方法論記事

非放射性鉄同位体を用いたマウス胎盤 を 横切る鉄輸送の定量

DOI：

10.3791/63378

⸱

2022年5月10日

 , 
1Center for Iron Disorders, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

この記事について

サマリー

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この記事では、マウス妊娠中の鉄輸送の研究のために、トランスフェリン結合非放射性同位体鉄を調製および投与する方法を示します。胎児胎盤区画中の同位体鉄を定量するためのアプローチも記載されている。

要約

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鉄は妊娠中の母体と胎児の健康に不可欠であり、健康な妊娠を維持するために人間には約1gの鉄が必要です。胎児の鉄の供給は胎盤を横切る鉄の移動に完全に依存しており、この移動の摂動は妊娠に悪影響を与える可能性があります。マウスでは、胎盤を横切る鉄フラックスの測定は、伝統的に放射性鉄同位体に依存していましたが、これは非常に敏感ですが負担の大きいアプローチでした。安定鉄同位体(57Feおよび 58Fe)は、ヒトの妊娠研究で使用するための非放射性の代替物を提供します。

生理学的条件下では、トランスフェリン結合鉄は胎盤に取り込まれる鉄の主な形態です。したがって、 58Fe-トランスフェリンを調製し、妊娠中のダムに静脈内注射して、胎盤鉄輸送を直接評価し、交絡変数として母親の腸内鉄吸収をバイパスしました。同位体鉄は、誘導結合血漿質量分析(ICP-MS)によって胎盤およびマウス胚組織において定量された。これらの方法は、生理学または疾患の他の動物モデル系において、 in vivo 鉄動態を定量化するためにも使用することができる。

概要

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鉄は、成長と発達、エネルギー生産、酸素輸送など、さまざまな代謝プロセスに不可欠です1。鉄の恒常性の維持は、動的で調整されたプロセスです。鉄は十二指腸で食物から吸収され、鉄輸送タンパク質トランスフェリン(Tf)に結合して循環して体内を輸送されます。これは、酵素プロセスのためにすべての細胞によって利用され、新生赤血球のヘモグロビンに取り込まれ、マクロファージによって老化赤血球からリサイクルされます。鉄は過剰になると肝臓に貯蔵され、出血や細胞脱落によって体から失われます。循環中の鉄の量は、鉄の消費と供給のバランスの結果であり、後者は鉄の恒常性の中心的な調節因子である肝ホルモンヘプシジン(HAMP)によって厳しく調節されています1。ヘプシジンは、ユビキチン化を閉塞または誘導し、鉄輸出者フェロポーチン(FPN)を分解することにより、血中の鉄バイオアベイラビリティを制限する働きをします2。機能性FPNの減少は、食事中の鉄吸収の減少、肝臓での鉄隔離、およびマクロファージからの鉄リサイクルの減少につながります1。

ヘプシジンは、鉄の状態、炎症、赤血球生成ドライブ、および妊娠によって調節されている(3でレビュー)。鉄の恒常性は非常に動的であることを考えると、....

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プロトコル

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すべての動物のプロトコルと実験手順は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. 58Fe-Tfの調製

注:プロトコルは 58Feを使用します。ただし、 57Feにも同じプロトコルを使用できます。どちらの同位体も、追加の予防措置なしに標準的な鉄化学物質として使用および廃棄できます。

  1. 58 Fe を 50μL の HCl/mg の 12 N HCl に溶解します。
    1. ベンダーから提供されたガラスバイアルの金属にHClを追加し、キャップを緩く交換します。鉄を溶解するには、 58Fe / HCl溶液を60°Cに1時間温めます。それでも溶解しない場合は、溶液をヒュームフード内で室温で一晩放置して溶解します。
      注:溶解した 58Fe / HCl溶液は黄橙色です。
      Fe3O 4(s) + 8HCl(aq) → Fe(II)Cl 2(aq) + 2Fe(III)Cl 3(aq) + 4H2 O....

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結果

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鉄輸送を測定するために安定鉄同位体を使用した以前の研究では、母体の鉄欠乏が胎盤鉄輸出者であるFPN4のダウンレギュレーションをもたらすことが示されました。FPNは唯一の既知の哺乳類鉄輸出物質であり、発生中にFPNが存在しないと、E9.5より前に胚死が発生します29。観察されたFPN発現の減少が胎盤鉄輸送の減少に機能的に翻訳されるかどうかを判断するために、 58Fe-Tfを妊娠中のダムに静脈内注射し、胎盤と胚の鉄を母体の鉄欠乏の存在下で定量しました。

胎盤の鉄輸送が母親の鉄の状態によってどのように影響を受けるかを理解するために、鉄欠乏症をマウスでモデル化しました4。雌のC57BL / 6マウスは、妊娠前および妊娠中の2週間、低鉄食(4ppmの鉄)または標準的な固形飼料(185ppmの鉄)に置かれました。この食事療法により、標準的な食事の動物と比較して、E12.5、E15.5、およびE18.5で母体の肝臓の非ヘム鉄と血清鉄.......

