このプロトコルは、植物の根に土壌媒介微生物を接種するための戦略の詳細な要約を提示する。真菌 Verticillium longisporum および Verticillium dahliaeについて例示された、3つの異なる根感染系が記載されている。潜在的なアプリケーションと可能なダウンストリーム解析が強調表示され、各システムについて長所または短所が議論されます。
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この記事について
サマリー
要約
根圏には、植物の根が常に挑戦されている非常に複雑な微生物群集があります。根は多種多様な微生物と密接に接触しているが、土壌媒介相互作用に関する研究は地上の臓器で行われている研究にはまだ遅れをとっている。モデル植物をモデル根病原体に感染させるためのいくつかの接種戦略が文献に記載されているが、包括的な方法論的概要を得ることは依然として困難である。この問題に対処するために、根と微生物の相互作用の生物学への洞察を得るために適用することができる3つの異なる根接種システムが正確に記述されている。説明のために、 Verticillium 種(すなわち、 V. longisporum および V. dahliae)を根侵入モデル病原体として使用した。しかし、この方法は、病原性および有益な他の根コロニー形成微生物に容易に適合させることができる。植物の木部に定着することにより、 バーティシリウム 属などの維管束性土壌媒介性真菌は独特の生活様式を示す。根の侵入後、それらは木部血管 を介して 無作為に広がり、芽に達し、そして病気の症状を誘発する。モデル宿主として、 シロイヌナズナ、経済的に重要な油糧種子菜種(アブラナナ)、トマト(Solanum lycopersicum)の3つの代表的な植物種が選ばれた。ステップバイステップのプロトコルが与えられます。病原性アッセイ、マーカー遺伝子の転写解析、およびレポーター構築物による独立した確認の代表的な結果が示されている。さらに、各接種系の長所と短所を徹底的に議論する。これらの実証済みのプロトコルは、根と微生物の相互作用に関する研究上の質問に対するアプローチを提供するのに役立ちます。植物が土壌中の微生物にどのように対処するかを知ることは、農業を改善するための新しい戦略を開発するために不可欠です。
概要
天然土壌には、植物にとって中性、有害、または有益な驚くほど多くの微生物が生息しています1。多くの植物病原菌は土壌に生着し、根を囲み、地下の器官を攻撃する。これらの微生物は、真菌、卵菌類、細菌、線虫、昆虫、およびいくつかのウイルス1,2の多種多様なクレードに属する。環境条件が感染に有利になると、影響を受けやすい植物は病気になり、作物収量は減少します。地球温暖化や極端な気象などの気候変動の影響により、土壌に媒介する植物病原菌の割合が増加します3。したがって、これらの破壊的な微生物と、それらが食料や飼料の生産だけでなく、自然の生態系に与える影響を研究することはますます重要になります。さらに、土壌中には根と密接に相互作用し、植物の成長、発達、免疫を促進する微生物の相互主義者がいます。病原体に直面したとき、植物は病原体を抑制することによって宿主の生存をサポートできる根圏内の特定の敵を積極的に募集することができる4、5、6、7。しかし、有益な根と微生物の相互作用に関与する機構的な....
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プロトコル
1. 真菌培養用培地および植物接種システム
- 液体ジャガイモデキストロースブロス(PDB):熱安定性フラスコ内の超純水中に21g/L PDBを調製する。
- 液体チャペックデキストロースブロス(CDB):熱安定性フラスコ内の超純水中に42g / L CDBを調製する。
- シャーレ接種システム用培地:超純水中に1.5g/Lのムラシゲ培地とスクーグ培地(MS)と8g/L寒天を入れた熱安定性フラスコを用意する。
注:この培地中の砂糖は、接種後に過剰な真菌の増殖につながるため、避けてください。 - プラスチックカップベースの接種システム用培地:超純水中で4.4 g/L MS、0.2 g/L MgSO4、1 g/L KNO3、0.5 g/L 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、および6.0 g/L寒天を含む熱安定性フラスコを調製し、5 M KOHでpHを5.7に調整する。
注:この培地中の砂糖は、接種後に過剰な真菌の増殖につながるため、避けてください。 - 1/4 MS 培地: 超純水に 1.2 g/L MS を調製します。
- オートクレーブを使用して、上記のすべての溶液を滅菌します。ガラスフラスコをバスケットに入れ、蓋を閉じ、121°C、98.9kPaで15分間殺菌する。
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結果
プロトコールに従って、植物を栽培し、 V. longisporum ( Vl4325株)または V. dahliae (単離JR218)を接種した。有効性を証明し、特定のプロトコルのいくつかの機能を強調するために、さまざまなシナリオが設計されました。代表的な成果が示されています。
抗菌性インドール - グルコシノレート(IG)生合成に関与する遺伝子の発現誘導は、バーティシリウム感染の評価のための信頼できる指標である17、19、26。シロイヌナズナにおいて、MYB51(MYBドメインタンパク質51;AT1G18570)は、IG生合成に必要な遺伝子の活性化に関与する転写因子をコードする
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ディスカッション
土壌媒介性植物病原体1による収量損失が大きいため、農業戦略や作物品種の改善が求められています。土壌媒介性疾患の病因に関する限られた洞察は、より抵抗性の高い植物の発達を妨げる。根底にある病態メカニズムを探求する必要があり、そのためには堅牢な方法論的プラットフォームが必要である。報告された接種手順は、根−微生物相互作用における多因子事象が、異なる系を組み合わせることによって十分に解剖され得ることを示している19。上記のプロトコルは、この分野に不慣れな専門家と研究者の両方に日常的なワークフローを提供することを目的としています。取り扱いは簡単で、独立した複製が可能で、必要な技術機器は標準的な植物科学研究所に存在します。
