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方法論記事

糸状シアノバクテリウム・ホルミジウム・ラクナの自然形質転換、タンパク質発現、凍結保存

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DOI:

10.3791/63470

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2022年2月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

この記事について

サマリー

ホルミジウムラクナは、 海洋の岩溜まりから単離された糸状シアノバクテリウムである。この記事では、天然源からのフィラメントの単離、DNA抽出、ゲノムシーケンシング、自然形質転換、sfGFPの発現、凍結保存、および運動性法について説明します。

要約

シアノバクテリアは、太陽エネルギーをバイオマス生産に利用する基礎研究およびバイオテクノロジープロジェクトの焦点です。ホルミジウムラクナは、新たに単離された糸状シアノバクテリウムである。この論文では、新しい糸状シアノバクテリアを海洋の岩盤プールから単離する方法について説明します。また、フィラメントからDNAを抽出する方法と、ゲノムを配列決定する方法についても説明します。形質転換は多くの単細胞種で確立されているが、糸状シアノバクテリアについてはあまり報告されていない。P. lacunaの自然な変換のための単純化された方法がここで説明されています。P. lacunaは、自然変換が確立されているオシラトリアルの秩序の唯一のメンバーです。この論文はまた、スーパーフォルダ緑色蛍光タンパク質(sfGFP)を発現するために自然形質転換がどのように使用されるかを示す。内因性cpcBプロモーターは、シネコシスティス・エスピーPCC6803由来のcpc560、A2813、またはpsbA2プロモーターよりも約5倍強い発現を誘導した。さらに、P. lacunaおよびSynechocystis sp.CPP 6803の凍結保存のための方法が確立され、液体培地中および寒天およびプラスチック表面上の運動性を評価するための方法が記載されている。

概要

シアノバクテリアは、光合成をエネルギー源として利用する原核生物である1,2。研究はますますシアノバクテリア種に焦点を当てています。いくつかのシアノバクテリアをDNA3で形質転換することができる。遺伝子は、これらの種においてノックアウトまたは過剰発現され得る。しかしながら、形質転換は、数種4、5、6、7、8、9、10、11に限定されており、培養コレクションまたは野生8からの系統において形質転換を確立することは困難であり得る。糸状種Phormidium lacuna(図1)の菌株は、塩濃度や温度などの環境条件が経時的に変動する海洋岩溜まりから単離された。これらの糸状シアノバクテリアは、それらが属する秩序振動子12のモデル生物として用いることができる。

エレクトロポレーションによる遺伝子導入を試験する試験中13、14は、P.ラクナが天然形質転換によって形質転換され得ることを見出した15。このプロセスでは、DNAはいくつかの細胞によって自然に取り込まれます。変換の他の方法16,17と比較して、自然な変換は、手順を複雑にする可能性のある追加のツールを必要としないという利点を有する。たとえば、エレクトロポレーションには、適切なキュベット、無傷のワイヤ、および適切な電圧の選択が必要です。P. lacunaは現在、自然変換の影響を受けやすい唯一のオシラトリアルメンバーです。元のプロトコルはエレクトロポレーションプロトコルに基づいているため、不要な洗浄ステップがいくつか含まれていました。プロトコルを簡素化するためにさまざまなアプローチがテストされ、ここで紹介する変換プロトコルが導かれました。

ゲノム配列は、遺伝子ノックアウトまたは過剰発現に基づくさらなる分子研究に不可欠である。ゲノム配列は次世代のシーケンシングマシンで短期間で取得できますが、DNAの抽出は難しく、種によっても異なります。 P. lacunaでは、いくつかのプロトコルがテストされました。その後、修飾セチルトリメチルアンモニウムブロマイド(CTAB)ベースの方法が確立され、実験室での継続的な作業のために、各精製サイクルのDNAおよびDNA収率の許容可能な純度が得られました。5つの株のゲノムをこのプロトコールで配列決定することができた。次の論理変換ステップは、 P. lacunaにおけるタンパク質発現を確立することでした。

