方法論記事

バソフェナントロリンベースの比色アッセイを用いた組織非ヘム鉄含有量の測定

DOI：

10.3791/63469

⸱

2022年1月31日

 , 
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2Basic and Clinical Research on Iron Biology, IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, 3Iron and Innate Immunity, IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, 4ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、動物組織中の非ヘム鉄含有量を測定するためのプロトコルが、ほとんどの実験室で容易に実施できる単純で十分に確立された比色アッセイを使用して提供される。

要約

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鉄は必須の微量栄養素です。鉄の過負荷と欠乏の両方がヒトにとって非常に有害であり、組織の鉄レベルは細かく調節されている。鉄過負荷または欠乏症の実験動物モデルの使用は、鉄恒常性の全身および細胞調節に関与するメカニズムの知識を進歩させるのに役立ってきた。動物組織における総鉄レベルの測定は、一般に、原子吸光分光法または非ヘム鉄とバソフェナントロリン試薬との反応に基づく比色アッセイを用いて行われる。長年にわたり、比色アッセイは、広範囲の動物組織における非ヘム鉄含有量の測定に使用されてきた。原子吸光分光法とは異なり、赤血球に含まれるヘモグロビンに由来するヘム鉄の寄与を除外する。さらに、高度な分析スキルや高価な機器を必要としないため、ほとんどのラボで簡単に実装できます。最後に、比色アッセイはキュベットベースにすることも、マイクロプレート形式に適合させることもできるため、サンプルスループットが向上します。本研究は、鉄過負荷または鉄欠乏症の様々な実験動物モデルにおける組織鉄レベルの変化の検出に適した十分に確立されたプロトコールを提供する。

概要

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鉄は必須微量栄養素であり、酸素輸送、エネルギー生産、DNA合成などの重要な生物学的プロセスに関与するタンパク質の機能に必要です。重要なことに、鉄の過剰と鉄欠乏の両方が人間の健康に非常に有害であり、組織の鉄レベルは細かく調節されています。異常な食事による鉄吸収、鉄欠乏食、反復輸血、慢性炎症は、世界中の何十億人もの人々に影響を与える鉄関連疾患の一般的な原因です1,2,3。

鉄の過負荷または欠乏症の実験動物モデルは、鉄の恒常性の全身および細胞調節に関与するメカニズムに関する我々の知識を進歩させるのに役立ってきた4。過去20年間に達成された実質的な進歩にもかかわらず、多くの重要な側面は依然としてとらえどころのないままです。今後数年間で、動物組織中の総鉄濃度の正確な測定は、鉄生物学分野の研究を進めるための重要なステップであり続けるでしょう。

ほとんどの研究室では、原子吸光分析法(AAS)、誘導結合プラズマ質量分析法(ICP-MS)、または非ヘム鉄とバソフェナントロリン試薬との反応に基づく比色アッセイのいずれかを使用して組織鉄を定量しています。後者は、50年以上前にトーランスとボスウェルによって記述された元の方法に基づいています5,6。この方法の変形は、その後、バソフェナントロリン7の代替としてフェロジンを使用して開発されたが、後者は文献の中で最も広く引用された発色試薬のままである。

選択方法は、多くの場合、利用可能な専門知識とインフラストラクチャによって異なります。AASおよびICP-MSはより感度が高いが、比色アッセイは、以下の重要な利点を提示するため、広く使用されている:i)赤血球に含まれるヘモグロビンに由来するヘム鉄の寄与を除外する。ii)高度な分析スキルや非常に高価な機器を必要としない。iii)元のキュベットベースのアッセイをマイクロプレート形式に適合させることができ、より高いサンプルスループットを可能にする。この研究で提示された比色法は、げっ歯類から魚やショウジョウバエまで、鉄過負荷または鉄欠乏症の様々な実験動物モデルにおける組織非ヘム鉄レベルの変化を定量化するために日常的に使用されている。ここでは、動物組織中の非ヘム鉄含有量を測定するためのプロトコルが、ほとんどの研究室が実装しやすいと感じるべき、シンプルで十分に確立された比色アッセイを使用して提供されています。

