DNAファイバーアッセイを用いたヒト細胞における複製後ギャップの蓄積と修復の検出

Davi J. Martins; Stephanie Tirman; Annabel Quinet; Carlos F. M. Menck

doi:10.3791/63448

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方法論記事

DNAファイバーアッセイを用いたヒト細胞における複製後ギャップの蓄積と修復の検出

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DOI:

10.3791/63448

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2022年2月3日

Davi J. Martins^*¹ , Stephanie Tirman^*² , Annabel Quinet² , Carlos F. M. Menck¹

¹Department of Microbiology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, ²Division of Oncology, Department of Internal Medicine, Washington University in St. Louis

^* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、病変誘導後のDNA複製における一本鎖DNAギャップを調べるためのDNAファイバーアッセイの2つの改変について説明する。S1ファイバーアッセイは、ssDNA特異的S1エンドヌクレアーゼを使用して複製後ギャップの検出を可能にし、ギャップ充填アッセイはギャップ修復の視覚化および定量を可能にする。

要約

DNAファイバーアッセイは、ヒト細胞におけるDNA合成中に組み込まれるヌクレオチド類似体の免疫検出に基づいて、複製フォークダイナミクスを分析するための簡単で堅牢な方法です。しかし、この手法の分解能は数千キロベースに制限されています。その結果、複製後の一本鎖DNA(ssDNA)ギャップは数百塩基ほど小さく、標準的なアッセイでは検出できません。ここでは、ssDNAを特異的に切断する酵素であるS1ヌクレアーゼを利用するDNAファイバーアッセイの改変版について説明する。複製後のssDNAギャップの存在下で、S1ヌクレアーゼはギャップを標的にして切断し、進行中のフォーク上のssDNAギャップの読み出しとして使用できるより短いトラクトを生成する。これらの複製後のssDNAギャップは、損傷したDNAが不連続に複製されるときに形成される。それらは、ゲノム複製から結合されていないメカニズム を介して 、ギャップ充填または複製後修復として知られるプロセスで修復することができる。ギャップ充填機構はS相とは無関係にDNA合成を伴うため、DNAファイバー標識スキームの変化を利用してギャップ充填事象を監視することもできます。全体として、DNAファイバーアッセイのこれらの改変は、複製後のギャップがヒト細胞のゲノムにどのように形成され、埋められるかを理解するための強力な戦略です。

概要

精液研究は、細菌¹およびヒト細胞^2,3におけるDNA損傷剤による処理時に、複製後一本鎖(ssDNA)ギャップの蓄積の証拠を提供している。損傷したDNAテンプレートの複製中、DNA合成機構は、特異的な病変転移合成DNAポリメラーゼを採用することによって、またはテンプレート切り替え機構を介して病変をバイパスすることができる。あるいは、レプリソームはまた、ssDNAギャップを残して病変を単にスキップし、後で修復することもできる。より最近では、遺伝毒性物質による治療が、電子顕微鏡法を利用して複製中間体の特異的構造を可視化することによって、真核生物のssDNAギャップをもたらすことが明らかに示された^研究4。複製後ギャップのこれらの領域の形成は、DNA複製の半不連続モードの単純な結果であると最初に提案された²。この場合、遅れ鎖上の病変は岡崎断片の伸長を遮ることができるが、フォークの進行は次の岡崎断片によって自然に救助され、ssDNAギャップが残る。しかし、さらなる研究は、細菌⁵で最初に示されたように、先行鎖上のギャップの形成も可能であることを実証した。真核生物において、プリマーゼ活性を有するユニークなDNAポリメラーゼであるPRIMPOL....