方法論記事

半導体ベースの次世代シーケンシングプラットフォームにおける異数性のための移植前遺伝子検査

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DOI：

10.3791/63493

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2022年8月17日

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1Centre for Women, Children, and Reproduction, Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research, 2Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Chinese PLA General Hospital, 4Clinical Laboratory, Northern Theater Air Force Hospital, 5Guangzhou Darui Reproduction Technology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、半導体ベースの次世代シーケンシングプラットフォーム上での異数性に対する移植前遺伝子検査に必要なラボ内の全体的な手順を提示します。ここでは、全ゲノム増幅、DNA断片選択、ライブラリ構築、テンプレート調製、シーケンシング作業フローの詳細なステップを代表的な結果とともに紹介します。

要約

次世代シーケンシングは、遺伝的バリアントの決定における臨床応用においてますます重要性を増しています。移植前の遺伝子検査では、この技術にはスケーラビリティ、スループット、およびコストの点で独自の利点があります。異数性解析のための移植前遺伝子検査では、ここで紹介する半導体ベースの次世代シーケンシング(NGS)システムは、8Mbの最小分解能で構造的遺伝的バリアントを決定するための包括的なアプローチを提供します。サンプルの取得から最終レポートまで、作業プロセスにはプロトコルに厳密に準拠した複数のステップが必要です。さまざまな重要なステップが増幅の結果、ライブラリの品質、読み取りのカバレッジ、およびデータの出力を決定することができるため、言葉以外の視覚的なデモンストレーションを伴う説明情報は、操作と操作の詳細を提供する可能性があり、すべての重要なステップの結果に大きな影響を与える可能性があります。本明細書に提示される方法は、生検されたTrophectoderm(TE)細胞の全ゲノム増幅(WGA)、ゲノムライブラリー構築、シークエンサー管理、そして最後にコピー数バリアントのレポートの生成に関与する手順を示す。

概要

異数性は、1つ以上の余分な染色体の存在または1つ以上の染色体の不在による染色体数の異常である。1つのX染色体の喪失(ターナー症候群)、常染色体21(ダウン症候群)、13(パタウ症候群)、および18(エドワーズ症候群)のトリソミーのような常染色体の余分なコピー、または47、XXX(クラインフェルター症候群)および47、XXX(トリプルX症候群)などの余分な性染色体のようなある種の異数性を有する胚は、先天性欠損症1の期間まで生き残ることができる。異数性は、第1期流産および 体外 受精(IVF)障害の主な原因である2。異数性率は、体外受精の実践3における自然サイクルおよび薬用対照群の異なる年齢層を通じて、25.4%〜84.5%の範囲であり得ることが報告されている。

次世代シーケンシング技術は、遺伝情報の決定に臨床的に広く応用されつつあります。それは効率および高いスループットでゲノム配列への実用的なアクセスを提供する。特に、次世代シーケンシングは、遺伝的要因による疾患の診断やゲノムの異常性の検査にも革命をもたらしました4。半導体シーケンシング技術を使用して、シーケンシングバイオ反応の化学信号をデジタルデータに直接転送する半導体ベースのシーケンスシステムは、3-7時間5,6でシーケンスデータに直接、リアルタイム検出を提供します。

体外受精手順では、着床前遺伝子検査(PGT)は、体外受精の結果を改善し、新生児の遺伝性疾患のリスクを軽減するために、子宮に移される前に胚の遺伝子プロファイルを調査します1,7。PGTとNGS技術を組み合わせることで、10細胞未満から抽出した遺伝物質を全ゲノム増幅キットまたは独自開発の全ゲノム増幅試薬で増幅します。これは、増幅段階で1つのステップのみを必要とし、全ゲノム増幅産物を得るために、事前増幅を必要としない。コピー数変異体および特別な遺伝子座配列決定のためのプライマーまたはパネルは、構築されたライブラリーにおいて設計および適用される。

NGSにおける着床前遺伝子検査異数性検査(PGT-A)の典型的なワークフローは、逐次的な手順を伴い、実験室職員の激しい作業負荷を必要とする8。一部の誤操作により、手順のロールバックが発生し、ラボの時間とリソースの両方が望ましくない損失につながる可能性があります。PGS-NGS ワークフローの簡潔で明確な標準操作手順 (SOP) が役立ちます。ただし、ワード形式のプロトコルでは、サンプル処理、デバイス操作、および計測器の設定に関するより詳細な情報を提示できず、ビデオプロトコルで視覚化できます。この記事では、検証済みのワークフローと動作の詳細の視覚化されたデモンストレーションを組み合わせることで、半導体シーケンシングプラットフォームでのPGTプラクティスにおいて、より直接的で直感的な参照プロトコルを提供できます。

ここでのプロトコルは、最大16回の胚生検を並行してバッチ処理することをサポートする方法を説明しています。より大きなバッチの場合は、Reproes-PGSなどの半導体シーケンシングに商用キットベースのプロトコルを使用することをお勧めします。