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プロトコル

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C57BL/6マウスは商業的に購入され、C57BL/6バックグラウンド8のヘプシジンヌル(Hamp1−/−)マウスはソフィー・ヴォーロン(フランス、コーチン研究所)からの親切な贈り物でした。動物は、特定の病原体のない条件下で、温度および光制御された環境下、標準的なげっ歯類のチャウおよび水への自由なアクセスで、i3S動物施設で飼育された。ヨーロッパのスズキ(Dicentrarchus labrax)は、商業養魚場から購入され、ICBAS動物施設で温度と光が制御された環境で飼育され、標準的なスズキ飼料を毎日自由に摂取しました。脊椎動物を含むすべての手順は、i3S動物倫理委員会と国家当局であるDireção-Geral de Alimentação e Veterinária(DGAV)によって承認されました。市販の試薬、機器、および動物に関する情報は、材料表に記載されています。

1. 溶液調製

メモ:すべての試薬と溶液を鉄を含まないガラス製品または使い捨てプラスチック製品で取り扱い、準備してください。金属実験材料(ステンレス製のヘラなど)は、鉄汚染の危険性があるため、試薬や溶液と接触させないでください。再利用可能なガラス製品に鉄がないことを確認してください。材料を適切な実験室用洗剤で30〜60分間洗浄し、脱イオン水ですすぎ、脱イオン水で1:3に希釈した37%硝酸溶液に一晩浸し、脱イオン水で再度すすぎ、乾燥させる。

  1. 酸混合物:ガラス瓶の37%塩酸82.2mLにトリクロロ酢酸10gを加え、十分に溶解し、脱イオン水で最終体積を100mLに調整する。使用前に振ってください。あるいは、組織消化のために37%塩酸のみを使用してください。
    注:この溶液は、暗褐色のガラス試薬ボトルに保管した場合、少なくとも2ヶ月間安定しています。
    警告: 塩酸およびトリクロロ酢酸は腐食性であり、濃縮された形態は有毒な酸性蒸気を放出します。酸を取り扱うときは、常に保護服、耐薬品性手袋、化学薬品飛沫ゴーグルを着用してください。それらを吸い込まないようにし、ヒュームフードの下で常に酸を処理してください。
  2. 飽和酢酸ナトリウム:ガラス瓶の脱イオン水400mLに無水酢酸ナトリウム228gを加え、室温で一晩撹拌する。溶液を休ませて1日沈殿させる。沈殿が起こらない場合は、少量の酢酸ナトリウムを加え続けます。溶液をガラス瓶に保管する。
  3. 色原体試薬:1mLの色原体試薬を調製するために、500μLのイオン交換水および10μLの濃縮(100%)チオグリコール酸に1mgの4,7-ジフェニル-1,10-フェナントロリンジスルホン酸二ナトリウム塩を加え、十分に溶解する。脱イオン水で最終容量を1mLにします。
    注:色原体試薬は必要なだけ準備してください。この溶液は、光から保護されると1ヶ月間安定しています。
  4. 作業色原体試薬(WCR):5倍量の飽和酢酸ナトリウムおよび5倍量の脱イオン水に1倍量の色原体試薬を加える。
    注:この溶液は、使用日に新しく調製する必要があります。
  5. ストック鉄標準溶液:20 mMストック鉄溶液を調製するには、5,480 μLの37%塩酸を含む250 mLメスフラスコに111.5 mgのカルボニル鉄粉を入れます。室温で一晩溶解させる(または沸騰水浴中でインキュベートする)。次いで、脱イオン水で溶液を最終容量100mLにする。
    注:標準ソリューションは、密閉された容器に保管すると無期限に保管できます。
  6. 作業鉄標準液(WISS):500 μLの脱イオン水に13.5 μLの37%塩酸を加えます。10 μLのストック鉄標準溶液を加え、脱イオン水(11.169 μgのFe/mL、200 μM、AASで測定)で最終容量を1 mLにします。
    注:作業溶液は、使用日に新しく準備する必要があります。

