本プロトコルは、 P. americanaにおけるRNAi操作技術のための段階的なガイドラインを記載する。
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この記事について
サマリー
要約
衛生害虫であるゴキブリは、その容易な摂食および半代謝特性のために、昆虫の発生および変成研究において必須種である。注釈付きのゲノム配列とともに、これらの利点により、アメリカのゴキブリ、 ペリプラネタアメリカーナ は重要な半代謝昆虫モデルとなっています。ノックアウト戦略の不足によって制限され、効果的なRNA干渉(RNAi)ベースの遺伝子ノックダウンは 、P. americanaの機能的遺伝子研究において不可欠な技術となっている。本プロトコールは、 P. americanaにおけるRNAi操作技術を記述する。このプロトコルには、(1)適切な発生段階での P.アメリカーナ の選択、(2)注射設定の準備、(3)dsRNA注射、および(4)遺伝子ノックダウン効率検出が含まれる。RNAiは、 P. americanaの強力な逆遺伝学的ツールです。 P. americana 組織の大部分は、細胞外dsRNAに感受性である。そのシンプルさにより、研究者は1回または複数の標的dsRNA注射で機能不全の表現型を迅速に取得でき、研究者は P. americana を発生および変成研究に有効に使用することができます。
概要
進化的に保存されたメカニズムであるRNA干渉(RNAi)は、アンドリュー・ファイアとクレイグ・メロ2が二本鎖RNA(dsRNA)媒介遺伝子沈黙戦略を開発して以来、多くの生物1で遺伝子発現を阻害するために徐々に不可欠な逆遺伝学的ツールになります。dsRNAは、21〜23ヌクレオチドの断片に切断され、小さな干渉RNA(siRNA)は、細胞内の酵素ダイサーによってRNAi経路を活性化する。その後、siRNAはRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に組み込まれ、標的mRNAに結合し、mRNA切断を引き起こし、最終的に遺伝子機能の喪失をもたらす3、4、5。昆虫種のうち、直翅目、錬翅目、半翅目、鞘翅目、神経翅目、双翅目、膜翅目、鱗翅目、およびブラットデア5、6、7、8など、多くの昆虫順でこれまでに多くの全身RNAi実験が報告されている。
ゴキブリ(Bl....
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プロトコル
P.アメリカーナのラインは、当初、Huiling Hao博士によって提供されました。この種は30年間近親交配で維持されています9。
1. P.アメリカーナの孵化と給餌
- P. americanaの新鮮なオテカエ(産卵直後)を集め、25°C、湿度60%の暗所インキュベーターで約25日間孵化させます。その後、孵化の3日前に温度と湿度を30°Cと75%に上げます。
- 4mmの開口部を有するふるいを使用して、孵化したニンフをオテカエから分離する。
- ニンフを円筒形の容器(直径12cm、高さ10cm)に入れ、湿度70%の28°Cの暗闇に保管してください。ゴキブリが逃げるのを防ぐために、容器の内側の端をワセリンで磨く。ネズミの餌、水、避難所(卵トレイ)を提供する。ニンフの活動に注意を払い、定期的に糞便や破片をきれいにしてください。
2.適切な齢期のニンフの選択
- ガラス管を使って、脱皮したての P.アメリカーナ (体色は白)を選びます。それらを新しい容器に保管し、治療のための正しい段階を待つ。
注:上記の摂食条件下で〜19日後、3番目の ....
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結果
図 1 は、成功した注入を示しています。マイクロ直径の針を備えたマイクロインジェクションシリンジは、ブースター上に水平に配置する必要があります(図1A)。針は、表皮に対して水平に2つの腹部ソマイト間の隙間 を介して 挿入される(図1B)。液体が P.アメリカーナ 腹部に入ることを確認します。針の角度が急すぎると内臓が損傷し(図1C)、不適切な注射はdsRNA溶液の腹部からの漏出につながります(図1D)。いずれかのdsRNAが漏れた場合、動物を捨てる必要があり、別の注射が行われる。 P.アメリカーナは 注射中に完全に麻酔をかける必要があります。
他の生物学的実験と同様に、RNAi処理が行われる場合、対照群が必要である。治療の違いは、ds.......
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ディスカッション
この報告書は、 P. americanaにおける方法論的ステップバイステップRNAi戦略を説明した。注目すべきは、他のゴキブリ(例えば、Blattella germanica )や、小さな変化を伴う他の多くの昆虫にも適用することができる。しかし、RNAiの遺伝子サイレンシング効率は必ずしも十分に高いとは限らず、遺伝子ノックアウト戦略と比較して明らかな欠点がある13。遺伝子レベルの以下の残留効果は、実際の表現型を妨害する可能性がある。RNAi治療を確実に成功させるためには、動物の体調、対照群の選択、dsRNA分子の長さおよび濃度、オフターゲット効果(OTE)の可能性の回避、およびdsRNAに対する組織の異なる感受性を含む、いくつかの重要な条件を考慮する必要がある。
P.アメリカーナの体調
健康な動物は、 P. americanaにおけるRNAiおよび異なる遺伝子機能研究の成功の前提である。その.......
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開示事項
著者らは、利益相反はないと宣言している。
謝辞
この研究は、中国国家自然科学財団(助成金番号32070500、31620103917、31330072、および31572325からC.R.、Sh.L.まで)、広東省自然科学財団(助成金番号2021B1515020044および2020A1515011267からC.R.まで)、広東省科学技術部(助成金番号2019B090905003および2019A0102006)、広州科学技術部(助成金番号202102020110)の支援を受けました。 深セン科学技術プログラム(助成金番号。KQTD20180411143628272からSh.L.へ)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 701 N 10 & マイクロ;L Syr (26s/51/2) | ハミルトン | PN:80300 | インジェクション |
| インキュベーター | 寧波江南楽器工場 | RXZ-380A-LED | ゴキブリの孵化と給餌用 |
| マイクロインジェクションポンプ | オルコットバイオテクノロジー | ALC-IP600 | インジェクション |
| pTOPO-ブラントクローニングキット | Aidlab バイオテクノロジー | CV16 | 遺伝子クローニング用定量的 |
| リアルタイム PCR システム | バイオ・ラッド | CFX Connect | qRT-PCR 解析用 |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | Rnase A 溶液 (4 μg/μL)、酢酸ナトリウム、3.0M (pH 5.2)、酵素ミックス、T7 Express、ヌクレアーゼフリー水、Express T7 2x バッファー、RQ1 RNase-Free DNase |
| サーマルサイクラーズ | Bio-Rad | S1000 | DNA 増幅用 |
参考文献
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431(2012).
- Fire, A., et al.
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再版と許可
