3Dバイオプリンティングのための脂肪由来幹細胞スフェロイドの大規模自動生産

サマリー

ここでは、自動ピペッティングシステムを使用して細胞懸濁液を播種し、スフェロイドのサイズと形状の均質性を確保する脂肪由来間質/幹細胞(ASC)スフェロイドの大規模生産について説明します。これらのASCスフェロイドは、3Dバイオプリンティングアプローチのビルディングブロックとして使用できます。

要約

脂肪由来間質/幹細胞(ASC)は、間葉系間質/幹細胞の古典的な供給源として認識されているヒト皮下脂肪組織の間質血管画分に見られる細胞の亜集団である。足場ベースの組織工学的アプローチのためのASCを用いた多くの研究が発表されており、主に生理活性足場に播種した後のこれらの細胞の挙動を調査した。しかし、足場ベースのアプローチの限界を克服するために、主にスフェロイドを使用して、イン ビトロ および インビボで組織を設計するための足場フリーアプローチが出現しています。

回転楕円体は、自己組織化プロセスによって形成される3Dマイクロ組織である。それらは、主に細胞間および細胞対細胞間マトリックス相互作用の倍率のために、天然組織のアーキテクチャおよび微小環境をよりよく模倣することができる。最近、スフェロイドは主に疾患モデル、薬物スクリーニング研究、および3Dバイオプリンティングのビルディングブロックとして探求されています。しかし、3Dバイオプリンティングアプローチでは、複雑な組織および臓器モデルをバイオファブリケーションするために、サイズと形状が均質な多数の回転楕円体が必要です。さらに、スフェロイドが自動的に生成される場合、微生物学的汚染の可能性はほとんどなく、方法の再現性が向上します。

スフェロイドの大規模生産は、3Dバイオプリンティングプロセスで継続し、バイオリアクター内の組織構築物の完全な成熟で完了するバイオファブリケーションラインを開発するための最初の必須ステップと考えられています。しかし、ASCスフェロイドの大規模な生産を調査した研究の数は、ASCスフェロイドを3Dバイオプリンティングのビルディングブロックとして使用した研究の数とともに、まだ少ないです。したがって、本稿は、ASCスフェロイドを3Dバイオプリンティングアプローチのビルディングブロックとして広げる非接着マイクロモールドヒドロゲル技術を用いたASCスフェロイドの大規模生産を示すことを目的とする。

概要

回転楕円体は、組織工学における足場のないアプローチと考えられている。ASCは、自己組織化プロセスによって回転楕円体を形成することができる。回転楕円体の3Dマイクロアーキテクチャは、複数の系統^への分化能力を含むASCの再生可能性を高めます^1,2,3。この研究グループは、軟骨および骨^{組織工学のための}ASCスフェロイド^4,5,6に取り組んできました。さらに重要なことに、スフェロイドは、主にその融合能力のために、組織および器官のバイオファブリケーションにおけるビルディングブロックと考えられている。

組織形成のためのスフェロイドの使用は、(1)それらのバイオファブリケーションのための標準化されたスケーラブルなロボット法の開発⁷、(2)組織スフェロイド8の系統的表現型^決定、(3)3D組織の組み立てのための方法の開発⁹の3つの主要なポイントに依存する。これらのスフェロイドは、異なる細胞型で形成することができ、吊り下げドロップ、再凝集、マイクロ流体、およびマイクロモールド⁸、^9、10を含む様々な方法を介して得ることができる。これらの方法の各々は、スフェロイドのサイズおよび形状の均質性、形成後のスフェロイドの回収、生成されるスフェロイドの数、プロセスの自動化、労働強度、およびコスト¹¹に関連する長所および短所を有する。

マイクロモールド法では、細胞は重力のためにマイクロモールドの底部に分配され、堆積される。非接着性ヒドロゲルは、細胞が底部に接着することを許さず、細胞間相互作用は、後退^8,12当たりの単一のスフェロイドの形成をもたらす。このバイオファブリケーション方法は、均質で制御されたサイズのスフェロイドを生成し、最小限の労力で時間効率の高い方法で大規模生産のためにロボット化することができ、組織スフェロイドのバイオファブリケーションの設計において優れた費用対効果 - 重要な要素を有する^7,8。この方法は、任意の細胞系譜のスフェロイドの形成に適用して、予測可能、最適、および制御可能な特性を有する新しい組織型を調製することができる⁸。

バイオファブリケーションは、「構造組織を有する生物学的に機能的な製品の自動生成...」¹³と定義されています。したがって、スフェロイドの自動生産は、3Dバイオプリンティングプロセスを継続し、スフェロイド融合によるバイオプリント組織の完全な成熟で終了するバイオファブリケーションラインを開発するための最初の必須ステップと考えられています。この研究では、ASCスフェロイドバイオファブリケーションのスケーラビリティを向上させるために、自動ピペッティングシステムを使用して細胞懸濁液を播種し、スフェロイドのサイズと形状の均質性を確保します。この論文は、より複雑な組織モデルをバイオファブリケーションするための3Dバイオプリンティングアプローチに必要な多数の(数千)スフェロイドを生成することが可能であったことを示している。

