Method Article

クライオスパーク、リオン、サイピオンによる堅牢な単一粒子クライオ電子顕微鏡(クライオEM)処理ワークフロー

DOI:

10.3791/63387

⸱

January 31st, 2022

 , 
1Institute for Quantitative Biomedicine, Rutgers University, 2Department of Biochemistry & Microbiology, Rutgers University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この記事では、3 つのクライオ EM 処理プラットフォーム (cryoSPARC v3、RELION-3、Scipion 3) を効果的に利用して、高解像度の構造決定のためのさまざまな単一粒子データセットに適用可能な単一の堅牢なワークフローを作成する方法について説明します。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

計測と画像処理ソフトウェアの両方の最近の進歩により、単一粒子クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)は、構造生物学者が多種多様な巨大分子の高解像度構造を決定するための好ましい方法となっています。画像処理と構造計算のための複数のソフトウェアスイートが新規および専門家のユーザーが利用でき、顕微鏡検出器によって取得された映画はビーム誘起運動およびコントラスト伝達関数(CTF)推定の補正を受けるという同じ基本的なワークフローを合理化します。次に、反復的な 2D および 3D 分類のために、平均化されたムービー フレームからパーティクル イメージが選択されて抽出され、その後、3D 再構成、改良、および検証が行われます。さまざまなソフトウェア パッケージが異なるアルゴリズムを採用し、操作にさまざまなレベルの専門知識を必要とするため、生成される 3D マップの品質と解像度が異なることがよくあります。したがって、ユーザーは最適な結果を得るために、さまざまなプログラム間で定期的にデータを転送します。このホワイトペーパーでは、一般的なソフトウェアパッケージである cryoSPARC v3、RELION-3、Scipion 3 を横断してワークフローをナビゲートし、アデノ随伴ウイルス (AAV) のほぼ原子分解能構造を取得するためのガイドを提供します。まず、cryoSPARC v3 を使用した画像処理パイプラインの詳細を説明します。これは、その効率的なアルゴリズムと使いやすい GUI により、ユーザーが 3D マップにすばやく到達できるためです。次のステップでは、PyEMと社内スクリプトを使用して、cryoSPARC v3で得られた最高品質の3D再構成からRELION-3およびScipion 3に粒子座標を変換および転送し、3Dマップを再計算します。最後に、RELION-3とScipion 3のアルゴリズムを統合することによって、結果の構造をさらに洗練し検証するための手順を概説します。この記事では、3つの処理プラットフォームを効果的に活用して、高解像度の構造決定のためにさまざまなデータセットに適用可能な単一の堅牢なワークフローを作成する方法について説明します。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

クライオ電子顕微鏡(クライオEM)および単粒子分析(SPA)は、水和状態の多種多様な生体分子集合体の構造決定を可能にし、これらの巨大分子の役割を原子で詳細に明らかにするのに役立ちます。顕微鏡光学系、コンピュータハードウェア、および画像処理ソフトウェアの改善により、2 Å1、2、3を超える解像度で生体分子の構造を決定することが可能になりました。2014年の192の構造と比較して、2020年には2,300以上のクライオEM構造がタンパク質データバンク(PDB)に寄託され4、クライオEMが多くの構造生物学者にとって選択の方法となっていることを示しています。ここでは、高解像度の構造決定のために3つの異なるSPAプログラムを組み合わせたワークフローについて説明します(図1)。

SPAの目標は、顕微鏡検出器によって記録されたノイズの多い2D画像から、ターゲット試料の3Dボリュームを再構築することです。検出器は、同じ視野の個々のフレームを持つムービーとして画像を収集します。サンプルを保存するために、フレームは低い電子線量で収集されるため、信号対雑音比(SNR)が低くなります。さらに、電子露光はガラス化クライオEMグリッド内で動きを誘発し、画像のぼやけをもたらす可能性がある。これらの問題を克服するために、フレームはビーム誘発運動を補正するように整列され、SNRが増加した顕微鏡写真が得られるように平均化される。これらの顕微鏡写真は、顕微鏡によって課される焦点ずれおよび収差の影響を説明するために、コントラスト伝達関数(CTF)推定を受ける。CTF補正顕微鏡写真から、個々の粒子が選択され、抽出され、ガラス質氷中の標本によって採用された異なる配向を表す2Dクラス平均にソートされる。得られた均質なパーティクルのセットは、 ab initio 3D再構成の入力として使用され、粗いモデルが生成され、その後、反復的に洗練されて1つ以上の高解像度構造が生成されます。再構成後、クライオEMマップの品質と解像度をさらに向上させるために、構造的な改良が行われます。最後に、原子モデルがマップから直接派生するか、マップが他の場所で得られた原子座標に適合されます。

