海馬および前頭前野における樹状突起脊椎の可視化のための迅速なゴルジ染色

サマリー

プロトコルは、ラットの海馬および内側前頭前野のニューロンを染色するための、神経系の任意の部分に適合させることができる迅速ゴルジ法の改変を記載している。

要約

ゴルジ体含浸は、軽微な適応を伴うゴルジ染色キットを使用して、ラット海馬および内側前頭前野の樹状突起棘を含浸させるために使用される。この技術は、予め混合された化学物質がより安全に使用でき、ニューロンが一貫して良好に含浸され、バックグラウンド破片がはるかに少なく、所与の領域について、実験間の脊椎密度の偏差が非常に小さいため、ゴルジ体含浸の以前の方法よりも顕著な改善である。さらに、脳はある時点以降に蓄積され、さらなる処理まで凍結し続けることができます。この方法を用いて、任意の脳の関心領域を研究することができる。一度染色され、カバーが滑ると、樹状突起脊椎密度は、樹状突起の長さに対する棘の数を数えることによって決定され、樹状突起10μmあたりの背骨密度として表される。

概要

ニューロンを標識するために重クロム酸カリウムと硝酸銀を使用する方法は、Camillo Golgi ^1,2によって最初に記載され、続いてサンティアゴ・ラモン・イ・カハールによってニューロンおよびグリアのサブタイプを区別する膨大な量の仕事を生み出すために使用された。最近出版された彼のイラスト入りの本が発売されました³.100年以上前に発表されたラモン・イ・カハールの研究に続いて、ゴルジの含浸はほとんど使用されなかった。ゴルジ体含浸は、光学顕微鏡でニューロンを3次元的に可視化することを可能にする面倒なプロセスです。ゴルジ法には、方法をより簡単にし、染色をより一貫性のあるものにするために、長年にわたって多数の修正が加えられてきました⁴。1984年、GabbottとSomogyi⁵は、より迅速な処理を可能にする単一セクションのゴルジ含浸手順を説明しました。このゴルジ体含浸法では、4%パラホルムアルデヒドと1.5%ピクリン酸による灌流、固定後、3%重クロム酸カリウムの浴にビブラトーム切片が必要です。切片はスライドガラスに取り付けられ、カバースリップの四隅は硝酸銀に浸すと拡散が緩やかになるように接着されています。その後、カバースリップがはじけ、セクションが脱水され、最終的にカバーがマウント媒体で永久に滑り落ちます。この技術は、海馬のニューロンおよびグリア^6,7,8を標識するために首尾よく使用された。ここで説明する迅速なゴルジ法は、重クロム酸カリウムと硝酸銀の両方への曝露がはるかに少なく、パラホルムアルデヒドとピクリン酸が使用されていないため、改善点です。さらに、Gabbott and Somogyi⁵法の改変を用いて含浸させた細胞を分析することはできたが、脱水工程中に切片が過剰または露出不足であったり、スライドから落ちたりすることが多く、一般に、分析に十分な細胞を得るためにいくつかの実験をプールする必要があった。

本プロトコールは、ラットの海馬および内側前頭前野(mPFC)における樹状突起および樹状突起棘を標識するためのゴルジ染色キット(材料表を参照)の使用を記載している。以前の方法に対するこの方法の利点は、それが迅速であり、研究者にとって有害な化学物質への曝露が少なく、ニューロンの一貫した染色があることです。以下に記載するプロトコールは、多くの研究⁹、^10、11、¹²、¹³、^14、15においてラットの海馬およびmPFCにおける樹状突起脊椎密度を評価するために軽微な修正を加えて使用されている。

プロトコル

すべての実験手順は、セイクリッドハート大学施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されており、動物のケアと使用のためのNIHガイドに準拠しています。

1. 脳組織の単離と浸潤

1. ゴルジ体染色キットのプレミックス溶液AおよびBは、使用の24時間前に、暗いボトルおよび/または暗所に保管してください。約80mLの溶液AとBを混合し、24時間後に溶液を交換するのに十分である。気密ボトルに保管してください。
   注:生理食塩水またはパラホルムアルデヒドによる灌流は必要ありません。
2. 二酸化炭素安楽死後、ギロチンでラットを犠牲にし、数秒以内に脳を除去します。必要に応じて生理食塩水で脳をすすいでください。
   1. 脳、皮質を下に置き、視床下部が見えるようにします。 図1に示すように、前部(前頭前野を含む)と後部(海馬を含む)のブロックに切断する。
3. AとBの予め混合された溶液にブロックを置き、それらが溶液によく浸っていることを確認する。ソリューション A とソリューション B のボリュームがブロックを浸漬するのに十分であることを確認します。ブロックは、茶色のボトルまたはホイルで覆われた透明なボトル(光を逃がさないように)に室温で暗闇の中で保管してください。
4. 24時間後に溶液を交換し、室温でさらに13日間暗所に保管する。
   注:マウスの脳と一緒に使用する場合、ブロックする必要はなく、脳全体を溶液に入れることができます。サイズが異なる脳領域を染色する場合、溶液AおよびBにおける時間は試行錯誤によって決定されなければならないかもしれない。
5. 2週間後、組織に溶液AおよびBを十分に浸潤させ、ブロックを凍結保護剤溶液(ゴルジ体染色キットの溶液C)に移し、4°Cで48〜72時間放置する。
   注:凍結保護後、ブロックはさらなる処理まで凍結されることがあります。また、キットのすべての溶液が収集され、有害廃棄物として処分されることに注意してください。
6. ドライアイスのスライドガラスの上で、脳、皮質を凍らせます。凍結したらクライオスタット上で切断するか、クライオスタットを用いて切片化するまで-80°Cで保存する。
   注:液体窒素で凍結すると組織に亀裂が入るため、凍結しないでください。

