Method Article

ソフトマターナノインデンテーションの実験・データ解析ワークフロー

DOI:

10.3791/63401

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January 18th, 2022

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1Centre for the Cellular Microenvironment, James Watt School of Engineering, University of Glasgow, 2Optics 11 life, 3Laboratory of Biosensors and Bioelectronics, ETH Zürich

In This Article

Summary

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このプロトコルは、ヒドロゲルや細胞を含むソフトマテリアルナノインデンテーション実験のための完全なワークフローを提供します。まず、力分光法データを取得するための実験手順が詳述されています。次に、そのようなデータの分析は、GitHubから無料でダウンロードできる新しく開発されたオープンソースのPythonソフトウェアを通じて詳細に説明されます。

Abstract

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ナノインデンテーションとは、マイクロメトリックフォースプローブを使用してソフトバイオマテリアルや細胞の局所的な機械的特性を定量化する実験技術のクラスを指します。このアプローチは、メカノバイオロジー、生体材料設計、組織工学の分野で中心的な役割を果たし、単一細胞サイズ(μm)に匹敵する分解能でソフトマテリアルの適切な機械的特性評価を取得しています。このような実験データを取得するための最も一般的な戦略は、原子間力顕微鏡(AFM)を使用することです。この装置は、力(pNまで)と空間(サブnmまで)において前例のない分解能を提供しますが、その使いやすさは、ヤング率(E)などの機械的特性の積分指標の日常的な測定を妨げる複雑さによって制限されることがよくあります。光ファイバセンシング技術に基づくものなどの新世代のナノインデンターは、μmの空間分解能でサブnN力を加えることを可能にしながら、統合が容易であることから最近人気を博しているため、ヒドロゲルや細胞の局所的な機械的特性を調べるのに適しています。

このプロトコルでは、市販のフェルールトップ光ファイバセンシングナノインデンターを使用してヒドロゲルおよびセルに関するナノインデンテーションデータを取得するための実験手順を詳述するステップバイステップガイドが提示されます。いくつかのステップは本明細書で使用される器具に固有であるが、提案されたプロトコルは、他のナノインデンテーションデバイスのためのガイドとしてとらえることができ、いくつかのステップが製造業者のガイドラインに従って適合されることを前提とする。さらに、ナノインデンテーションデータを分析するためのユーザーフレンドリーなグラフィカルユーザーインターフェイスを備えた新しいオープンソースのPythonソフトウェアが提示され、誤って取得された曲線のスクリーニング、データのフィルタリング、さまざまな数値手順による接触点の計算、 従来のEの計算、および特にシングルセルナノインデンテーションデータに適したより高度な分析が可能になります。

Introduction

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生物学における力学の基本的な役割は、今日確立されています1,2。全組織から単一細胞まで、機械的特性は、調査中の生体材料の病態生理学的状態について知らせることができます3,4。例えば、癌の影響を受けた乳房組織は健康な組織よりも硬い、これは一般的な触診検査5の基礎となる概念である。特に、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)によって引き起こされるコロナウイルス病2019(COVID-19)は、赤血球変形能の低下、リンパ球および好中球のこわばりの減少など、血球の機械的特性の変化によって強調されていることが最近示されていますSARS-CoV-2ナイーブな個人の血球と比較して6。

一般に、細胞と組織の力学は本質的に絡み合っており、各組織は構成細胞と細胞外マトリックス(ECM)のそれらに同時に影響を及ぼし、依存する特定の機械的特性を持っています5。このため、生物学の力学を研究するための戦略には、生理学的に関連する機械的刺激を備えた基板を操作して、それらの刺激に応答した細胞の挙動を解明することが....

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Protocol

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1. ナノインデンテーション測定用基板/セルの作製

  1. ナノインデンテーション実験用のPAAmヒドロゲル/セルの調製に関する 補足プロトコル に記載されている手順に従ってください。この手順を 図 2 にまとめます。
    注:PAAmヒドロゲルは、メカノバイオロジーの分野で使用される最も一般的なヒドロゲルであるため、選択されています。しかしながら、プロトコルは、任意のタイプのヒドロゲル25 に等しく適用可能である( 考察、方法の修正を参照されたい)。

2.デバイスの起動、プローブの選択、およびプローブのキャリブレーション

  1. 補足プロトコルに記載されている手順に従って、デバイスを起動します。光ファイバフェルールトップナノインデンターの動作に関する技術的な詳細については、これらの参考文献17,18を確認してください。
  2. 以下の説明に従ってナノインデンテーションプローブを選択します。
    注意: このプロトコルで使用されているよ....

