左右の眼の視力を独立して測定することができる。この反時計回りと時計回りの動きは、各目を鼻側頭(N-T)または側頭鼻(T-N)の動き9にそれぞれさらします。T-N刺激は、げっ歯類が背後または側面からの危険に対してより敏感であるため、N-T刺激と比較して有意に高い反応をもたらします。

以前に、正常な実験用ラットと網膜変性ラットの視覚機能は、異なるOKN試験方法を使用して試験されました6、10、11、12、13。ただし、視力スコアの特定の変動は、現在の調査で示されているデータを含め、異なる研究間で観察されます。このばらつきは、主に使用するテスト設定の違いに起因します。テストアリーナのサイズと使用されるOKN視覚刺激の種類の違い6,10が主な要因になる可能性があります。これらの実験で使用された刺激には、仮想の円筒14の外観のための正弦波格子14、交換可能な回転円筒15、および4つのコンピュータモニタ10に表示される高コントラスト(黒と白)の縞模様が含まれる。これらのOKN試験装置および方法に関連する主な制限には、装置の大型化、試験領域内での動物の動き、および動物が試験プラットフォームから落下する頻繁な発生率が含まれる7,11,12。

上記の制限を最小限に抑えるために、ラットでのOKN試験のための新しい装置が開発されました。この装置は比較的安価で、効率的で操作が簡単で、視覚機能の評価が可能であることが証明されています(図1)。この装置は、2つのタブレット画面を使用して、OKN視覚刺激(視覚化ソフトウェア)を異なる空間周波数で表示します。マイクロカメラは、後でデータを分析するために、テスト中の動物の活動を記録するために使用されます。研究室で簡単にセットアップできるOKN装置を作ることを目的として、この新しいセットアップでは、既存のOKN試験装置に対する重要な変更の概要を示しています。ここで使用されるOKN刺激は、異なる空間周波数と異なる回転方向(左から右または右から左)の黒と白のストライプで構成されています。OKN試験装置の主要コンポーネントには、OKN刺激を表示するために使用される2つのタッチスクリーンタブレット画面(7.9インチ)が含まれます(図2)。2つの調整可能なホルダーを使用して、タブレットの画面を希望の位置に保持します。ホルダーは、高さと角度を調整できる処置テーブルの端にしっかりと取り付けられています。ラットは、ディスプレイ画面に面したラットホルダーに入れられます。ラットホルダーは透明なプラスチック(ポリメチルメタクリレート)チューブでできています。ホルダーは台座と金属製のスタンドに取り付けられており、施術台上で安定して配置できます。保持チューブのサイズは、使用するラットのサイズに応じて、長さが4〜6インチ、直径が2.5〜3インチです。ラットと表示画面との距離は、ラットホルダーの位置を変えることで調整します。ラットホルダーは、ラットの頭部がディスプレイ画面に向かって連続的に露出するのを維持し、試験中のラットの動きを減らすのに役立ちます。マイクロカメラを使用して、ヘッドトラッキングの応答を記録します。この新しいセットアップの欠点には、画面のリフレッシュレートが異なることや、細いストライプを使用すると目の錯覚が発生する可能性があることが含まれます。ただし、これらはコンピューター ベースの OKN セットアップに関連する一般的な問題と見なすことができます。上記の問題に加えて、現在のセットアップでは、ラットは、最適なOKN応答に影響を与える仮想シリンダー14 を使用してテストされていない。この方法の新規性は、この方法が採用される技術および装置にある。この技術は、げっ歯類の信頼性の高い視力測定のために、研究所で簡単にセットアップできます。

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プロトコル

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すべての動物処置は、地域当局によって承認され、南カリフォルニア大学(USC)の動物施設管理および使用委員会(IACUC)によって受け入れられた実験ガイドラインに準拠して実施され、眼科および視覚研究における動物の使用に関する眼科および眼科研究における動物の使用に関するARVOの声明および科学目的で使用される動物の保護に関する欧州指令2010/63/EUに準拠していました。