Appion5、cisTEM6、cryoSPARC7、EMAN8、IMAGIC9、RELION10、Scipion11、SPIDER12、Xmipp13など、上記で概説したタスクを実行するためのさまざまなソフトウェアパッケージが利用可能です。これらのプログラムは同様の処理手順に従いますが、パーティクルの選択、初期モデルの生成、再構成の改良など、さまざまなアルゴリズムを採用しています。さらに、これらのプログラムは、新しいユーザーのハードルとして機能する可能性のあるパラメータの微調整に依存するものもあるため、動作するためにさまざまなレベルのユーザー知識と介入を必要とします。これらの不一致により、プラットフォーム間で一貫性のない品質と解像度のマップが生成されることが多く14、多くの研究者は複数のソフトウェアパッケージを使用して結果を改良および検証する必要があります。この記事では、クライオスパークv3、RELION-3、およびScipion 3を使用して、遺伝子治療に広く使用されているベクターであるAAVの高解像度3D再構成を得ることを強調します15。上記のソフトウェアパッケージは、アカデミックユーザーには無料です。cryoSPARC v3 および Scipion 3 にはライセンスが必要です。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 新しい cryoSPARC v3 プロジェクトの作成とデータのインポート

注:データは、ポートランドのオレゴン健康科学大学(OHSU)で、Falcon 3直接電子検出器を搭載した300kVタイタンクリオス電子顕微鏡を使用して取得されました。画像は、129フレームにわたって28.38e-/Å2の総線量と-0.5μm~-2.5μmのデフォーカス範囲、1.045ÅのピクセルサイズでEPUを使用して計数モードで収集された。AAV-DJのサンプルは大洲のスタッフから提供された。

  1. Web ブラウザーで cryoSPARC v3 を開き、「 プロジェクト」 ヘッダーをクリックします。[ + 追加 ] を選択して、新しいプロジェクトを作成します。それに応じてプロジェクトにタイトルを付け、ジョブとデータが保存される既存のディレクトリへのパスを指定します。
  2. プロジェクトのワークスペースを作成するには、プロジェクトを開き、[ + 追加] をクリックして、[ 新しいワークスペース] を選択します。ワークスペースにタイトルを付け、[ 作成] をクリックします。
  3. 新しいワークスペースに移動し、右側のパネルで ジョブビルダー を開きます。このタブには、クライオスパーク v3 で使用可能なすべての機能が表示されます。「ムービー のインポート」 をクリックし、ムービーパスを指定し、リファレンスファイルパスを取得し、集録パラメータを次のように設定します: 生ピクセルサイズ1.045 Å、 加速電圧300 kV、 球面収差 2.7 mm、 総露光量 28.38 e-/Å^2。
  4. 「キュー」をクリックし、ジョブを実行するレーンとワークスペースを選択して、「作成」をクリックします。
    メモ:集録パラメータはサンプルと顕微鏡に依存します。

2. CryoSPARC v3 - ムービーアライメントとCTF推定

  1. パッチモーション補正(マルチ)を開きます。このジョブでは、ステップ 1.3 でインポートしたムービーを入力として必要とします。ワークスペースでムービーの読み込みジョブカードを開き、Imported_movies出力を新しいジョブのムービープレースホルダにドラッグします。ジョブをキューに入れます。
    メモ: この記事で概説されている cryoSPARC メソッドの詳細については、cryoSPARC チュートリアル16 を参照してください。
  2. CTF 推定を実行するには、[ パッチ CTF 推定 (複数)] を開きます。手順 2.1 で生成された顕微鏡写真を入力し、ジョブを キュー に入れます。
  3. 平均顕微鏡写真とCTF補正顕微鏡写真を検査し、さらに処理するサブセットを選択するには、 Curate Exposures を開き、ステップ2.2で得られた露出を入力します。ジョブを キュー に入れます。
  4. ジョブが 待機 モードに入ったら、ジョブ・カードの 「対話」 タブをクリックし、パラメーターしきい値を調整し、さらに処理するために個々の顕微鏡写真を承認または拒否します。よく一致する推定CTFと実験的CTFを含む顕微鏡写真(図2)を受け入れ、高い乱視、CTF適合度が低く、厚い氷を持つものは廃棄してください。
  5. 現在のデータの処理中に、乱視の上限を 400 Å、CTF 適合分解能を 5 Å、相対氷厚を 2 に設定します。[ 完了 ] をクリックして、下流処理用の顕微鏡写真を選択します。