このプロトコールにおいてマーカータンパク質として使用されるsfGFPは、任意の蛍光顕微鏡で検出することができる。試験された全てのプロモーターは、P. lacuna sfGFP発現に使用できた。形質転換から生じる株数の増加は、培養物を保存する方法の必要性をもたらした。このような方法は、大腸菌および他の多くの細菌について確立されている18。標準的なプロトコールでは、グリセロール培養物を調製し、液体窒素中で移し、−80°Cで保存する。 この方法はほんの数ステップしか必要とせず、それが確立された種にとって高い信頼性があります。P. lacunaでは、生細胞をすべてのケースで回収できなかったため、標準プロトコルは実現不可能でした。しかしながら、融解後にグリセロールを除去した場合、全ての試験の細胞は生存した。P. lacunaの運動性の分析のために簡単な方法が提示され、これはIV型ピリまたは光受容体の役割を調査するためにノックアウト突然変異誘発と組み合わせることができる。これらのアッセイは、単細胞シアノバクテリア19、20、21のアッセイとは異なり、他の発振器にも有用であり得る。

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プロトコル

1. 自然環境からの隔離

注:緑藻、珪藻、糸状シアノバクテリア、および他の微細藻類を単離することができる。このプロトコルは、実験室条件下で成長するロックプールからの任意の微細藻類種に使用することができる。オシラトリアル属に属する糸状シアノバクテリアは、その動きや糸状形状によって容易に認識することができる。種は、ゲノムシーケンシングまたは16S rRNAシーケンシングによって半純粋な状態で同定することができる。

  1. 海洋ロックプール(すなわち、岩の多い海岸の空洞)からの液体海水サンプルを50mLフラスコに移す。各フラスコについて、天然源の正確な場所または座標を書き留めます。可能であれば、動物プランクトンの量を減らすために50μmの網を通して内容物をろ過してください。継代培養できるようになるまでサンプルを4°Cで保存する。
  2. 1mL培養物をf/2培地中の3%バクト寒天を含む10cmペトリ皿に移す22,23(材料表を参照)。プレートを20枚まで用意します。50μmol m-2 s-1の白色光下で栽培する。
    注:より高い光強度を栽培に使用することができる。P. lacunaには最大400 μmol m-2 s-1の強度を使用できますが、他の種はより光に敏感である可能性があります。
  3. 1週間後、滅菌鉗子を用いて所望の細胞を新鮮な寒天プレートに移す。無菌条件下で両眼顕微鏡下で細胞を単離する。細胞が現れ、新しい寒天プレート上で成長するまで、古い寒天プレートを4°Cで保存する。
  4. 汚染を排除するために、この移送ステップを毎週繰り返します。重い汚染を検出するには肉眼を使用し、汚染の追加チェックには倍率400倍の顕微鏡を使用してください。
  5. サンプルに汚染がないと思われる場合は、寒天プレートで細菌または真菌の汚染をテストします。接種ループで培養物の一部をLB24 寒天プレート(直径10cm)に移し、プレートを室温に保ち、1〜3日間にわたって汚染物質の増殖を確認した。
  6. 無菌の糸状シアノバクテリア種が得られた場合は、さらなる培養作業に使用してください。 P. lacunaを 液体またはバクト寒天プレートで栽培する。液体培養には、50 mL の f/2 培地または f/2+ 培地を含む 250 mL フラスコを使用してください。