注: この研究で使用されたラットは、色素性網膜変性王立外科学会 (RCS) ラットとロング エバンス (LE) ラットです。 図3 は、OKNのテストと分析のさまざまな段階を示す概略図を示しています。

1. 手続き

  1. セットアップの準備
    1. ラットをケージに入れ、部屋の照明を消した状態で30分間試験室内に保管します。
      注:これにより、輸送中に発生するストレスを最小限に抑え、すべての実験に均一な照明条件を提供します。
    2. タブレットの画面が向かい合う位置を155°に設定して、OKN Stripes Visualization Webアプリケーションを表示します。
    3. ラットホルダーを2つのタブレット画面の中央、中心から4.5インチの位置に置きます。
      注意: この位置では、ラットの頭はディスプレイ画面から約3.5インチ離れています。
    4. タブレットのデスクトップから OKN Stripes Visualization Web Application をクリックすると、最も低い空間周波数から始まる視覚刺激(黒と白のストライプ)が表示されます。
      注:空間周波数0.08、0.15、0.2、0.24、0.28、0.33、0.38サイクル/度(c / d)が使用され、最も低い空間周波数(0.08c / d)から始まり、より高い空間周波数(最大0.38 c / d)に変化します。各空間周波数で、ラットは縞模様の回転(それぞれ1分)で時計回りと反時計回りの両方についてテストされます。
  2. OKNテスト手順
    1. 適切なサイズのラットホルダーを選択してください。
    2. ラットをラットホルダーの開口部に持っていき、ラットを慎重に内側に導きます。
    3. テストの前に、ラットがホルダー内に落ち着くのを待ちます(1〜2分)。
      注:適切な取り扱いにより、ほとんどの場合、ラットをホルダー内に維持することが可能です。必要に応じて、ラットホルダーを数秒間高く(テーブルから最大2フィート上)保持します。高さへの恐怖は、ラットがラットホルダーから降りる傾向を減らすことがわかっています。必要に応じて、ラットが落ち着くまで追加の時間(1〜2分)が与えられます。
    4. ラットホルダーの台座を金属製のスタンドに挿入して安定して配置します。
      注意: この設定により、ラットの viewタブレット画面からの距離。
    5. カメラの電源を入れてビデオ録画を開始します。
    6. タブレットのデスクトップ画面から OKN Stripes Visualization Web Application をクリックし、プログラムの実行を開始します。
    7. OKN刺激を左から右または右から左方向に実行します。
      注意: 縞模様を時計回りに回転させると左目がアクティブになり、反時計回りに回転すると右目がアクティブになります。回転の初期方向は、潜在的な慣れを避けるためにランダムに選択されました。
    8. ラットのヘッドトラッキング行動を観察します。
    9. 最も低い空間周波数 (0.08 c/d) を使用してテストを開始し、次に空間周波数を段階的 (昇順) に増やします。
    10. OKN 応答の有無に注意してください。
    11. テストを続行すると、異なる空間周波数間に休息期間は与えられません。
    12. すべての空間周波数が完了したらビデオ録画を停止し、ラット識別番号を使用してデータを保存します。
    13. ラットをホルダーから取り出し、連続したテストの間に約30分間ケージに入れます。
    14. ラットごとにテストを3回繰り返します。

2. データ分析

  1. 録画したビデオを確認し、ラットが反応した空間周波数を見つけることにより、各ラットの視力を判断します。
  2. すべての回答(明確なヘッドトラッキングの有無)をスプレッドシートに記録します。
  3. 3つのテストから、ラットが応答した最も高い空間周波数を見つけます。これが最終的な視力と見なされます。
    注:視力測定は主観的であるため、データは2人の独立した研究担当者によって評価され、各ラット12の視力スコアを確認します。最終スコアが合意されるまで、結果はクロスチェックされます。正の OKN 反応は、明確で持続的なヘッドトラッキング活動の存在として定義されます。ランダムなヘッドトラッキング(OKN視覚刺激とは無関係)または頭の動きがないことは、OKNの否定的な反応と見なされます。
  4. 統計分析を実施して、グループ間または2つの目(左目と右目)を比較します。
    注意: ビデオ録画を確認して、必要に応じて肯定的または否定的な応答が行われていることを明確にします。