3. CryoSPARC v3 - 手動およびテンプレートベースのパーティクルピッキング

  1. 手動ピッカーを開き、ステップ 2.4 から 2.5 で受け入れられたエクスポージャーを入力し、ジョブをキューに入れます。[インタラクティブ]タブをクリックし、[ボックスサイズ(px)]を300に設定し、複数の顕微鏡写真で数百個の粒子をクリックし、重複する粒子を選択しないようにします。ここでは、29枚の顕微鏡写真にまたがる340個の粒子が選択された。完了したら、[ピッキング完了]をクリックします。パーティクルを抽出します。
    メモ: このプロトコルは、手動パーティクルピッキングを使用して、自動選択用のテンプレートを生成します。ただし、他の方法も利用できます17。
  2. 自動パーティクル ピッキングのテンプレートを生成するには、[ 2D 分類] をクリックし、ステップ 3.1 で生成されたパーティクル ピックを入力します。 2D クラス の数を 10 に変更し、ジョブを キュー に入れます。
  3. [2D クラスの選択] を開きます。ステップ 3.2 で取得したパーティクルとクラスの平均を入力し、[インタラクティブ]タブをクリックします。SNRが良好な代表的な2Dクラスを選択し、[完了]をクリックします。
    注: クラス平均は、さまざまなパーティクル ビューを反映します。各ビューを反映するクラス平均を選択します。目標は、自動ピッキングのために標本のさまざまなビューを表す明確に定義されたテンプレートを作成することです。
  4. テンプレートピッカーを開き、手順 3.3 で選択した 2D クラスと、手順 2.4 ~ 2.5 の顕微鏡写真を入力します。粒子径 (Å) を 220 Å に設定し、ジョブをキューに入れます。
  5. 自動ピックを検査するには、[ パーティクル ピックの選択] を開き、手順 3.4 で生成されたパーティクルと顕微鏡写真を入力して、ジョブを キュー に入れます。
  6. [パーティクル ピックの選択] ジョブ カードで、[インタラクティブ] タブをクリックし、[ボックス サイズ] (px) を 300 に設定します。個々の顕微鏡写真をクリックし、粒子がはっきりと見えるまでローパスフィルタを調整し、正規化相互相関(NCC)しきい値を0.41、電力しきい値を54000~227300に設定します。
  7. いくつかの顕微鏡写真を検査し、必要に応じて、ほとんどの粒子が誤検知を含めずに選択されるようにしきい値を調整します。完了したら、[ ピッキング完了] をクリックします。パーティクルを抽出します。
    注: 真のパーティクルは通常、NCC と検出力スコアが高く、それぞれテンプレートに似ており、SNR が高いことを示します。
  8. 顕微鏡写真 から抽出を開き、 ステップ3.7の顕微鏡写真と粒子を入力します。抽出された ボックス サイズ (px) を 300 に設定し、ジョブを キュー に入れます。

4. クライオスパーク v3 - 2D 分類

  1. [2D 分類] をクリックし、手順 3.8 から抽出した粒子を入力します。[2D クラスの数] を 50 に設定し、ジョブをキューに入れます。
  2. さらに処理に最適な 2D クラスを選択するには、[ 2D クラスの選択] を開きます。ステップ 4.1 で取得したパーティクルとクラスの平均を入力します。[ インタラクティブ] タブをクリックし、クラス内の解像度とパーティクル数に基づいて2Dクラスを選択します(図3)。成果物を含むクラスは選択しないでください。選択したら、[ 完了]をクリックします。
    注: 通常、パーティクルを除去するには 2D 分類を複数回行う必要がありますが、パーティクルは明確に定義された個別のクラスに収束しません。2D 分類のラウンドを必要な回数だけ実行して、このようなパーティクルをデータ セットから削除します (図 3)。