初期のバーティシリウム感染事象(接種後6dpiまでの時間)は、ペトリ皿系において、後期事象(>21dpi)は土壌系において、およびカップ系において時間的にその間(4〜21dpi)で調べることができる。胞子をペトリ皿系の感染チャネルに加えた後、それらは根と直接接触.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もありません。
謝辞
著者らは、これらの方法に関する以前の研究についてティム・イヴェンとジャクリーン・コモレク、この研究に必要な機器とリソースを提供したヴォルフガング・ドレーゲ・レーザー(ドイツ、ヴュルツブルク大学薬学部)、ヴォルフガング・ドレーゲ・レーザーとフィリップ・クライス(どちらもヴュルツブルク大学)のグループが原稿の批判的な校正を行ったことを認めている。この研究は「Deutsche Forschungsgemeinschaft」(DFG, DR273/15-1,2)の支援を受けた。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 寒天(Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | すべてのシステムには、葉 |
| Arabidopsis thaliana野生型 | NASCストック | Col-0(N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | ソフトウェア |
| Brassica napus 野生型 | Floerl et al., 2008 | rapid-cycling rape | genome ACaacc |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | |
| Chicanery flask 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Erlenmeyer フラスコ 4 バッフル付き |
| Collection tubes 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Czapek Dextrose Broth中 | Duchefa | C1714 | |
| デジタルカメラ | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Desiccator) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | 塩素ガスを保持する蓋付きシール |
| 蛍光顕微鏡 | ライ | カ TCS SP5 II | |
| HCl | カール・ロス | P074.3 | |
| KNO3 | カール・ロス | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | 不織布テープ 2.5 cm x 9.2 |
| m MES (2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸) | Carl Roth | 4256.2 | フグ ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | 硫酸マグネシウム-七水和物 |
| 村重&Skoogミディアム(MS) | Duchefa | M0222 | MS、ビタミン |
| NaClO | ロス | 9062.1 | |
| シバル成長室CLF | 植物気候社 | AR-66L2 | |
| レ | Sarstedt | 82.1473.001 | サイズØを含む。xH:92回;16 mm |
| プラスチックカップ(500 mL、透明) | Pro-pac、salad boxx | 5070 | サイズ:108 × 81 × 102 mm |
| プリーツセルロース | フィルターHartenstein | FF12 | 粒子保持レベル8–12 μm |
| poly klima growth chamber | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| ポテト デキストロース ブロス ミディアム | SIGMA Aldrich | P6685 | for microbiology |
| Pots | Pöppelmann GmbH | TO 7 D or TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm |
| PromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (i.e. 3xmVenus with NLS) |
| 反応チューブ 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Performance tested |
| ロータリー(軌道)シェーカー | Edmund Bühler | SM 30 Cコントロール | |
| サンド(鳥砂) | ペットビストロ、Müller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum 野生型 | Chavarro-Carrero et al., 2021 | Type: Moneymaker | |
| Thoma cell counting chamber | Marienfeld | 642710 | depth 0.020 mm; 0.0025 mm2 |
| Ultrapure water (Milli-Q精製水) | MERK | IQ 7003/7005 | water obtained after purification |
| Verticillium dahliae | see Reusche et al., 2014 | isolate JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise and von Tiedemann, 2002 | strain Vl43 |
参考文献
- Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
- Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J.
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