方法論記事

蛍光標識タンパク質と人工リン脂質マイクロベシクルの定量的フローサイトメトリーによる相互作用の解析

DOI：

10.3791/63459

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2022年4月6日

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1Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, 2National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology named after Dmitry Rogachev, 3Faculty of Physics, Lomonosov Moscow State University, 4Faculty of Biological and Medical Physics, Moscow Institute of Physics and Technology

この記事について

サマリー

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ここでは、タンパク質と細胞または微小小胞の膜との相互作用を特徴付けるための一連の方法について説明する。

要約

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人体では、免疫反応や血液凝固に関わる主要な生理反応のほとんどが細胞の膜上で進行します。任意の膜依存性反応における重要な第1段階は、リン脂質膜上のタンパク質の結合である。タンパク質と脂質膜との相互作用を研究するアプローチは、蛍光標識タンパク質およびフローサイトメトリーを用いて開発されている。この方法は、生細胞および天然または人工リン脂質小胞を用いたタンパク質膜相互作用の研究を可能にする。この方法の利点は、試薬および装置の単純さと可用性です。この方法では、蛍光色素を用いてタンパク質を標識する。しかしながら、自作および市販の両方の、蛍光標識タンパク質が使用可能である。蛍光色素とのコンジュゲーション後、タンパク質をリン脂質膜の供給源(微小小胞または細胞)と共にインキュベートし、サンプルをフローサイトメトリーによって分析する。得られたデータは、動力学定数および平衡Kdを計算するために使用することができる。さらに、特別な較正ビーズを用いてリン脂質膜上のタンパク質結合部位のおおよその数を推定することができる。

概要

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生体膜は、動物細胞の内部内容物と細胞外空間を分離する。膜はまた、細胞のライフサイクルおよび細胞小器官の間に形成された微小小胞を囲むことに留意されたい。細胞膜は、主に脂質およびタンパク質からなる。膜タンパク質は、シグナル伝達、構造的、輸送的、および接着機能を実行する。しかしながら、脂質二重層は、動物細胞と細胞外空間との相互関係にも必須である。本稿では、外部タンパク質と脂質膜との末梢相互作用を研究する方法を提案する。

動物細胞の外膜層で起こる反応の最も顕著な例は、血液凝固反応である。血液凝固の重要な特徴は、すべての主要な反応が、血漿中ではなく、これらの細胞から生じる細胞および微小小胞のリン脂質膜上で進行することである1,2,3。膜依存性反応には、凝固を開始するプロセス(組織因子の関与を伴う内皮下、炎症を起こした内皮、または活性化免疫細胞の細胞膜上)、因子IX、X、プロトロンビンの主なカスケード活性化のすべての反応が含まれる。トロンビンによる第XI因子の活性化(活性化血小板、赤血球、リポタンパク質、および微小小胞の膜上);プロテインC経路の反応;凝固酵素の不活性化(トロンボモジュリン補因子、内皮タンパク質C受容体、ヘパラン硫酸の関与を伴う内皮細胞の膜上);接触経路反応(未知の補因子の関与を伴う血小....

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プロトコル

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1. 蛍光タンパク質標識

  1. 材料準備
    1. 1 M 炭酸水素ナトリウム緩衝液、pH 9.0 を用意し、4 °Cで保存し、1 週間以内に使用してください。
    2. 使用直前に1.5 Mヒドロキシルアミン塩酸塩緩衝液(pH 8.5)を調製する。
    3. ジメチルスルホキシド中の蛍光色素( 材料表参照)の10mg/mL溶液を調製する。
      注:この溶液は、暗闇の中で-20°Cで1ヶ月間保存することができます。
    4. 精製抗体または他のタンパク質の溶液を1〜10mg / mLで調製する。
      メモ: アンモニウムイオンまたは第一級アミンを含むバッファーは避けてください。透析により、トリスまたはグリセロールを含む緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で置き換える。アジ化ナトリウム(≤3 mM)もチメロサール(≤1 mM)も共役反応に大きく影響しません。
    5. タンパク質精製のためにゲル濾過培地( 材料表を参照)をPBS中で室温で一晩、または60°Cで2時間インキュベートする。 ゲルろ過媒体を 0.2 μm メンブレンを備えたスピンカラムに塗布します。
  2. Eq(1)を用いて標識するタンパク質の濃度に応じて各反応に使用する反応性色素の量を算出する。