5. CryoSPARC v3 - アブ・イニティオ ・レコンストラクションと均質なリファインメント

  1. 初期3Dボリュームを生成するには、 Ab-initio Reconstruction を開き、ステップ4.2または最終的な2D分類から得られたパーティクルを入力します。 対称性 を二十面体に調整します。ジョブを キュー に入れます。
    メモ: 対称性はサンプルに依存するため、それに応じて変更する必要があります。不明な場合は、C1 対称を使用します。
  2. 均質な絞り込みを開きます。ステップ 5.1 の体積と 4.2 のパーティクル、または最終的な 2D 分類を入力します。対称性を変更し、ジョブをキューに入れます。ジョブが終了したら、フーリエシェル相関(FSC)曲線を調べ、UCSF Chimera18で調べるボリュームをダウンロードします。

6. クライオスパーク v3 からパーティクル座標をエクスポートし、PyEM を使用して RELION-3 にインポートする

注: パーティクル座標は、各顕微鏡写真内の個々のパーティクルの位置に関する情報を運びます。パーティクルスタックの代わりに座標をRELION-3に転送すると、そうでなければ利用できないリファインメントステップを実行できます。たとえば、パーティクル研磨では、初期ムービーフレームにアクセスする必要があります。したがって、クライオスパーク v3 から RELION-3 にパーティクル座標をエクスポートする前に、ムービーをインポートし、RELION-3 でモーション補正と CTF 推定を実行します。詳細については、RELION-3 チュートリアル 19 を参照してください。

  1. RELION-3 プロジェクトディレクトリに移動し、RELION-3 を起動します。
  2. ジョブタイプブラウザから インポート を開き、手順1.3のようにムービーと集録パラメータへのパスを指定します。
  3. モーション補正を実行するには、RELION-3 GUIからUCSF MotionCor220を使用し、 モーション補正 を開き、UCSF MotionCor2マニュアル21のようにデフォルトのパラメータを設定します。手順6.2で読み込んだムービーへのパスを入力します。[ モーション] タブで、 motioncor2 実行可能ファイルへのパスを指定します。
    メモ: MotionCor2 は、複数の GPU を使用して並列に実行できます。
  4. CTFFIND-4.122 を使用して RELION-3 GUI を使用して CTF 推定を実行します。CTF推定を開き、ステップ6.3で生成された顕微鏡写真.starを入力します。「CTFFIND-4.1」タブで、CTFFIND-4.1 実行可能ファイルへのパスを指定し、RELION-3.1 チュートリアル19 のようにパラメーターを設定します。
  5. パーティクルスタックを cryoSPARC v3 から RELION-3 にインポートするには、まず cryoSPARC v3 からパーティクルスタックをエクスポートする必要があります。cryoSPARC v3 で、ステップ 4.2 の 2D クラス選択 ジョブのジョブ・カードまたは最終的な 2D 分類を開きます。[ 詳細] タブで、[ ジョブのエクスポート]をクリックします。 エクスポートジョブ は、particles_exported.csファイルを出力します。
  6. cryoSPARC v3 から RELION-3 にパーティクル座標をインポートする前に、ステップ 6.5 のparticles_exported.csファイルを .star 形式に変換する必要があります。PyEM23 を使用して、次のコマンドを実行して、particles_exported.cs ファイルを .star 形式に変換します: csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
  7. RELION-3 で、[手動ピッキング] タブをクリックし、[I/O] タブで、手順 6.4 で説明した CTF 絞り込みの顕微鏡写真を入力します。[表示]タブで、次のパラメータを入力します:粒子径(A):220、ローパスフィルタ(A):-1、CTF画像のスケール:0.5。 ジョブを実行します。ManualPick というディレクトリが RELION-3 ホームフォルダに生成されます。
    メモ: この手順は、RELION-3 で手動ピッキングフォルダ構造を作成するために実行されます。手動ピッキングの実行中に、RELION-3 GUI でのピッキングに使用される平均顕微鏡写真ごとに、ピッキングされたパーティクルの座標を含む単一の .star ファイルが作成されます。
  8. ステップ 6.6 の particles_exported.star ファイルを含むフォルダーに移動し、自家製のスクリプトを実行して、クライオ SPARC v3 粒子のピッキングに使用される平均顕微鏡写真ごとに 1 つの manualpick.star ファイルを作成し、これがステップ 6.5 でエクスポートされた最終的な 2D 分類に貢献しました。結果の座標ファイルは、ManualPick/Movies フォルダーに保存されます。
  9. RELION-3 に戻り、 手動ピッキング ジョブを再度開きます。[ 続行]をクリックします。これにより、以前に cryoSPARC v3 で選択したパーティクルが RELION-3 GUI に表示されます。いくつかの顕微鏡写真を調べて、粒子座標の転送が達成されたかどうか、および粒子が適切に選択されているかどうかを確認します。