2. サンプル乾燥

  1. メスの刃で10〜100mgの重さの組織のサンプルを切断する。パラフィルムの小さな部分(フレッシュウェイト)の上に分析的/精密なバランスで正確に計量してください。
  2. プラスチックピンセットを使用して、組織片を24ウェルプレート(水分蒸発を可能にするために蓋を外した状態)に入れ、65°Cの標準インキュベーター上で48時間乾燥させます。
  3. あるいは、組織サンプルを乾燥させるために実験室用電子レンジ消化オーブンを使用する。プラスチックピンセットを使用して、計量したティッシュ片を鉄を含まないテフロンカップに入れ、電子レンジで乾燥させます。機器の取扱説明書に従って動作パラメータを設定します。
    注:参考として、特定の消化オーブン( 材料表を参照)を使用して肝臓サンプルを乾燥させるための運転パラメータを 表1に示す。
  4. プラスチックピンセットを使用して、乾燥した各組織片を分析/精密天秤内のパラフィルムの小さな部分の上に置き、正確に計量します(乾燥重量)。

3. サンプル酸性消化

  1. プラスチックピンセットを使用して、各乾燥組織片を1.5mLの微量遠心チューブに移す。
  2. 1mLの酸混合物を加え、微量遠心管を閉じる。組織を省略する以外は同じ方法で酸ブランクを作製する。
    警告: 酸混合物は腐食性があり、有毒な蒸気を放出します。酸混合物を取り扱うときは、保護服、耐薬品性手袋、化学薬品飛沫ゴーグルを着用してください。それを吸い込まないようにし、煙のフードの下で常にそれを処理してください。
  3. 微量遠心チューブをインキュベーター内で65°Cで20時間インキュベートすることによって組織を消化する。
  4. 室温まで冷却した後、プラスチックチップを取り付けたマイクロピペットを使用して、透明(黄色)酸抽出物(上清)500 μLを新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。透明な上清を得ることができない場合は、短い遠心分離スピンを行う。
    警告: 上清は酸性度が高いです。上清を取り扱うときは、保護服、耐薬品性手袋、化学薬品飛沫ゴーグルを着用してください。常にヒュームフードの下でそれらを処理してください。
    注:この時点で、酸抽出物は、比色アッセイに直ちに使用することも、後で使用するために-20°Cで凍結することもできます。凍結したサンプルを室温まで完全に解凍し、使用前に渦巻きます。

4. 発色

  1. 表 2 に示すように、1.5 mL マイクロ遠心チューブで色原体反応を調製するか、より高いスループットのために、平底の 96 ウェルの透明な未処理ポリスチレンマイクロプレートに直接準備します。すべての反応(酸ブランク、標準、およびサンプル)を少なくとも重複して調製する。
  2. 室温で15分間インキュベートする。

5. 吸光度読み取り

  1. サンプルの吸光度を分光光度計またはプレートリーダーで、脱イオン水基準に対して波長535nmで測定します。プレートは、蓋を開けて読み取ることも、ふたをして読むこともできます。蓋付きのケースでは、吸光度測定値との干渉を避けるために、測定の直前に蓋から酸蒸気が放出されたために発生した結露をすべて取り除きます。
    注:脱イオン水(基準)に対して読み取られた酸ブランクの光学吸光度は0.015未満でなければなりません。標準およびサンプルの光学吸光度は、0.100〜1.000の間でなければなりません。鉄含有量が非常に高いまたは非常に低いサンプルの場合、酸抽出物(上清)およびdiH2Oの体積を調整する必要があるかもしれません(表2):吸光度が1.0より大きい場合は、より少ないサンプル(上清)容量を使用してください。吸光度が0.1より低い場合は、より多くの量の上清を使用してください。サンプル量(Vsmp)は、各サンプルの組織鉄含有量を計算する際に考慮されます(ステップ6を参照)。