2. 脳組織の切片化

1. 予め冷却されたクライオスタットチャック上に少量の組織培地を置く。ブロックをクライオスタットチャックに取り付けるには、ブロックの片側をわずかに手で解凍し(手袋をはめた)、組織媒体の上に置きます。
   注:組織を埋め込む必要はありません。海馬を含むブロックは、後者が脳梁の前部にあり、2つの半分が分離されているため、前頭前野を有するブロックよりも切断がやや容易である。
2. -22 °C のクライオスタットで 100 μm の切片を切り取り、サブベッドスライドに取り付けます。厚さ150μmまでの切片を使用できます。スライドごとに3〜4個のコロナセクションを取り付けてみてください。次のいずれかの方法を使用して、スライドが表示されるまでセクションを固定したままにします。
   注:これらのセクションは通常の方法では固定されていないため、すぐに溶ける傾向があります。スライド上でセクションが溶けるのを待ちます。スライドに置かれる前に溶け始めると、スライド上で平らにすることは不可能です。これを行うにはいくつかの方法があります。
   1. ナイフとブロックに凍結スプレーを使用してください。部屋の温度と湿度によっては、これはすべてのセクションに必要になる場合があります。アンチロールプレートまたはブラシを使用して、切断中にセクションを平らに保ちます。
      注:十分な凍結スプレーがあることを確認してください。20ブロックを切断する際には、いくつかの缶を使用できます。
   2. 可能であれば、室温スライドを使用してマウントを解凍し、すぐにセクションに配置します。練習すれば、一度に複数のセクションをマウントできます。これでうまくいかない場合は、スライドをクライオスタットに保持して非常に冷たく保ち、冷たい鉗子または冷たいペイントブラシでセクションを転送してから、マウントを解凍します。
3. スライスの間の紙拭き取りでナイフをきれいにします。ナイフの洗浄がさらに必要な場合は、100%エタノール(EtOH)を使用し、次のスライスを切る前に乾燥させてください。
4. スライドに取り付けたら、スライドを段ボールのスライドトレイに平らに置き、暗闇の中で室温(数時間から最大48時間)でセクションを乾燥させます。スライドトレイを覆わないでください。ゴルジ体含浸前にセクションが完全に乾燥していることを確認してください。ゴルジ体が含浸するまで、暗闇の中でスライドトレイに平らに保管してください。
   メモ: セクションを乾燥させても破損はありません。

3. 脳組織の染色と脱水

1. ガラスステイン皿でステインを行います。染色の直前に溶液DとEを混合する。プロトコルに従って、溶液Dの1つの部分、溶液Eの1つの部分、および蒸留水の2つの部分を加える。ガラスステンド皿の場合は、200mLの溶液を作って切片を完全に沈めます。コプリン瓶の場合、これはより少ない量を必要とします。
2. スライドは、ソリューションがセクションにアクセスできるように十分に離れたラックに配置します。
3. 切片を蒸留水に4分間(2x)入れてから、ゴルジ体含浸染色液に10分間入れます。染色液を70切片ごとに交換する。黄色に変わったら蒸留水を交換してください。
   メモ:染色ステップのタイミングは重要です。短すぎると十分な染色ができず、長すぎると染色が過剰になり、分析時に樹状突起が分離しにくくなります。染色溶液から出ると、タイミングはそれほど重要ではありません。
4. 切片を以下のように脱水する:70%EtOH(5分)、95%EtOH(5分;2倍)、100%EtOH(5分;2倍)、透明化剤(5分;3倍)。すべての溶液、特に100%EtOHおよび透明化剤を頻繁に交換して、切片が無水のままになるようにします。
   注:50%のEtOHステップを経る必要はありません。ゴルジ体含浸が十分なコントラストを提供するため、細胞の可視化に対比染色は必要ありません。他の清算エージェントの使用は、ここで使用されているものほど機能していません( 資料表を参照)。
5. 長さ60mmのガラス製カバースリップと豊富な量のマウント媒体を備えたカバースリップ。気泡ができるだけ少ないことを確認してください。必要に応じて、慎重にカバースリップを取り外し、やり直してください(数週間後にも行うことができます)。セクションを損傷しないように、これを非常にゆっくりと行います(大量の取り付け媒体のために行うことができます)。
   メモ: 大量の取り付け媒体はやや乱雑ですが、厚さ 100 μm のセクションを覆うのに十分な取り付け媒体を使用する必要があるため、依然として必要です。
6. カバースリップがセクションに 1 つだけ配置されるようにするには、プロセスの前にカバースリップを分離します。
7. カバーが滑ったら、無孔質紙の上に3〜5日間平らにスライドさせ、固着を避けるために、特に初日の後、それらをわずかに動かします。3〜5日後、スライドをスライドホルダーに移し、理想的には、スライドを検査する前に少なくとも3週間乾燥させます。スライドを平らに保ち、気泡が形成される可能性を減らします。