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プロトコル

本試験に適用されたすべてのプロトコールおよび対流胚葉(TE)生検(1.1.1.1項)は、2017年9月18日に第924号病院のヒト研究倫理委員会によって審査および承認された(NO:PLA924-2017-59)。患者/参加者は、この研究に参加するための書面によるインフォームドコンセントを提供しました。

1. ヒト胚生検および全ゲノム増幅からのDNA単離

  1. 全ゲノム増幅のためのプロトコル 9,10
    注:ピコプレックスWGAキットは、全ゲノム増幅を実行するために使用されます。
    1. サンプルの収集と保管
      1. 対流胚葉生検:孵化支援後のD5/6胚のヘルニアTE から平均 6 ~ 9 個の細胞を採取し、次の増幅に適した量の DNA を取得します。
      2. サンプル細胞を 5 μL の PBS 中の PCR チューブに移します。
      3. プロトコルがDNA抽出に直接進まない場合は、直ちに-80°Cでサンプルを凍結します。
    2. 細胞溶解
      注:補足ファイル1は、細胞溶解および1、8、16、および32サンプルのバッチの全ゲノム増幅中にマスターミックスを調製する際に、各成分の推奨量をリストし、参照として役立ちます(ピペッティングエラーに対応するために超過分あり)。このプロトコルの他のマスターミックスを調合する場合、各成分の体積は、繰り返しピペッティングによって引き起こされる成分消費に対応するためにさらに増加する。すべての短時間の遠心分離は、卓上ミニ遠心分離機で室温(RT)で2〜10秒間、5,300 x gの遠心力で10,000の固定RPMで行われます。遠心力は 2,000 x g から 12,000 x g の間でなければなりません。
      1. サンプルあたり4.8 μLの抽出酵素希釈バッファーと0.2 μLの細胞抽出酵素で細胞溶解ミックスを調製します。
      2. 新しく調製した細胞溶解のピペット5 μLをPCRチューブ内の各5 μL細胞サンプルに混合し、チューブをRTで5秒間短時間遠心分離した。チューブを渦巻きにしないでください。
      3. 以下のようにサーマルサイクラーでサンプルをインキュベートする:75°C、10分間;95°C、4分;25°C、14分。インキュベーション後のチューブを短時間遠心分離(5秒)する。
    3. 全ゲノムDNAの事前増幅
      1. サンプルあたり 4.8 μL のプリアンプバッファーと 0.2 μL のプリアンプ酵素を含むプレアンプミックスを調製します。
      2. 予備増幅ミックスのピペット5 μLをチューブの壁を通してサンプルチューブに入れ、3秒間短時間遠心分離した。先端がチューブの底に達するのを避け、チューブを渦巻き込まないでください。
      3. 表1に記載したサーマルサイクラープログラムに従ってサンプルをインキュベートする。
    4. 全ゲノムDNA増幅
      1. サンプルを5秒間短時間遠心分離し、プリアンプインキュベーション製品を氷の上に置きます。
      2. サンプルあたり25 μLの増幅バッファー、0.8 μLの増幅酵素、および34.2 μLのヌクレアーゼフリー水で全ゲノム増幅ミックスを調製します。
      3. 新たに調製した全ゲノム増幅ミックス60 μLを15 μLのプレアンプインキュベーション産物と混合する。総容量は75 μLにする必要があります。短時間遠心分離機で5秒間加熱します。先端がチューブの底に達するのを避け、チューブを渦巻き込まないでください。
      4. PCR チューブをサーマルサイクラーの上に置き、 表 2 に記載されているサーマルサイクラープログラムを実行します。
      5. チューブを5秒間短時間遠心分離し、製品を新しい1.5mL遠心分離チューブに移します。
      6. 蛍光光度計11でWGA生成物濃度を定量する。サンプルは、次の手順に進まない場合は、-20°Cで2ヶ月未満時間保存することができます。
  2. 独自に開発されたWGA試薬のプロトコール。
    1. サンプルの収集と保管
      1. 次の増幅のために孵化支援後のD5/6胚から細胞を引き出す。
      2. 1.5 μL の PBS を含むサンプル細胞を、2 μL の PBS を含む PCR チューブに移します。
        注:PBSはMg2+およびCa2+を含まない。
      3. 直接DNA抽出プロトコールに進まない場合は-80°Cで直ちにサンプルを凍結する。
    2. 細胞溶解
      1. 細胞溶解バッファー (40 mM トリス (pH 8)、100 mM NaCl、2 mM EDTA、1 mM エチレングリコール四酢酸 (EGTA)、1% (v/v) Triton X-100、5 mM ピロリン酸ナトリウム、2 mM β-グリセロリン酸、0.1% SDS) を RT で溶かし、氷の上に置きます。各サンプルに2 μLの細胞溶解バッファーを加え、短時間(5秒)遠心分離した。
        メモ: チューブを渦巻きにせず、ピペットチップがチューブ内の液面に触れないようにして、細胞や DNA を反応系外に持ち出さないでください。
      2. 以下のようにサーマルサイクラーでサンプルをインキュベートする:55°C、20分;95°C、10分;4°C、保持する。インキュベーション後10秒間、チューブをRTで短時間遠心分離する。
    3. 全ゲノムDNA増幅
      1. 細胞溶解生成物を5秒間短時間遠心分離し、氷の上に置く。
      2. 増幅前混合液16 μL、増幅酵素1 μL、ヌクレアーゼフリー水28 μLと混合して、各サンプルの全ゲノム増幅用混合液を調製した。穏やかに混合し、短時間(5秒)遠心分離機で遠心分離し、混合物を氷の上に置く。チューブを渦巻きにしないでください。
      3. ステップ1.2.2.2で調製した細胞溶解産物に新たに調製した全ゲノム増幅混合物のピペット45 μL;穏やかに混合し、5秒間短時間遠心分離する。
        メモ:チューブを渦巻きにせず、ピペットチップがチューブ内の液体に触れないようにしてください。
      4. PCR チューブをサーマルサイクラーに置き、 表 3 に詳述されているようにプログラムを実行します。
      5. チューブをすぐに5秒間遠心分離し、製品を新しい1.5mL遠心分離チューブに移します。
      6. 蛍光光度計11 でWGA製品濃度を定量し、その結果をQA(品質分析)シートに記録する。適格な濃度の製品は、次のステップに進まなければ、-20°Cで2ヶ月未満で一時的に保存することができます。