7. RELION-3 - 粒子抽出と2D分類

  1. 「粒子抽出」をクリックします。「I/O」タブで、ステップ 6.4 の CTF 補正顕微鏡写真とステップ 6.9 の座標を入力します。[抽出]タブをクリックし、[パーティクルボックスサイズ(pix)]を300に変更します。ジョブを実行します。
  2. 2D 分類を実行して、cryoSPARC v3 で生成されたパーティクル セットをさらにクリーニングし、高解像度の再構成を実現します。 [2D 分類] をクリックし、[ I/O ] タブで、手順 7.1 で生成された particles.star ファイルを入力します。「 最適化 」タブで、「 クラス数 」を「50」に、「 マスク直径 (A)」を「 280」に設定します。ジョブ を実行します 。
    メモ: マスクはパーティクル全体を網羅する必要があります。
  3. 最適な 2D クラスを選択するには、[ サブセットの選択] メソッドをクリックし、手順 7.2 の _model.star ファイルを入力して、ジョブ を実行します 。手順 4.2 の説明に従ってクラスを選択します。
  4. 手順 7.2 と 7.3 を繰り返して、収束していないパーティクルを削除します。

8. RELION-3 - 3Dリファインメント、マスク作成、後処理

  1. cryoSPARC v3 で生成されたマップ (ステップ 5.2) を RELION-3 の 3D リファインメントの初期モデルとして使用します。「インポート」方法を選択し、「I/O」タブで「生のムービー/顕微鏡写真のインポート: いいえ、生の入力ファイル: ムービー/*.mrc」のパラメータを設定します。
  2. MTF ファイルを指定し、手順 1.3 の説明に従ってムービー集録パラメータを入力します。[ その他 ] タブで、入力ファイルとして cryoSPARC v3 マップを選択し、[ ノードの種類] を 3D 参照 (.mrc) に変更して、ジョブ を実行します 。
  3. 「 3D 自動調整 」を選択し、「 I/O 」タブで、「 入力イメージ」 をステップ 7.3 または最後の選択ジョブの particles.star ファイルとして設定します。クライオスパーク v3 再構築を リファレンス マップとして指定します。「 参照 」タブをクリックし、「 初期ローパス・フィルター (Å) 」を「50」に変更し、「 対称」 を「二十面体」に変更します。「 最適化 」タブで、「 マスク直径 (Å)」を「280」に変更し、ジョブ を実行します 。
  4. ランニングが終わったら、UCSFキメラでrun_class001.mrcを開きます。
  5. UCSF キメラで、[ ツール ]をクリックし、[ボリューム データ]で [ボリュームビューア]を選択します。これにより、音量設定を調整するための新しいウィンドウが開きます。 [ステップ ] を 1 に変更し、マップにノイズがないレベル値に達するまでスライダーを調整します。この値は、次のステップでマスクの作成に使用されるため、記録します。
  6. 自動精錬から生成されたマップは、周囲の溶媒からのノイズが解像度を低下させるため、真のFSCを反映していません。後処理の前に、試料と溶媒領域を区別するマスクを作成します。
    1. 「マスクの作成」をクリックし、ステップ 8.3 から入力run_class001.mrc をクリックします。
    2. 「マスク」タブをクリックし、次のようにパラメーターを調整します: ローパス・フィルター・マップ (Å): 10、ピクセル・サイズ (Å): 1.045、初期二値化しきい値: ステップ 8.5 で取得したレベル値、バイナリー・マップの拡張 この数ピクセル: 3、およびこのピクセル数のソフト・エッジの追加: 3. ジョブを実行します。
  7. UCSFキメラのマスクを調べます。マスクがきつすぎる場合は、「 バイナリマップを拡張」をこの数 ピクセル増やすか 、このピクセル数のソフトエッジを追加します。鋭いマスクはオーバーフィットにつながる可能性があるため、柔らかいエッジを持つマスクを作成することが重要です。
  8. 「後処理」をクリックし、「I/O」タブで、ステップ 8.3 で作成したハーフマップを入力し、8.6 からマスクします。[キャリブレーション済みピクセル サイズ] を 1.045 Å に設定します。シャープタブで、次のように入力します:B因子を自動的に推定しますか?:はい、自動B適合の最低解像度(A):10、独自のB因子を使用しますか?:いいえ。[フィルター] タブで、[FSC 重み付けをスキップしますか?] を [いいえ。ジョブを実行します] に設定します。