2. DNA抽出

注:この方法は25 26から採用されています 

  1. 50mLのf/2培地を入れたフラスコを2枚用意する。それぞれに、他の生育培養物由来の〜1mLのP.ラクナフィラメントを接種する。培養物を白色光下(50μmol m-2 s-1)で25°Cで50rpmで攪拌(水平回転)下で7日以上保持する。
  2. 培養物を超音波( 材料表を参照)で2分間全エネルギーで処理する。750nmでODを測定する。それが〜0.5であることを確認してください。ODが低すぎる場合は、文化を成長させ続ける。
  3. フィラメントを5,000 × g、20分間遠心分離により回収する。上清を取り除きます。残液とともにフィラメントをフレンチプレス27のチャンバーに移す。フレンチプレスの圧力を20,000psiに設定し、細胞を抽出する。
    注:フレンチプレスはすべての細胞を溶解し、DNAを放出します。強いせん断力は1,500 bp DNA断片を生成する。
  4. サンプルを10,000 × g で10分間遠心分離し、上清を除去した。
  5. 400 μL の溶解バッファー (4 M 尿素、0.1 M トリス/Cl、pH 7.4) および 50 μL のプロテイナーゼ K (10 mg/mL) をペレットに加えます。試料を550rpmで振とうしながら60分間55°Cに加熱する。
  6. 1 mL の DNA 抽出バッファー (3% CTAB、1.4 M NaCl、10 mM EDTA、0.1 M Tris/Cl、1% サルコシル、0.1 M DTT、pH 8) を加え、55 °C、550 rpm で 60 分間インキュベートします。溶液を遠沈管に移し、2倍量のクロロホルム/イソアミルアルコール(24/1)を加える。
  7. 振とう後、試料を9,000×gで5分間遠心分離 する。上部の水相を反応バイアルに移し、1mLの氷冷エタノールおよび50μLの3M酢酸ナトリウムを加える。
  8. サンプルを渦巻きにし、-20°Cで1時間以上置きます。
  9. 10,000 × g (4°C)で5分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを70%エタノールで洗浄する。
  10. サンプルを再度遠心分離します。上清を除去し、ペレットを一晩乾燥させる。DNAをヌクレアーゼを含まない水に溶かす。DNAスペクトルを測定して、OD 260 nm/OD 280 nmが1.6~1.9の範囲にあるかどうかを確認します。
  11. アガロース電気泳動ゲル28上のDNAの大きさを分析する。
  12. ゲノムDNAを次世代シーケンシングにより300サイクル、ペアエンド設定、150塩基のリード長で配列決定します( 材料表を参照)。
  13. 適切なコンピュータプログラムでアセンブリを実行します。 材料表の例を参照してください。
  14. ゲノムのドラフトをRASTサーバーに提出してアノテーションを受ける。
    注:DNA配列をアップロードして、数分以内に完全な注釈を取得します。

3. 自然形質転換とGFP発現

注:形質転換は、大腸菌で増殖したプラスミドベクターに基づいています。pGEM-TまたはpUC19は、骨格ベクターとして使用され得る。クローニング技術は多くの研究室で確立されています。標準プロトコル28およびP. lacuna15,29の変換ベクトルに関する記事も参照してください。sfGFP発現のためのベクターの例は、代表的な結果の節に記載されている。まだ公開されていない4つのベクトルの詳細は、補足ファイル1に記載されています。