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結果

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OKN試験は、網膜変性(RD)のRoyal College of Surgeons(RCS)ラットと年齢が一致した正常なLong Evans(LE)ラットを用いて実施されました。LEラット(n = 4)は、新しいセットアップを使用して正常なラットの視力スコアを決定するためのベースラインデータを確立するために使用されました。統計解析は、Microsoft Excel(平均±標準偏差)を用いて行った。LEラットは、0.15 c/dから0.33 c/dの空間周波数で堅牢なヘッドトラッキングを示しました。RDラットの視力測定における新しいOKN装置の信頼性と有効性を評価するために、出生後(P)35歳からP100歳までの5つの異なる時点でRCSラット(n = 9)を使用してテストを実施しました(図4)。RCSラットは、P50歳まで強力で持続的なヘッドトラッキング反応を示しました。P50以降、視力の大幅な低下がありました。P80歳以降、RCSラットの視覚感度は急激に低下しました。P100以降、RCSラットの視覚機能は、低い空間周波数でもヘッドトラッキング応答がないことからも明らかなように、...

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ディスカッション

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OKNは、漂流する刺激に反応して目の鋸歯運動を行うもので、被験者の視力を評価するためのツールとして用いられています3。霊長類やげっ歯類などの動物では、視覚機能の定量的測定としてOKN試験が用いられています。本研究では、ラットのOKN行動試験のために研究室に簡単に設置できる、新しく安価なOKN装置について述べています。げっ歯類のOKN評価は、さまざまなアプローチで行われました。以前は、グレーティングの回転のためにモーターに取り付けられた交換可能なOKNドラムが使用されていました6。より最近では、仮想円柱を作成するようにプログラムされたものを含む視覚刺激10を表示するためにコンピュータ画面を使用したOKNテスト14が使用された。市販のOKN試験装置は、正常および網膜変性動物モデル16,17,18の視覚機能変化を評価するために

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開示事項

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著者には報告すべき利益相反はありません。

謝辞

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この研究は、CIRM (California Institute for Regenerative Medicine) の助成金 (DISC1-09912 PI- Thomas, DR3-07438- PI- Humayun)、ニューヨーク州ニューヨークの Research to Prevent Blindness, New York, and Bright Focus Foundation (M2016186, Thomas, PI) の眼科への無制限の助成金によって支援されました。この出版物で報告された研究は、米国国立衛生研究所の国立眼病研究所によって賞番号P30EY029220で支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
iPad MiniAppleA14892台のiPad Miniは、OKN Stripes視覚化ソフトウェアを表示するために使用されます。
マイクロカメラ/マイクロカメラアタッチメントラノンB097H6WWDS実験の様子をマイクロカメラで記録します。マイクロカメラアタッチメントはデスクに接続し、カメラをネズミに向けて保持します。ヘッドトラッキングの応答は、さまざまな距離、空間周波数、および方向で記録および評価されます。 
プレキシガラスチューブ/ラットホルダーベストアクリルB07KMF31MCプレキシガラスチューブは、実験期間中、頭を露出した状態でラットを拘束するために使用されます。チューブは、実験中にラットホルダーを安定させるために、別の垂直プレキシガラスチューブアタッチメントに取り付けられています。装置全体は、ラボで設計および構築されました。
プレキシガラスチューブアタッチメント最高のアクリル B07KMF31MCこのアタッチメントは、ラットホルダーをiPadの画面の前に保持し、ラットとiPadの間の距離を操作できるようにします。 
スクリーンホルダーKabconB08JLRPKQ12つのスクリーンホルダーを使用してiPadを持ち上げ、OKN Stripes視覚化ソフトウェアをラットに表示します。 
OKN Stripes Visualization Web ApplicationThe MIT License (MIT) Copyright (c) 2016 Anton Yakushinhttps://antonyakushin.github.io/okn-stripes-visualization/このアプリケーションは、視覚刺激(黒と白のストライプ)を異なる周波数で表示するための無料で利用できるソフトウェアです

参考文献

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