9. RELION-3 - 研磨トレーニングと粒子研磨

  1. 粒子ビームによって誘発される動きを補正する前に、まずトレーニングモードを使用してデータセットに最適なモーショントラックを特定します。 ベイジアン研磨 を開き、[ I/O ]タブで、手順6.3の動き補正顕微鏡写真、手順8.3のパーティクル、および手順8.8の後処理.starファイルを入力します。[ トレーニング ]タブをクリックし、次のパラメータを設定します: トレーニング最適パラメータ :はい、 テスト用のフーリエピクセルの割合:0.5、 この多くのパーティクルを使用:5000。ジョブ を実行します 。
    メモ: このスクリプトは、次の手順opt_params_all_groups.txt実行するために必要な最適化された研磨パラメータを含む RELION-3 Polish フォルダにファイルを生成します。
  2. トレーニングジョブが終了したら、[ベイジアンポリッシング]をクリックします。[トレーニング]タブをクリックし、[最適なパラメータのトレーニング?]を[いいえ]に設定します。「ポーランド語」タブを選択し、「最適化されたパラメーター・ファイル」で、ステップ 9.1 のopt_params_all_groups.txtファイルへのパスを指定します。[実行]をクリックします。
  3. 研磨された粒子のセットで3D精錬(ステップ8.3)と後処理(ステップ8.8)を繰り返します。

10. RELION-3 - CTFおよび粒子ごとの微細化

  1. 高次収差を推定するには、[ CTF リファインメント ]を開き、[ I/O ]タブの[パーティクル]で、最近のリファイン3Dジョブ(run_data.star)で研磨された パーティクルを含む.starファイルへのパスを選択します。
    1. 「後処理 スター・ファイル」で、最新の後処理ジョブからの出力へのパスを設定します (ステップ 9.3)。
    2. 「適合」(Fit) タブを選択し、次のパラメータを設定します: 推定値 (異方性倍率): いいえ、CTF パラメータ適合を実行しますか?いいえ、ビームチルトを推定:はい、トレフォイルも推定しますか?はい、4次収差を推定しますか?はい。ジョブを実行します。
  2. 前のジョブ(particles_ctf_refine.star)で生成されたパーティクル(Refine3Dから)を入力として使用して、手順10.1を繰り返します。「適合」タブで、「推定値 (異方性倍率)」を「はい」に変更し、ジョブを実行します。
  3. 前のジョブ(particles_ctf_refine.star)で生成された (Refine3Dから)パーティクル を入力として使用して、手順10.2を繰り返します。[ 適合] タブで、次のパラメータを設定します: 推定値(異方性倍率):いいえ、 CTFパラメータフィッティングを実行?:はい、 フォーカスを合わせる?:パーティクルごと、 乱視をフィット? 顕微鏡写真ごと、 B因子を適合?: いいえ、 位相シフトを適合:いいえ、 ビームチルトを推定?: いいえ、 4次 収差を推定?: いいえ、 実行 します。
    注記: パーティクルのコントラストが十分であれば、[ 乱視に適合? ]タブを パーティクルごとに設定できます。このデータセットでは、 パーティクルごとの 乱視の絞り込みでは、マップの品質と解像度は向上しませんでした。
  4. 手順 10.3 のパーティクルで 3D リファインメントを繰り返し、[I/O] タブで [ 溶剤で平坦化された FSC を使用?] を [ はい] に設定します。実行が終了したら、後処理ジョブを実行し(ステップ8.8)、UCSFキメラでマップを調べる(ステップ5.2)。