  1. 滅菌実験室条件(クリーンベンチ、滅菌ガラス製品)下で滅菌材料を使用してすべてのステップを実行します。
  2. 2 x 50 mL の f/2 液体培地を 2 つの 250 mL フラスコに接種し、ランニング培養物から 2 x 1 mL の P. ラクナフィラメントを接種します。白色光(50 μmol m-2 s-1)下で撹拌(水平回転、50rpm)下で25°Cで約5日間栽培する。
  3. 製造元の指示に従って、midi 分取キット ( 材料表を参照) を使用して、約 200 μg の形質転換ベクター DNA を調製します。
  4. 100mLの P. lacuna 細胞懸濁液( 材料表を参照)を10,000rpmで3分間ホモジナイズする。750nmでODを測定します(所望の値= 0.35)。
  5. 細胞懸濁液を6,000×gで15分間遠心分離 する。上清を除去し、ペレットを残りの液体の800μL(残留液体およびフィラメントを含む総量)および追加のf / 2+ 培地に懸濁する。
  6. 120μg/mLカナマイシンを含む8枚のf / 2 + バクト寒天プレート(直径10 cm)を取ります。10μgのDNAを各寒天プレートの中央にピペットで送る。直ちに100 μLの細胞懸濁液を各寒天プレートの中央(DNAの上に)にピペットで移した。
  7. 余分な液体が蒸発するのを許すために、クリーンベンチに蓋なしで寒天プレートを保管してください。プレートを閉じ、白色光の中で25°Cで2日間栽培する。
  8. 接種ループを備えた各寒天プレートのフィラメントを、120μg/mLカナマイシンを含むいくつかの新鮮なf/2+ バクト寒天プレートに分配する。プレートを25°Cの白色光で培養し、顕微鏡下で定期的に培養物を確認する。
  9. 顕微鏡下で7〜28日後に生きた形質転換フィラメントを同定する。他のフィラメントとは異なる、健康で緑色のフィラメント(図2)を探します。これらの緑色のフィラメントが識別できたら、次のステップに進みます。それ以外の場合は、プレートをさらに7日間保管してください。
  10. 鉗子を使用して、これらの同定された生きたフィラメントを、250μg/mLカナマイシンを含む50mLの液体f/2+ 培地に移す。シェーカー(水平回転、50rpm)上で25°Cの白色光中で栽培する。最大4週間成長を観察します。
  11. フィラメントを250μg/mLカナマイシンを含む寒天培地に戻し、フィラメントが成長するのを待ちます。数日後、単一フィラメントを、より高濃度のカナマイシン(例えば、500μg/mL)を含む新鮮な寒天プレートに移す。元のプレートを保管してください。
  12. フィラメントが液体培養中または寒天上で高濃度のカナマイシン中で増殖していることを確認してください。分離をスピードアップするために再びカナマイシン濃度を増加させます.
    注:形質転換 されたP. lacunaは、 最大10,000μg/mLのカナマイシンで増殖する。他の種はそのような高濃度を許容しないかもしれません。
  13. 耐性細胞が増殖し、プレート上に広く分布している場合は、外側および内側のプライマーでPCRを行うことにより、 P. lacuna のゲノムへのインサートの組み込みをテストします。
    1. 挿入のクローニング用に設計されたプライマーをインナープライマーとして使用する。
    2. 外側プライマーの設計のために、 P. lacuna のゲノム上の提案された挿入部位の5'および3'であるが、挿入の外側にある配列を選択する。
    3. PCR反応には、インナープライマーとアウタープライマーを使用します。耐性株と野生型を使用してください。
      注:内側プライマーは、インサートが存在することを示す。外側プライマーは、インサートが正しい遺伝子座に挿入されていることを示す。
  14. 各 PCR 反応について、約 10 mg のフィラメントを PCR チューブに直接入れ、標準プロトコル24 に従って PCR を実行します。製品が得られない場合は、アニール温度を変化させ、フィラメントを水で洗浄してください。
    注: PCR では、多くの異なるポリメラーゼを使用できます。Taqポリメラーゼなどの標準的なポリメラーゼは、より高価なエラーチェックポリメラーゼよりもエラー率が高い。この分析 PCR では、エラーチェックポリメラーゼは必要ありません。ただし、標準ポリメラーゼでPCR産物が得られない場合は、エラーチェックポリメラーゼをテストする必要があります。
  15. アガロース電気泳動24で耐性ラインのPCR産物を分析する。
    1. バンド位置をマーカーと比較し、野生型と形質転換体を比較します。内側と外側のプライマーでは、(抵抗カセットの挿入による)野生型よりも大きなバンド、または形質転換体の2つのバンド(野生型バンドのサイズを持つバンド と 大きいバンド)を探します。後者の場合、不完全な分離を示すので、高いカナマイシン濃度で培養を続ける。
      注: PCR および電気泳動の詳細については、15、24 またはその他の標準文献を参照してください。
  16. GFP発現の場合:1本のフィラメントを蛍光顕微鏡( 材料表参照)で、40倍または63倍に設定した対物レンズの倍率で観察する。明視野透過画像と蛍光画像を撮像する。GFP には、励起に 470 nm バンドパス、発光に 525 nm バンドパス、および 495 nm ビームスプリッタ (初期露光時間 500 ms) の設定を使用します。
  17. 露出時間を調整して、蛍光シグナルが明瞭になるように調整し、飽和強度を避けます。すべてのサンプルに同じ設定を使用してみてください。
  18. 野生型フィラメントも蛍光を表示するため、この背景蛍光について上記と同じ設定で画像をキャプチャします。
    注:GFPを発現する株は、より高いシグナルを持っていなければならない。それ以外の場合、GFP は表現されません。
  19. 蛍光画像の露光時間およびピクセル強度に基づいて、異なるフィラメントのGFP含有量を計算して比較する。