6. 組織鉄含有量の計算

  1. 非ヘム組織鉄含有量を次の式で計算します。
    組織鉄(μg/g乾燥組織)= figure-protocol-1
    AT = 被験試料の吸光度
    AB = 酸ブランクの吸光度
    AS = 標準時の吸光度
    Fes = WISS の鉄濃度 (μg Fe/mL)
    W = 乾燥組織の重量(g)
    Vsmp=サンプル容量(表2の上清の可変容量をmLに換算)
    Vf = 65°Cで一晩インキュベートした後の酸混合物の最終体積(酸体積+乾燥組織体積(mL単位)に相当;サンプル重量が有意に異ならない場合は、1mL≈一定体積と仮定する)
    Vstd=鉄標準容量(表2のWISSの体積をmLに換算)
    Vrv=最終反応量(表2中の全体積をmLに換算)

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結果

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キュベットと96ウェルマイクロプレートの比較
トーランスおよびBothwell5,6によって最初に記載されたバソフェナントロリン試薬との反応による組織非ヘム鉄の測定は、吸光度読み取りのための分光光度計の使用に依存している。したがって、色原体反応に使用される体積は、通常の分光光度計キュベットのサイズと互換性があります。本研究は、マイクロプレートリーダーでの吸光度測定のために、色原体反応を96ウェルマイクロプレート中で直接調製し、より少ない試薬量を必要とし、より高いスループットを可能にする方法適応を記載する。

両方のアプローチの感度を比較するために、最初に作動鉄標準溶液(WISS)の段階希釈液を調製し、表2に示すように、色原体反応を1.5mLチューブまたは96ウェルプレートのいずれかで組み立てた。吸光度は、分光光度計(キュベット付き)またはマイクロプレートリーダーでそれぞれ測定した。2つのアプロー...

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ディスカッション

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動物組織中の非ヘム鉄含有量の測定のためのプロトコルが、トーランスおよびBothwell5,6によって最初に記載されたバソフェナントロリンベースの比色アッセイの適応を用いて提供される。この方法の重要なステップは、組織サンプルの乾燥である。酸加水分解によるタンパク質変性および無機鉄の放出;還元剤チオグリコール酸の存在下での第二鉄(Fe3+)鉄の第一鉄状態(Fe2+)への還元、およびバソフェナントロリン試薬との反応(色原体反応);得られた鉄イオン/バソフェナントロリンピンク複合体の吸光度読み取り;組織鉄含有量の計算。

本研究は、アッセイ感度を損なうことなく、元のキュベットベースのプロトコルを96ウェルベースのフォーマットに適合させて、より高いスループットを実現する方法を示しています。特に、この適応は、1)マルチチャンネルピペットを使用して96ウェルプレートでより多くの色原体反応を同時に調製することができるため、大幅な時間の節約を...

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開示事項

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著者には利益相反はありません。

謝辞

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この研究は、プロジェクトUIDB/04293/2020の下で、FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P.を通じて国家基金によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
96ウェルUV透明プレートSarstedt82.1581.001
分析バランスカーンABJ 220-4M
無水酢酸ナトリウムメルク106268
バソフェナントロリンスルホン酸(4,7-ジフェニル-1,10-フェナントロリンジスルホン酸)Sigma-AldrichB1375
C57BL / 6マウス(Mus musculus)チャールズリバー研究所
カルボニル鉄粉、≥99.5%Sigma-Aldrich44890
ポリメチルメタクリレート (PMMA) の使い捨てキュベットVWR634-0678P
二重蒸留滅菌水B. Braun0082479E
蛍光マイクロプレートリーダーBioTek InstrumentsFLx800
塩酸、37%Sigma-Aldrich258148
電子レンジ消化オーブンと白いテフロンカップCEMMDS-2000
硝酸フィッシャー サイエンティフィック15687290
オーブンバインダーED115
げっ歯類 チャウHarlan Laboratories2014STeklad Global 14% Protein げっ歯類 メンテナンス ダイエット 175 mg/kg 鉄を含む
シーバス (Dicentrarchus labrax)Sonrionansa
シーバスフィードスクレッティングL-2 オルタナ 1P
シングルビーム UV-Vis分光光度計島津製作所UV mini 1240
チオグリコール酸メルク100700
トリクロロ酢酸メルク100807

参考文献

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  1. Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
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