11. RELION-3 パーティクル座標と 3D マップを Scipion 3 に転送する

  1. RELION-3 マップをさらに絞り込んで検証するには、まず最後の後処理ジョブ (ステップ 10.4) からボリュームとパーティクルを Scipion 3 にインポートします。Scipion 3 を起動し、新しいプロジェクトを作成します。
  2. 左側の[プロトコル]パネルで、[インポート]ドロップダウンを選択し、[パーティクルのインポート]をクリックします。 次のパラメータを変更します: インポート元: RELION-3、スターファイル: postprocess.star、およびステップ 1.3 のように取得パラメータを指定します。「実行」をクリックします。
  3. [インポート]ドロップダウンをクリックし、[ボリュームのインポート]を選択します。[インポート元] で、RELION-3 マップへのパスを指定します。ピクセルサイズ(サンプリングレート)Å/pxを1.045に変更して実行します。

12. Scipion 3 - 高解像度の改良

  1. まず、グローバルアライメントを実行します。[プロトコル] パネルの [絞り込み] ドロップダウンを選択し、[Xmipp3 - highres24] をクリックします。ステップ 11.2 および 11.3 からインポートしたパーティクルとボリュームをそれぞれフルサイズ イメージおよび初期ボリュームとして入力し、対称グループを 2 面体に設定します。[角度割り当て]の下の[画像の配置]タブで、[グローバル]を選択し、[最大ターゲット解像度]を3 Åに設定して、ジョブを実行します。
  2. ジョブが終了したら、[ 結果の分析] をクリックします。新しいウィンドウで、 UCSF キメラ アイコンをクリックして、洗練されたボリュームを調べます。さらに、[ 表示解像度プロット( FSC)]をクリックして絞り込み後にFSCがどのように変化したかを確認し、[角度 変更によるヒストグラムをプロット] をクリックしてオイラー角度の割り当てが変更されたかどうかを確認します。
    メモ: 入力 RELION-3 構造体の解像度によっては、[角度割り当て] タブの [最大ターゲット解像度] に異なる値を設定して、この手順を複数回繰り返すことができます。詳細については、Scipion チュートリアル25 を参照してください。
  3. 手順 12.1 をローカル位置合わせで繰り返します。前のジョブをコピーし 、[前の実行の選択] を [Xmipp3 - 高解像度グローバル] に変更します。[ 角度の割り当て ] タブで、[ 画像の配置 ] を [ ローカル] に変更します。 最大ターゲット解像度 を 2.1 Å に設定します。
  4. UCSFキメラの洗練されたマップを調べ、FSCと角度割り当ての変化を分析します(ステップ12.2)。解像度が向上しず、角度割り当てが収束するまでローカル絞り込みを繰り返し、必要に応じて 最大ターゲット解像度 を調整します。
  5. Scipion 3 からの出力マップは、Phenix26 でさらに密度を変更し、シャープにすることができます。

13. Scipion 3 - マップ検証

  1. Xmipp3 - 高解像度で生成された最終的なマップのローカル解像度を調べます。Xmipp - ローカル MonoRes27 を開き、前のジョブの最終ボリュームとステップ 8.6 で生成されたマスクを入力します。解像度範囲を1~6Å、間隔を0.1Åに設定し、ジョブを実行します。
  2. 実行が終了したら、[ 結果の分析] をクリックし、解像度ヒストグラムと解像度で色分けされたボリュームスライスを確認します。
  3. パーティクルが適切にアライメントされているかどうかを確認するには、[ マルチリファレンス アライナビリティ]28を開き 、ステップ12.3のパーティクルと体積を入力します。 結果の分析 をクリックして、検証プロットを表示します。理想的には、すべてのポイントを周囲にクラスター化する必要があります (1.0,1.0)。
  4. Xmipp3 - オーバーフィットの検証を開きます。ステップ 12.3 のパーティクルとボリュームを入力します。実行が終了したら、結果を分析し、オーバーフィットプロットを調べます。整列ガウスノイズと整列パーティクル曲線の交差は、オーバーフィットを示します。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々は、3つの異なる処理プラットフォーム(cryoSPARC v3、RELION-3、およびScipion 3)を使用して高解像度構造を得るための包括的なSPAパイプラインを提示した。図 1 と図 4 は一般的な処理ワークフローをまとめたもので、表 1 は改良プロトコルの詳細を示しています。これらのプロトコルは、AAVの2.3 Å構造の改良中に使用され、ナイキスト分解能に近いものを達成した。