4. 凍結保全

注: P. lacuna および単細胞シアノバクテリウム ・シネコシスチス属PCC 6803 が使用されます。現在の方法は、 P. lacunaにとってより効果的です。

  1. P. lacunaまたはSynechocystissp PCC 6803を、それぞれ10mLのf/2+培地またはBG-11培地中で、白色光(50μmol m-2 s-1)下で攪拌下(水平回転、50rpm)で少なくとも10日間培養する。
  2. P. lacuna培養物(材料表を参照)を10,000rpmで3分間、または超音波装置(材料表を参照)で全エネルギーで2分間均質化する。いずれかの培養物のOD 750nmを決定し、値が1〜7の間であるかどうかをチェックする。
  3. 6,000 × g で15分間遠心分離して細胞を回収する。上清を取り除きます。
  4. 細胞ペレットを800 μLのf/2+ またはBG-11培地(最終容量)に懸濁し、2mLクライオバイアルに移す。細胞懸濁液に800μLの50%グリセロール溶液を加える。バイアルを閉じ、反転を繰り返して混合する。
  5. クライオビアを液体窒素に移し、-80°Cの冷凍庫内のクライオボックスに保管する。冷凍庫内の箱の位置と箱内のサンプルの座標に注意してください。
  6. 細胞の回収のために、クライオビアルを取り出し、内容物を室温で解凍する。内容物を2mL反応管に移す。
  7. サンプルを2回洗浄する。1回目の 洗浄では、6,000 × g で5分間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを2mLのf/2+ またはBG-11培地に再懸濁する。2回目の 洗浄では、6,000 × g で5分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを2 mLのf / 2+ またはBG-11培地に懸濁する。
  8. 培養の準備ができているこれらの細胞の完全性を確認するには、ペレットを9mLの培地に移し、攪拌(55rpm)下で白色光(50μmol m-2 s-1)で培養する。培養1日目と1週間後のOD 750 nmを比較する。