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Results

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プロトコルに従って、F-z曲線のセットが得られます。データセットには、適切な曲線と、分析を続行する前に破棄する曲線が含まれている可能性があります。一般に、曲線の形状が図 4A に示すものと異なる場合は、曲線を破棄する必要があります。図5AIは、NanoPrepare GUIにアップロードされた予想されるE 0.8 KPa35のソフトPAAmヒドロゲルで得られた~100個の曲線のデータセットを示しています。ほとんどの曲線は、明確で平坦な基線、遷移領域、および材料13 の見かけの剛性に比例する傾斜領域を示します。ただし、少数の曲線は、ベースラインがない、接触がない、ベースラインが傾斜しているなど、図4Aに示す形状からの変更を示しています。これらの曲線は、NanoPrepare (図 5AII、赤い曲線) と、標準の JSON 形式で保.......

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Discussion

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このプロトコルは、市販のフェルールトップナノインデンターを使用して、ハイドロゲルとシングルセルの両方で力分光ナノインデンテーションデータを堅牢に取得する方法を示しています。さらに、ナノインデンテーションデータの分析のための正確なワークフローを含むPythonでプログラムされたオープンソースソフトウェアの使用手順が提供されます。

プロトコルの重要なステップ
次の手順は、このプロトコルに従う場合に特に重要であることが確認されています。

サンプル調製

測定を開始する前に、測定の制約を念頭に置いてサンプルを準備することが重要です。つまり、サンプルは表面に接着し、できるだけ平らでなければなりません。これは、ヒドロゲルなど、細胞のように表面に自然に付着しないサンプルを調製する場合に特に重要です。まず、サンプルは測定を妨げ、プローブを損傷する可能性があるため、溶液中に浮遊してはなりません。このためには、カバーガラスの化学的官能基化が推奨され、その.......

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Disclosures

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著者は開示するものは何もありません。

Acknowledgements

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GCとMAGOは、CeMiのすべてのメンバーを認めています。MSSは、EPSRCプログラム助成金(EP/P001114/1 )による 支援を認めています。

GC:ソフトウェア(ソフトウェア開発とアルゴリズムへの貢献)、形式解析(ナノインデンテーションデータの解析)、検証、調査(ポリアクリルアミドゲルのナノインデンテーション実験)、データキュレーション、ライティング(原案、レビュー、編集)、可視化(図とグラフ)。 MAGO:調査(ゲルと細胞サンプルの準備、細胞のナノインデンテーション実験)、書き込み(元のドラフト、レビューと編集)、視覚化(図とグラフ)。 NA:検証、書き込み(レビューと編集)。 IL:ソフトウェア(ソフトウェア開発とアルゴリズムへの貢献)、検証、執筆(レビューと編集)。 MV:概念化、ソフトウェア(オリジナルソフトウェアとアルゴリズムの設計と開発)、検証、リソース、執筆(原案、レビューと編集)、監督、プロジェクト管理、資金調達 MSS:リソース、ライティング(レビューと編集)、監督、プロジェクト管理、資金調達。すべての著者が最終原稿を読み、承認しました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12 mmカバースリップVWR631-1577P
35 mm細胞処理培養皿Greiner CELLSTAR627160
アクリルアミドSigma-AldrichA4058
アクリルシランAlfa AesarL16400
過硫酸アンモニウムMerk7727-54-0
BisacrylamideMerk110-26-9
キアロナノインデンター光学11 Life カトローグ番号なし
エタノール一般
ウシ胎児血清ギブコ16140071
高グルコース DMEMギブコ11995065
イソプロパノール一般
キムワイプキンバリー・クラーク21905-026
顕微鏡スライドVWR631-1550P
MilliQ システムMerk MilliporeZR0Q008WW
OP1550 干渉計光学11 寿命カタログ番号なし
光学 11 生命プローブ (k = 0.02-0.005 N/m, R = 3-3.5 um)光学 11 生命カトローグ番号なし
光学 11 生命プローブ (k = 0.46-0.5 N/m, R = 50-55 um)光学 11 生命カトローグ番号なし
ペニシリン/ストレプトマイシンGibco15140122
RainX 防雨剤RainX26012
標準シャーレ (90 mm)Thermo Scientific101RTIRR
テトラメチルエチレンジアミンSigma-Aldrich110-18-9
真空乾燥器Thermo Scientific531-0250
ソフトウェア
データ取得ソフトウェア (v 3.4.1)Optics 11 Life
GitHub Desktop (オプション)Microsoft
Python 3Python Software Foundation
Visual Studio Code (オプション)Microsoft

References

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  1. Discher, D. E., Janmey, P. Y. W. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), New York, N.Y. 1139-1143 (2005).
  2. Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying forces in cell biology. Nature Cell Biology. 19 (7), 742-751 (2017).
  3. Gu....

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