ムービーは最初に cryoSPARC v3 にインポートされ、その後モーション補正と CTF 補正が行われ、平均顕微鏡写真が生成されました。さらなる処理のために顕微鏡写真を選択する場合、低品質の顕微鏡写真を含めると後の処理段階が妨げられ、解像度の低い再構成につながる可能性があるため、CTF適合度が高く、乱視が低いものを選択することが重要です(図2)。次いで、27,364個の粒子をピッ...

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Discussion

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この記事では、さまざまなソフトウェアプラットフォーム間でクライオEMデータ処理を行い、高解像度の3D再構成を実現するための堅牢なSPAワークフローを紹介します(図1)。このワークフローは、多種多様な生物学的巨大分子に適用可能である。プロトコルの後続のステップは、ムービーの前処理、パーティクルのピッキングと分類、および構造の微細化(表1)と検証のための複数の方法を含む、図4に概説されています。cryoSPARC v3、RELION-3、およびScipion 3の処理ステップと、ソフトウェアパッケージ間でデータを転送する方法が紹介されています。プロトコル全体で得られた中間構造を、分解能を高めて示しました(図4、図6、 図7

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Disclosures

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著者らは開示するものは何もありません。

Acknowledgements

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Scipion3のインストールに協力してくれたCarlos Oscar Sorzano氏と、異なる処理プラットフォーム間のデータ転送を支援してくれたKilian Schnelle氏とArne Moeller氏に感謝します。この研究の一部は、NIH助成金U24GM129547によって支援され、OHSUのPNCCで実施され、生物環境研究局が後援するDOE科学局ユーザー施設であるEMSL(grid.436923.9)を介してアクセスされました。この研究は、ラトガース大学からアレク・クルチクへのスタートアップ助成金によって支援されました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CryoSPARCStructura Biotechnology株式会社https://cryosparc.com/
CTFFIND 4ハワード・ヒューズ医学研究所、マサチューセッツ大学医学部https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2UCSF Macromolecular Structure Grouphttps://msg.ucsf.edu/software
PhenixComputational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)http://www.phenix-online.org/
PyEMカリフォルニア大学サンフランシスコhttps://github.com/asarnow/pyem
RELIONMRC Laboratory of Structural Biologyhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
ScipionInstruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLabhttp://scipion.i2pc.es/
UCSF ChimeraUCSF Resource for Biocomputing,視覚化と情報学https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
校

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
  2. Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  3. Wardell, M., et al. The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A. Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).
  4. PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB. , Available from: https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2021).
  5. Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  6. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383(2018).
  7. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  8. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  9. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  10. Scheres, S. H. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  11. de la Rosa-Trevin, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  12. Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  13. Sorzano, C. O., et al. XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).
  14. Lawson, C. L., Chiu, W. Comparing cryo-EM structures. Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).
  15. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  16. Dawood, S., Punjani, S., Arulthasan, S. Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at. , Available from: https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial (2020).
  17. Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nature Communications. 11 (5208), (2020).
  18. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  19. Scheres, S. Single-particle processing in RELION-3.1. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf (2019).
  20. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  21. Zheng, S. MotionCor2 User Manual. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf (2018).
  22. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  23. Asarnow, D., Palovacak, E., Cheng, Y. UCSF PyEM v0.5. , Available from: https://github.com/asarnow/pyem (2019).
  24. Sorzano, C. O. S., et al. A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy. Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).
  25. Jimenez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261(2021).
  26. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
  27. Vilas, J. L., et al. MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps. Structure. 26 (2), 337-344 (2018).
  28. Sorzano, C. O., et al. A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).
  29. Penczek, P. A. Resolution measures in molecular electron microscopy. Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).
  30. Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution. Viruses. 12 (10), 1194(2020).
  31. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166(2018).
  32. Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).

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