5. ホルミジウムラクナの運動性

注:3つの異なるアッセイについて説明する。すべてのケースで同じカルチャが使用されます。

  1. P. lacuna を f/2 培地で白色光 (50 μmol m-2 s-1) で水平攪拌 (50 rpm) 下、推定 OD 750 nm が 0.35 になるまで約 5 日間培養します。使用時まで4°Cでサンプルを保管する。
  2. フィラメント(材料表を参照)を10,000rpmで3分間、または超音波(材料表を参照)で最大出力1サイクルで1分間均質化します。OD 750 nmを測定します。0.35を超える場合は、フラクションをf / 2培地で希釈する。この溶液は、ステップ5.3、5.4、および5.5の運動性アッセイで使用します。
  3. 液体培地中での移動アッセイ
    1. 運動性を直接観察するために、 P. lacuna を含む培地8mLを(ステップ5.2から)6cmのペトリ皿に移す。サンプルが室温に達するまで数分待ちます。ペトリ皿をセロハンホイルで覆います。
    2. カメラ付きの標準顕微鏡のx-yテーブルの上に顕微鏡スライドを置きます。顕微鏡のライトをオンにします。理想的には、照明には常に同じ電気的および光学的設定を使用します。4 倍または 10 倍の対物レンズをライトのパスに移動します。
    3. スライドの上にペトリ皿を置きます。単一フィラメントまたはフィラメントバンドルを、テーブルの x、y、z の動きで調整します。
      注:3次元配置のため、関連するセクションの一部のみに焦点を合わせることができます。セロハン箔は、制限なしに焦点を調整することができます。
    4. 単一のフィラメントまたはバンドルの動きを観察します。対物レンズが液体に触れていないことを確認します。フィラメントの動きを標準の顕微鏡カメラで記録します( 補足ビデオS1を参照)。
  4. 表面上の移動のためのアッセイ
    1. 寒天表面上のフィラメント運動性の観察のために、f / 2バクト寒天を含む6cmのペトリ皿を準備する。寒天が、対物レンズが寒天表面に近づくのに十分な高さであることを確認します。あるいは、厚さ約3mmの寒天層を作製し、寒天を通してフィラメントを記録する(プレートを逆さまに保つか、倒立顕微鏡を使用する)。
    2. P.ラクナを含む溶液0.5mLのピペット(ステップ5.2から)を6cmのペトリ皿のバクト寒天表面上に。液体がサーフェスに入るのを待ちます。ペトリ皿を閉じ、4倍または10倍の対物レンズを使用して表面上のフィラメントの動きを観察します。
    3. 顕微鏡の電気的および光学的設定が、記録中およびその後の記録で使用されていることを確認します。
    4. 眼カメラとミニコンピュータシステムを使用してタイムラプス録画をキャプチャします。後続の画像間の時間間隔が 5 秒から 1 分であることを確認します。ミニコンピュータのLinuxスクリプトをプログラムして、タイムラプス記録を制御します。スクリプトの例については 補足ファイル 2 を、例として 補足ビデオ S2 を参照してください。
  5. フォトタクシーのアッセイ
    1. フォトタキシスの実験では、選択した5mmのLEDを装着した発光ダイオード(LED)ホルダー(ここでは3Dプリンター付き)を用意し、下から上へ20mm2 の領域を照射します(図3)。必要に応じて、多数のLEDホルダを並列に使用し、各LEDを抵抗とポテンショメータを介して調整可能な電源に電気的に接続します。実験に応じて、LEDの強度を測定および調整します。設定全体が暗い部屋または閉じた暗い容器にあることを確認します。
    2. P. lacunaを含む培地8 mL(ステップ5.2から)を6 cmのシャーレに入れる。LEDの光の強度を調整します。蓋でペトリ皿を閉じ、LEDがペトリ皿の中央に来るようにLEDホルダーの上に置きます。
    3. 所望の期間(典型的には2日間)の後、光処理の位置に直接向けられたスマートフォンカメラでペトリ皿の画像をキャプチャする。試料の照射には白色LEDパネルを使用してください。カメラの手動設定を使用します。光の反射を避ける。カメラレンズと試料の間の距離が同じになるように常に調整してください。露出設定で、ImageJ を使用した後の解析に適したイメージが得られることを確認します。
    4. ImageJソフトウェアを使用してフィラメントの中央円の直径を定量化します。
      1. ImageJを開き、[ファイル|]をクリックします。 開き、目的のファイルを選択して、[ Enter] をクリックします。
      2. [直線] ボタン (直線付き) を選択します。マウスの左ボタンを押して、ペトリ皿の一端から反対側の端まで線を引きます。線がフィラメントの円の中心を通ることを確認します。
      3. キーボードの Ctrl-K キーを押すか、[ |の分析] をクリックします。 ImageJ メニューのプロファイルをプロットします。ピクセル強度が距離に対してプロットされたx-yウィンドウ(ペトリ皿の1Dプロファイル)を探します。最小ピクセル強度が 0 をわずかに上回り、最高値が 255 を下回っていることを確認します。
      4. 円の外側のピクセル強度の平均値と、円内のピクセル強度の別の平均値を推定します。これらの値の間の y 位置で、これらの位置をマウスでポイントして、円の両側の x 値を推定します。両方の値をメモし、差を計算します。
      5. 右の Y 軸にマウスをポイントして、最も高い x 値を取得します。なお、この値 e はシャーレの直径を表す。この直径が 5 cm の場合、 中央フィラメント円の直径を d/e として計算し、5 cm ×します。

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結果

上記の方法に従って、 P. lacuna の5つの異なる株を岩溜まりから単離し、配列決定した(図 1および 表1)。全ての培養物は、 P. lacuna HE10JOを除く継代培養の〜1年後に無菌であった。この株はまだ海洋細菌である マリビルガ・アトランティカで汚染されています。その後のヘルゴランド遠足の間に、他の糸状シアノバクテリアが岩のプールから単離されたが、これは P. lacuna とは異なり、特徴付けられる必要がある。

いくつかのDNA抽出および精製方法をP. lacunaについて試験した。最良の結果は、上記のように最適化されたCTAB法で得られた。DNA収率は310 ± 50 μg/mL、OD 260 nm/OD 280 nmは1.7 ± 0.03、OD 260 nm/OD 230 nmは0.78 ± 0.04 (n = 17)であった。ゲノムシーケンシングは、予想通り、...