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ディスカッション

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鉄は多くの生物学的プロセスにとって重要であり、体内でのその動きと分布は非常に動的で調節されています。安定鉄同位体は、鉄恒常性のダイナミクスを評価するための放射性同位元素の一貫した便利な代替品を提供します。プロトコルの重要なステップは、すべての組織の重量と体積を追跡することです。鉄は元素であるため、合成も分解もできません。したがって、すべての重量と体積を注意深く記録すれば、システム内のすべての鉄を計算によって説明することができます。記載されたように、この方法は、ヘム鉄源および非ヘム鉄源を区別するために使用することができる。しかしながら、鉄形態間のこの区別は必要ではなく、総鉄のみが測定される場合、プロトコルステップ4.2で説明したように、濃縮HNO3 のみで組織を処理することによってプロトコルを単純化することができる。組織、特に胎盤などの血管性の高い組織を分析前に灌流しない場合、血液の存在により組織のヘム鉄含有量が過大評価される可能性があることに注意することが重要です。

トランスフェリン結合鉄は、胎盤に取り込まれる鉄の主要な供給源であるため、研究のために選択されま.......

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開示事項

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ENは、Intrinsic LifesciencesとSilarus Pharmaの科学共同創設者であり、Protagonist、Vifor、RallyBio、Ionis、Shield Therapeutics、Disc Medicineのコンサルタントです。VS は競合を宣言しません。

謝辞

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著者らは、UCLAのCNSIにあるUCナノテクノロジー環境影響センター内のICP-MS施設が、 58Fe測定のプロトコルの最適化を支援するために使用されていることを認めています。この研究は、NIH国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(NIDDK)(K01DK127004、VSへ)およびNIH国立小児保健人間発達研究所(NICHD)(R01HD096863、EN)の支援を受けた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
58Fe-鉄金属Trace Sciences InternationalFe-58
Amicon ultra-15 遠心フィルター、30 kDa カットオフMillipore SigmaUFC903024
遠心チューブ、15 mLFisher Scientific14-959-49B
遠心チューブ、50 mLMillipore SigmaCLS430829
遠心分離機、Sorvall Legend Micro 17 マイクロ遠心分離機フィッシャーサイエンティフィ75002432
遠心分離機、Sorvall Legend RT
デリケートタスクワイパーフィッシャーサイエンティフィック06-666
:鉄欠乏症(4ppm鉄)Envigo TekladTD.80396
:標準チャウ(185ppm鉄)PicoLab5053
30mm刃先で解剖はさみVWR25870-002
鉗子 4-1/2 インチ長さマッケソン157-469
HEPESフィッシャー サイエンティフィックBP310-500
ホモジナイザー、バイオジェン PRO200PROScientific01-01200
ヒト アポ トランスフェリン (apo-Tf)Celliance4452-01販売終了、代替品: ミリポア 616419
塩酸 (HCl)フィッシャーサイエンティフィックA144S-500
過酸化水素(H2O2)、水中の35重量%溶液コールパーマーEW-88216-36
インスリン注射器、BD低用量U-100ッシャーサイエンティフィック14-826-79
イソフルランVETone502017
イソフルラン気化器サミット麻酔ソリューション
金属ヒートブロックフィッシャーサイエンティフィック
フラットスクリューキャップ付きマイクロ遠心チューブVWR16466-064
マイクロ遠心チューブ 1.5 mL ローリテンションフィッシャーサイエンティフィック02-681-320
マイクロ遠心チューブ 2.0 mL ローリテンションフィッシャーサイエンティフィック02-681-321
Millex-GPシリンジフィルターユニット、0.22 µm、ポリエーテルスルホン、33 mm、ガンマ線滅菌ミリポア シグマ SLGP033RS
ニトリロ三酢酸 (NTA)シグマ72560-100G
ニードル 25 G x 5/8 インチ 皮下注射 一般用フィッシャー・サイエンティフィック14-826AA
pH ストリップ、プラスチック pH5.0-9.0フィッシャー・サイエンティフィック13-640-519
カミソリの刃 0.22 mmVWR55411-050
スケール (g)メトラー・トレドPB1502-S
スケール (mg)メトラー・トレド天びん XS204
重曹 (NaHCO3)SigmaS5761-500G
塩化ナトリウム (NaCl)Fisher ScientificS671-3
水酸化ナトリウム (NaOH)Fisher ScientificSS266-1
滅菌シリンジ、スリップチップ (1 mL)Fisher Scientific309659
トリクロロ酢酸 (TCA)Fisher ScientificA322-500
Software
ImageLabBio-Rad
SigmaPlotSystat
ックダイエットダイエットフィ

参考文献

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  1. Ganz, T. Systemic iron homeostasis. Physiological Reviews. 93 (4), 1721-1741 (2013).
  2. Aschemeyer, S., et al. Structure-function analysis of ferroportin defines the binding site and an alternative mechanism of action of hepcidin. Blood. 131

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