プロトコル

この研究で使用されたASCは、ブラジルのリオデジャネイロ連邦大学クレメンティーノ・フラガ・フィーリョ大学病院の研究倫理委員会(25818719.4.0000.5257)によると、健康なヒトドナーから以前に単離され、凍結保存されていた14。この研究で使用されたすべての材料と機器の詳細については、材料の表を参照してください。

1. 通路3におけるASC単層のトリプシン処理

1. ASCsの単層を80%コンフルエントで入れたフラスコに組織培養175cm2を開き、上清を捨てた。
2. 7 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS、0.01 M)を加え、単層を2回洗浄する。次に、液体を捨てる。
3. 5 mL の 0.125% トリプシンを 0.78 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) と共に加えます。次に、37°Cで5分間インキュベートする。
4. 組織培養175cm2フラスコに10%ウシ胎児血清(FBS)を含む10mLの低グルコースダルベッコ改変イーグル培地(DMEM LOW)を加え、細胞懸濁液を10mLの血清学的ピペットでよく混合する。
5. 10 mLの血清学的ピペットで細胞懸濁液を回収し、50 mLの遠沈管に移します。次に、400× g で5分間遠心分離し、ASCsのペレットを得た。細胞ペレットを10%FBSを含むDMEM LOW を用いて再懸濁する。
6. トリパン排除による細胞カウントを行う。
7. カウント後、別の15 mL遠沈管に合計1 ×¹⁰⁶ ASCを採取し、非付着性ヒドロゲルでマイクロ成形された81の凹みに播種します(ここでは合計10,000細胞/mLを播種します)。マイクロモールド非付着性ヒドロゲルを256回播種するには、合計5×^105ASC を遠沈管に入れます(ここでは合計2,500細胞/ mLを播種します)。

2. マイクロモールド非付着性アガロースヒドロゲル作製

1. 超純水中の0.9%NaCl中の2%超高純度アガロースの滅菌溶液50mLを調製する。この溶液をオートクレーブで121°Cで30分間処理する。
2. 81または256個の円形凹部を含むシリコーンモールドの中央に、滅菌2%超高純度アガロース溶液500μLを加える。
3. 40分後、シリコーン型から超高純度アガロースを型外し、12穴プラスチックプレートのウェルに入れます。
4. マイクロモールドアガロースと共にウェルに2mLのDMEM LOW を加え、ASCを播種する前に、5%CO2雰囲気中で37°Cのインキュベーター内で少なくとも₁₂ 時間インキュベートする。

3. 自動ピペッティングシステムを用いたASCスフェロイドのバイオファブリケーション

1. 次の点を確認してください。
   1. 層流がオンになっているかどうか、およびキャビネットのエアフローが正しく機能しているかどうかを確認します。
   2. 機器が正しい電圧に接続されているかどうかを確認します。
   3. タブレットが機器に接続されているかどうかを確認します。
   4. キャビネット保護ガラスの高さが、機器のセンサーマーキングと同じ高さにあるかどうかを確認します。
2. 機器の左側にある オン/オフ ボタンを押し、タブレットと機器が起動するのを待ちます。
3. チップボックス、遠沈管用ラック、およびマイクロモールドアガロースヒドロゲルを含むプレートを装置のワークスペースに配置します。
4. ソフトウェアを開いたタブレットで、まず Labwareエディタをクリックします。
5. 仮想作業台をセットアップし、ピペット、チップボックス、プラスチックチューブ用ラック、プレートの位置を選択します。
   メモ: 仮想作業台は、機器内のアクセサリの物理的な位置を表す必要があります。
6. [生成に切り替え] ボタンをクリックして、実験中に機器が実行するパラメーター (ステップ 3.10 を参照) とコマンドを含めます。ツールバーとプロデュースリストがソフトウェアで開くのを待ちます。
7. 最初に、コマンドを示すために、ピペット化するサンプルの数を含め、それを 「生成リスト」にドラッグします。
   注:サンプル数は、マイクロモールドの中央に播種されるASC懸濁液を含むプラスチック遠心分離管の数です。
8. サンプル数を入力したら、ソフトウェアの サンプル転送 コマンドボタンをクリックして、ASC懸濁液をマイクロモールドを含む12ウェルプレートのウェルに移し、 生産リストにドラッグします。
9. [プロパティ]をクリックして、サンプルを移送する装置の開始位置と終了位置を設定します。
10. ソフトウェアが[作業テーブル]ページに戻るのを待ちます。[オプション]ボタンをクリックして、ASCの自動シードのためのパラメータを設定します:i)15.4 ^s-1の吸引速度。ii)1 ^s-1の分配速度;iii)0ミリ秒のブロー遅延。iv)15.4 ^s-1のブロー速度。v)100%の初期ストローク。標準液体タイプとして水を選択します。
11. ASCを混合して均質な懸濁液を得るためのパラメータを設定する:i)サイクル数5;ii)6.5 ^s-1の速度;iii)300μLの容量。
12. パラメーターを設定した後、生産リストに 40 分の時間を追加します。
    メモ:この時間は、ASCサスペンションがマイクロモールドの底部でデカントするのを待つために必要です。
13. 生産リストには、スフェロイド培養培地をプレートの対応するウェルに移すための試薬移送オプションを含めます。
14. 手順 3.9 ~ 3.11 を繰り返して、スフェロイド培養培地を移すための位置とパラメータの設定を設定します。
15. ソフトウェアのトップバーにチェックマークが付いたボタンをクリックして、プログラミングエラーがないことを確認します。
16. ソフトウェアのトップバーにある [再生 ]ボタン(三角形の記号付き)をクリックして、プログラムを起動します。
17. プログラムどおりに機器を起動し、終了したことを示す音が鳴るのを待ちます。
18. 12ウェルプレートを集め、スフェロイドが完全に形成されコンパクトになるように、37°C、5%_CO2 のインキュベーター内で少なくとも18時間インキュベートします。
19. 分析のために培養の1、3、および7日後にスフェロイドを手動で収穫する。マイクロピペットで培地を手動で洗い流し、マイクロモールド非付着性アガロースヒドロゲルからスフェロイドを遊離させる。
20. 5分後、顕微鏡下でスフェロイドがマイクロモールド非付着性アガロースヒドロゲルから完全に放出されるかどうかを決定する。
21. マイクロピペットを使用して手動でスフェロイドを収集し、15mLの遠沈管に移します。
22. 回転楕円体を0.01M PBSで少なくとも2回洗浄する。生存率を評価し、新鮮な回転楕円体サンプルに対して生体力学的分析を実行します。形態解析(組織学)のために、スフェロイドサンプルをPBS中の4%パラホルムアルデヒド中で2〜8°Cで少なくとも18時間インキュベートする。