4. 樹状突起脊椎密度の測定

1. 海馬のmPFCおよびCA1領域の両方の錐体ニューロンにおける樹状突起脊椎密度の分析のために、ステップ4.1.1(図2)で説明されているように、最も外側の二次基底樹状突起および最も外側の三次頂頂樹状突起を調べる。
   1. 樹状突起を選択し、画像解析プログラムを使用して樹状突起の長さを測定し、ハンドカウンターを使用して樹状突起上の棘を数え、棘の長さと数の両方を記録する。
2. 脳あたり6つの細胞(mPFC、CA1)を研究および分析する。前述のように、グループごとに最低6つの脳を定量化します ^7,8.分析のために以下の基準を満たすニューロンを選択してください:細胞体および樹状突起はよく含浸されています。樹状突起は隣接する細胞と区別可能であり、連続している。
3. 光学顕微鏡で手作業で棘を1000倍(油浸)で計数し、画像解析プログラムを用いて樹状長を測定します。背骨数を樹状突起の長さで割って背骨密度を計算し、データを棘数/10μm樹状突起として表します。
   注:脊椎のサブタイプと樹状突起構造を区別するためのはるかに洗練された方法がありますが、1000倍の光学顕微鏡で手で数えると、迅速な結果が得られ、さらなる調査が必要かどうかを判断できます。類似の樹状突起を一貫してサンプリングするためにあらゆる努力が払われていますが、厚さにはばらつきがあり、計数に影響を与える可能性があります。

結果

ラピッドゴルジ法を使用すると、分析する細胞がたくさんあるように、細胞が一貫してよく含浸されます。これは、分析に十分なデータを得るために実験をプールする必要があった以前の方法よりも顕著な改善です。したがって、より多くのサンプルを一度に処理することができ、脳は処理まで凍結保存することができます。海馬のCA1領域におけるゴルジ体含浸細胞の例を、 図3に低および高出力で示す。所与の領域における棘のカウントは、小さな標準誤差で一貫した結果をもたらす。これは、実験間で比較できるため、これも重要です。 図4 は、CA1およびmPFCの両方において環境濃縮(EE)後の思春期の雄および雌ラットにおいて、基底樹状脊椎密度が錐体細胞上で増加した実験を示す。簡単に説明すると、雄および雌のラットは、出生後日(PND)21で離乳し、対照群または濃縮群に割り当てた。EEグループはPND 24-42の濃縮ハウジングで2時間/日過ごし、対照グループはこの間通常のケージに収容された。EEは、両性の青年において、CA1およびmPFCの両方において基底樹状突...

ディスカッション

本プロトコルは、多くのセクションの迅速な同時処理を可能にするゴルジ体含浸の方法を記載している。これは、前述の⁵ つのより労働集約的な方法に対する改善であり、分析のために一貫して含浸ニューロンをもたらす。さらに、ゴルジ体含浸に使用される有毒化学物質への暴露が少なくなります。このプロセスの最も困難な部分は、スライド上でセクションを平坦にすることですが、これにはかなりの練習が必要です。凍結スプレーを使用してすべてをできるだけ冷たく保つことが不可欠です。

スライドが乾燥して分析が可能になったら、カウントするセルの選択に一貫性を持たせることが非常に重要です。海馬錐体細胞はCA1から選択される。いくつかのサブパートを有するmPFCのために、脳辺縁系皮質からの錐体細胞が使用される。理由は明らかではないが、mPFC中のより少ない細胞が海馬のCA1領域よりも染色される。さらに、物流上の理由からすべてのセクションを一緒に処理できない場合に実験を組み合わせることができます。一貫性を保つために、同じユーザーが特定のセルのセットを数える必要があります。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
段ボールスライドトレイ	フィッシャーサイエンティフィック	12-587-10
カバースリップ 24 x 60mm	フィッシャーサイエンティフィック	12-545-M
FD ラピッドゴルジステインキット	FDニューロテクノロジー	PK 401	暗闇の中でRTで数ヶ月間安定しています。ゴルジ染色キット
凍結スプレー	フィッシャーサイエンティフィック	23-022524
HISTO-CLEAR	フィッシャーサイエンティフィック	50-899-90147	クリアリング剤
NCSS ソフトウェア	米国ユタ州
パーマウント	フィッシャーサイエンティフィック	SP-15-100	封入剤
スーパーフロストプラス 顕微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィック	12-550-15
Tissue Tek CTYO OCT コンパウンド	Fisher Scientific	14-373-65	クライオスタットチャックにブレインを取り付けるために使用