単一核RNAシーケンシングのためのマウス交感神経節のバーコード化抗体による低入力核単離および多重化

Yang Ge; Lieke van Roon; H. Sophia Chen; Ruben Methorst; Martin Paton; Marco C. DeRuiter; Szymon M. Kielbasa; Monique R. M. Jongbloed

doi:10.3791/63397

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方法論記事

単一核RNAシーケンシングのためのマウス交感神経節のバーコード化抗体による低入力核単離および多重化

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DOI:

10.3791/63397

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2022年3月23日

Yang Ge¹^,² , Lieke van Roon¹ , H. Sophia Chen¹^,² , Ruben Methorst¹ , Martin Paton² , Marco C. DeRuiter¹ , Szymon M. Kielbasa³ , Monique R. M. Jongbloed¹^,²

¹Department of Anatomy & Embryology, Leiden University Medical Center, ²Department of Cardiology, Leiden University Medical Center, ³Department of Medical Statistics and Bioinformatics, Leiden University Medical Center

この記事について

サマリー

このプロトコルは、マウス上頸部および星状神経節の解剖、細胞解離、凍結保存、核単離、ハッシュタグバーコーディングなど、単一核シーケンシングのための詳細で低入力のサンプル調製について説明しています。

要約

心臓自律神経系は、心拍数や心収縮などの心機能を制御する上で重要であり、交感神経と副交感神経の枝に分かれています。通常、恒常性を維持するためにこれら2つの枝の間にはバランスがあります。しかし、心筋梗塞、心不全、高血圧などの心臓病状態は、心臓神経支配に関与する細胞のリモデリングを誘導する可能性があり、これは有害な臨床転帰と関連している。

心臓自律神経系の組織学的構造と機能に関する膨大な量のデータがあるが、健康と疾患におけるその分子生物学的構造は、依然として多くの面で謎めいている。単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)などの新しい技術は、単一細胞分解能での組織の遺伝的特性評価に有望です。しかしながら、ニューロンのサイズが比較的大きいことは、これらの技術の標準化された使用を妨げる可能性がある。ここで、このプロトコルは、液滴ベースの単一核RNAシーケンシング(snRNA-seq)を利用し、健康および疾患における心臓交感神経ニューロンの生物学的アーキテクチャを特徴付ける方法である。段階的なアプローチは、成体マウスから解剖された両側上頸部(SCG)および星状神経節(StG)のsnRNA-seqを行うことが実証される。

この方法により、長期間のサンプル保存が可能となり、短期間に複数の個人/実験からのサンプルを一度に採取できない場合でも、適切なRNA品質を維持できます。ハッシュタグオリゴ(HTO)で核をバーコードすることで、シーケンシング後の個別の神経節サンプルの多重化解除とトレースバックが可能になります。その後の解析により、交感神経節のニューロン、衛星グリア、および内皮細胞の核捕捉が成功し、snRNA-seqによって検証された。要約すると、このプロトコルは、交感神経外因性心核のsnRNA-seqに対する段階的なアプローチを提供し、他の器官および組織の神経支配の研究においてより広範な適用の可能性を有する方法である。

概要

自律神経系(ANS)は、環境条件や病態への適応を含む身体の恒常性を維持する末梢神経系の重要な部分です¹。これは、心臓血管系、呼吸器系、消化器系、および内分泌系などの全身の複数の臓器系の調節に関与しています。ANSは交感神経と副交感神経の枝に分かれています。交感神経系の脊髄枝は、交感神経鎖の神経節においてシナプスし、傍椎体の位置で両側に位置する。両側頸部および胸部神経節、特にStGは、心臓交感神経支配に関与する重要な構成要素である。心臓虚血などの疾患状態では、ニューロンリモデリングが起こり得、交感神経オーバードライブ²をもたらす。ニューロンリモデリングは、ヒトおよびいくつかの他の動物種における複数の組織学的研究において実証されている³、⁴、⁵^、⁶。心臓交感神経節における心臓虚血誘発ニューロンリモデリングの詳細な生物学的特徴付けは現在欠如しており、心臓交感神経系(SNS)内の特殊なニューロン細胞型またはサブタイプの基本的な生物学的特徴は、健康および疾患においてまだ完全には決定されていない⁷。