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ディスカッション

シアノバクテリアの多くの株が培養コレクション32、33、34、35、36から入手可能であるが、これらの種は特定の特性に適応しているため、野生からの新しいシアノバクテリアの需要が依然としてある。P. lacunaは岩溜まりから採取され、塩濃度および温度30の変動に適合している。この種の株は、2008年、2009年、および2010年の遠足中に発見されました。ここに記載した手順により、P. lacunaの5株を単離し、これらの株のうち4株を滅菌した。P. lacuna HE10JO株は、rRNAおよびゲノムシーケンシングによって同定された海洋細菌である細菌Marivirga atlanticaで永久に汚...

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開示事項

著者らは、開示する利益相反はありません。

謝辞

この研究はカールスルーハー工科大学の支援を受けた。

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材料

Culture media
この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
オートクレーブ 3870 ELVTuttnauer3870 ELV
Bacto 寒天OttoNorwald214010
BG-11 淡水溶液Sigma AldrichC3061
BG-11 中メルク73816-250ML
ホウ酸メルク10043-35-3H3BO3
塩化カルシウム二水和物Carl Roth10035-04-8CaCl2 · 2 H2O
細胞培養フラスコ Cellstar フィルタースクリューキャップ付き、滅菌済み、250 mLGreiner658190
細胞培養フラスコ Cellstar フィルタースクリューキャップ付き、滅菌済み、50 mLGreiner601975
遠心分離機 LYNX 4000Thermo Scientific75006580とローター
遠心分離機 microstar 17VWR InternationalN/Afor up to 13,000 rpm
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)PanReac AppliChem57-09-0C19H42BrN
クロロホルム : イソアミルアルコール 24 : 1PanReac AppliChem
A1935
塩化コバルト(II) 六水和物メルク7791-13-1CoCl2 ·6 H2O
硫酸銅(II) 五水和物メルク7758-99-8 CuSO4 ·5 H2O
D(+)-ビオチンカール・ロス58-85-5 C10H16N2O3S
DNAラダー 1 kbNew England BiolabsN3232
DNA ladder 100 bpNew England BiolabsN3231
電気ピペッティングヘルプ accujet-pro SBrand GmbH263601-25 mL
エタノールVWR64-17-5C2H6O
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物カール・ロス6381-92-6EDTA-Na2 · 2 H2O
蛍光顕微鏡 ApoTomeツァイス
蛍光顕微鏡 Axio Imager 2ツァイス
フレンチ圧力セルプレスアメリカン・インスツルメンツ・カンパニーN/A
ゲルドキュメーションシステム Saffe ImageInvitrogen
Gelelctrophoresis System Mupid-One/-exuADVANCED
ガラス製品、異なる
セロールカールロス56-81-5C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrateMerck10025-77-1 FeCl3 ·6 H2O
カナマイシンSigma-Aldrich25389-94-0
カナマイシン硫酸塩カール・ロス25389-94-0C18H36N4O11 ·H2SO4
>ラウロイルサルコシン、ナトリウム塩(サルコシル)Sigma Aldrich137-16-6C15H28NO3 ·Na
LB Broth (Lennox)Carl RothX964.4
光源、蛍光管 L18W/954 日光OSRAMシアノバクテリアの栽培
光源、LED パネル XL 6500K 140 Wブルーム スターN/Aシアノバクテリアの栽培、最大 1,000 &マイクロ;mol m-2 s-1
塩化マグネシウム六水和物カール・ロス7791-18-6MgCl2 & middot; 6 H2O
塩化マンガン(II) 四水和物Serva13446-34-9MnCl2 · 4 H2O
顕微鏡 DM750ツァイス
MIDIプレッププラスミド抽出キット NucleoBond Xtra MIDIキットMacherey-NAGEL GmbH & Co. KGREF740410.50
ミニコンピューター Raspberry Pi 4 +Conrad Electronics2138863-YDタイムラプス録画用
眼球カメラ EC3ライカ最大30秒の連続記録用
眼球カメラ MikrOkular Full HDBresserRaspberry Piミニコンピュータ
ペトリ皿ポリスチロール、100 mm x 20 mmMerckP5606-400EA
ペトリディッシュポリスチロール、60 mm x 15 mmMerckP5481-500EA