結果

自動ピペットシステムは、ASC細胞懸濁液を1つの12ウェルプレートの12ウェルに15分で播種することができる。81マイクロモールド非接着ヒドロゲルを使用すると、プロトコルの最後に972個のスフェロイドが生成されます。256マイクロモールド非接着ヒドロゲルを使用すると、プロトコルの最後に3,072個のスフェロイドが生成されます。ASCスフェロイドを、そのサイズおよび形状の均質性について分析した。81回の後退を伴うマイクロモールドからのASCスフェロイドは、256回の後退を有するマイクロモールドのASCスフェロイドとは対照的に、培養期間中に均質な直径を示した(図1C,D)。最小直径と最大直径の比(真球度)は、81および256の不況を有するマイクロモールドのASC回転楕円体において1に近かった(図1E、F)。生存率、形態、および力(図2)解析の結果は、ASC回転楕円体の成功した大規模生産の証拠を提供...

ディスカッション

この論文では、自動ピペットシステムを使用したASCスフェロイドの大規模生成について説明します。このプロトコルの重要なステップは、ピペッティングのための細胞懸濁液の正しい量、速度、および距離を保証するためにソフトウェアを正確にセットアップすることです。プロトコールに記載されたパラメータは、マイクロモールドされた非付着性ヒドロゲルを含む12ウェルプレートのウェルへのASC細胞懸濁液の分配を最適化するための多数の試行の後に決定された。最適化は、スフェロイドの直径および真球度を測定することによって評価した。マイクロモールド非接着ヒドロゲルの面積および高さを用いて、細胞懸濁液を分配する理想的な速度を計算した。細胞懸濁液が異なる分配速度で装置によって播種される場合、これはスフェロイドの形成に直接影響する。したがって、これらは機器での試行後に最適化されるべき重要なパラメータです。このプロトコルにはいくつかの制限があります。マイクロモールド内の非付着性ヒドロゲル中のASCsの播種のみを自動化することができ、続いて細胞培養培地を添加することができる。システムの機能は、機器とソフトウェアのバージョンによって制限されます。しかし、この再現可能なアプローチの主...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
12ウェルプラスチックプレート	Corning	3512
50 mL 遠心分離管	Corning	CLS430828
EpMotion 5070	Eppendorf	5070000282
epT.I.P.S.Motion	Eppendorf	30015231
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)	Invitrogen	15576028
胎児ウシ血清 (FBS)	Gibco	10082147
低グルコース ダルベッコ修正イーグル培地 (DMEM LOW)	Gibco	31600034
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold スフェロイド - 16 x 16 アレイ	シグマ
MicroTissues 3D ペトリ皿マイクロモールドスフェロイド - 9 x 9 アレイ	シグマ	Z764019
リン酸生理食塩水バッファー (PBS)	シグマ	806552
塩化ナトリウム (NaCl)	シグマ	S8776
組織培養フラスコ	コーニング	430720U
トリパン	ロンザ	17-942E
トリプシン	Gibco	27250018
超高純度アガロー	ス Invitrogen	16500100

Z764000