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結果

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本明細書に記載のフローサイトメトリー法は、活性化血小板への血漿凝固タンパク質の結合を特徴付けるために使用される。また、リン脂質小胞PS:PC 20:80をモデル系として適用した。本稿では、主に人工リン脂質小胞を例に挙げる。サイトメーターのパラメータ、特に、光電子増倍管(PMT)電圧および補償は、特定の装置、研究対象(細胞、人工または天然の微小小胞)、および使用される色素ごとに選択されなければならない。図1B、Cは、組み込まれた親油性蛍光色素DiIC16(3)を用いて〜1μmの大きさの人工リン脂質小胞をゲーティングする例を示す。大きな小胞サイズおよび親油性蛍光色素は、サイトメーターを使用して小胞を検出するのに役立ちました。ゲートは、同じサイズの人工脂質小胞を含むが蛍光色素を含まないサンプルに基づいて設定した(図1B)。このゲート内のイベントのみが解析で使用されました。

小胞へのタンパク質結合の動態を第1段階で分析した。このためのサン.......

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ディスカッション

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提案された方法は、様々な供給源および組成物からのタンパク質とリン脂質膜との相互作用の大まかな特徴付けに適合させることができる。ここで説明する定量的フローサイトメトリーは、いくつかのパラメータで表面プラズモン共鳴(SPR)を認めています。特に、感度と時間分解能が低く、タンパク質の蛍光標識が必要です。蛍光標識は、多くのタンパク質の立体構造の変化および活性の喪失につながる可能性があるため、慎重な制御が必要です。ただし、この手法には他の手法よりも大きな利点があります。この方法は、SPRを使用して容易に実施されない天然の細胞膜とのタンパク質の相互作用を探索する機会を提供する。さらに、このアプローチは、膜表面上のタンパク質結合部位の数の推定を可能にし、いくつかの分析タスクにとって効率的であり得る。

市販のビーズは、いくつかの蛍光色素が結合部位をカウントするために入手可能である。しかしながら、多くの広く使用されている染料にはそのようなビーズはない。したがって、自作のビーズはこれを解決する最良の方法です。他のすべての実験と同じ細胞をこれらのビーズを調製するために使用した。しかし、ビーズは洗浄時に.......

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開示事項

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著者らは、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

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著者らは、ロシア科学財団の助成金20-74-00133によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
A23187Sigma AldrichC7522-10MG
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)サーモフィッシャーサイエンティフィックA37573蛍光色素
ジャガイモ由来アピラーゼSigma AldrichA2230
BD FACSCantoIIBD Bioscience
ウシ血清アルブミンVWR ライフサイエンス AMRESCOAm-O332-0.1
塩化カルシウム、無水、粉末、≥97%シグマAldrichC4901-100G
ケアリーエクリプス蛍光分光計Agilent
D-(+)-グルコースシグマAldrichG7528-1KG
DiIC16(3)(1,1'-ジヘキサデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩)サーモフィッシャーサイエンティフィックD384
DMSOシグマAldrichD8418
EDTA二ナトリウム塩VWRライフサイエンスAMRESCOAm-O105B-0.1
FACSDivaBDバイオサイエンスサイトメトリーデータ収集ソフトウェア
FlowJoTree Starデータ分析用サイトメーターソフトウェア
HEPESシグマアルドリッチH4034-500G
ヒューマンファクターX酵素研究HFX 1010
ヒドロキシルアミン塩酸塩Panreac141914.1209
L-&α;-ホスファチジルコリン(脳、ブタ)Avanti極性脂質840053P
L-&α;-ホスファチジルセリン(脳、ブタ)(ナトリウム塩)Avanti極性脂質840032P
塩化マグネシウムグマアルドリッチM8266-100G
ミニ押出機アバンティ極性脂質610020-1EA
OriginPro 8 SR4 v8.0951OriginLab Corporation統計ソフトウェア
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 錠剤、バイオテクノロジーグレードVWR ライフサイエンス AMRESCO97062-732
塩化カリウムSigma AldrichP9541-500G
プロスタグランジン E1ケイマン ケミカル13010
Sephadex G25GE HealthcareGE17-0033-01精製用ゲルろ過媒体
セファロースCL-2Bシグマ AldrichCL2B300-500ML血小板精製用ゲルろ過媒体
重炭酸ナトリウムコーニング61-065-RO
塩化ナトリウムSigma AldrichS3014-500G
リン酸ナトリウム 一塩基性シグマAldrichS3139-250G
Spin collumns with membrane 0.2 µmザルトリウスVS0171
エン酸三ナトリウム二水和物Sigma AldrichS1804-1KG
シタンパク質ク

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of hemostasis. Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).
  2. Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of thrombin generation. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, Suppl 1 32-38 (2006).
  3. Pa....

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