光度計 Nanodrop ND-1000Peqlab Biotechnologie
光度計 Uvikon XSGoebel Instrumentelle Analytik GmbH
ピペットマン100-1,000&マイクロ;LギルソンSKU: FA10006M
ピペットマン 10-100 & マイクロ;LGilsonSKU: FA10004M
プラスチックピペット 10 mL、滅菌済みGreiner607107
プラスチックチューブ、滅菌済み、15 mLGreiner188271
プラスチックチューブ、滅菌済み、50 mLGreiner227261
臭化カリウムCarl Roth7758-02-3KBr
塩化カリウムCarl Roth7447-40-7KCl
電源Statron 3252-1Statron Gerätetechnik GmbH
電源 Voltcraft PPS 16005Conrad Electronicsfor LED
Proteinase KPromegaMC500Cfrom Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymeraseNew England BiolabsM0491S
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5Illumina
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002イルミナ
シェーカー ユニマックス 2010ハイドルフ 栽培用器具
酢酸ナトリウムカール・ロス127-09-3NaCH3COO
塩化ナトリウムカール・ロス7647-14-5NaCl
リン酸二水素ナトリウム 一水和物カール・ロス10049-21-5NaH2PO4 ·H2O
フッ化カール・ロス7681-49-4NaF
炭酸水素ナトリウムカール・ロス144-55-8NaHCO3
リブデン酸ナトリウム二水和物セルバ10102-40-6Na2MoO4 & middot; 2 H2O
硝酸ナトリウムメルク7631-99-4NaNO3
Na Nadium sulphateカール・ロス7757-82-6Na2SO4
塩化ストロンチウム六水和物カール・ロス10025-70-4SrCl2 · 6 H2O
チアミン塩酸塩メルク67-03-8C<サブ>12H<サブ>17ClN<サブ>4OSおよびミッドドット;HCl
TRISカール・ロス77-86-1C4H11NO3
超音波装置 UP100H ソノトロード MS3ヒールシャー超音波技術UP100H
Ultraturrax サイレントクラッシャー Mハイドルフ・インスツルメンツホモジナイザー
尿素カール・ロス57-13-6CH4N2O
ビタミンB12Sigma68-19-9C63H88CoN14O14P
ビタミン液0.3 &M thiamin-HCl, 2.1 nM ビオチン, 0.37 nM シアノコバラミン
蒸留器, 水処理VEOLIA 水技術ELGA_21001
硫酸亜鉛七水和物Sigma7446-20-0ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia プログラムhttps://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline、短いDNAリードから大きな足場を作成し、画像
ImageJソフトウェアRAST
>
人工海水0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2, 9 mM KCl、2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr、0.49 mM H3BO3、90 & マイクロ;M SrCl<サブ>2、72 & マイクロ;M NaF
f / 2 -液体培地人工海水、0.1 % (v/v) 微量元素溶液、0.05 % (v/v) ビタミン溶液、0.88 mM NaNO3、36 µM NaH2PO4 
f/2+液体媒体f/2-medium、NaNO3とNaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 & micro;M NaH2PO4
f/2+-agar3 % (w/v) bacto agar, 人工海水, 0.1 % (v/v) 微量元素溶液, 0.05 % (v/v) ビタミン溶液 , 8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-寒天3 % (w/v) バクト寒天、人工海水、0.1 % (v/v) 微量元素溶液、0.05 % (v/v) ビタミン溶液、0.88 mM NaNO3、36 µM NaH2PO4
微量元素溶液0.36 mM NaH2PO4, 12 & micro;M Na2EDTA、39 nM CuSO4、26 nM Na2MoO4、77 nM ZnSO4、42 nM CoCl2、 0.91 以上M MnCl<サブ>2ビタミン溶液0.3 &>
M チアミン-HCl、2.1 nM ビオチン、0.37 nM シアノコバラミン
グリナトリウム モ は処理(ピクセル強度、円径)用のLinuxベースのアノテーションサーバー https://rast.nmpdr.org 入力:ゲノムDNA配列、オープンリーディングフレームの検出、タンパク質配列とその機能のリスト

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