2. 増幅断片の選択

注: このセクションで使用される資料は、ライブラリ準備キット(資料表)で入手できます。

  1. 開始前の準備
    1. 磁気ビーズ(n x 100 μL)を平衡化し、RTで30分間精製します。
    2. 以前のWGA製品をRTに復元します。製品をRTで30秒間ボルテックスしてから、短時間遠心分離します。
    3. 新鮮な70%エタノールを用意する。
  2. フラグメント選択手順
    1. WGA製品の25 μLをピペットで切り取り、25 μLのヌクレアーゼフリー水をプリロードした1.5 mL遠沈管に移します。
    2. ボルテックスとDNA精製ビーズをよく混ぜる。それを各サンプルチューブに50 μLずつ入れ(元のサンプル:ビーズ(体積)= 1:1)、ボルテックス、および遠心分離機を短時間(5秒)する。DNA結合プロセスのためにRTでチューブを5分間セットします。
    3. 1.5 mL 遠心チューブをマグネットラックに挿入し、すべての磁気ビーズがチューブの側壁に引き寄せられるまで待ちます。上清を新しい1.5 mL遠沈管に慎重に移します。ビーズをピペッティングしないでください。
    4. 元のサンプル容量に従って、磁気ビーズのピペット30 μL(元のサンプル:ビーズ(容量)= 1:0.6)を、渦、遠心分離機で短時間(5秒)します。DNA結合プロセスのためにRTでチューブを5分間セットします。
    5. 1.5 mL 遠心分離チューブをマグネットラックに挿入し、すべての磁気ビーズがチューブの側壁に引き寄せられるまで 5 分間待ちます。上清を慎重に取り除き、廃棄します。ビーズをピペッティングしないでください。
    6. 70%エタノール300 μLを1.5 mL遠沈管にピペットで入れ、180°の角度で管を2回静かに回転させ、ビーズを管壁に沿って移動させて徹底的に洗浄します。ピペットで上清を捨てる。ビーズをピペッティングしないでください。
    7. 洗浄手順を 1 回繰り返します。
    8. マグネットラックから 1.5 mL 遠心管を取り外し、すぐに (5 秒) 遠心分離します。チューブをマグネットラックに挿入し直し、すべての磁気ビーズがチューブの側壁に引き寄せられるまで待ちます。
    9. 底部に残っている液体を慎重にピペットで送り出します。チューブを開いたままにして、RTでビーズを3〜5分間乾燥させます。ビーズから水分を逃がしてください。
      メモ:ビーズのペレットに亀裂が生じた場合は、すぐに蓋を閉めてください。
    10. 磁気ラックからチューブを取り出し、25-30 μLのDNA溶出バッファーをチューブにピペットで入れ、キャップとボルテックスを閉じます。短時間遠心分離機(5秒)して濁った液体をチューブの底に取得し、チューブをRTで5分間セットした。
    11. チューブを磁気ラックに挿入し直し、すべてのビーズがチューブ側壁に引き寄せられ、上澄み液が透明になるまで待ちます。DNA溶液を新しい1.5 mL遠沈管に慎重に移します。ビーズをピペッティングしないでください。
    12. 断片選択後のDNA濃度を蛍光光度計11で定量し、-20°Cで保存する。 典型的には、選択されたDNA断片の濃度は、1.5〜2.4ng/μLの範囲である。

DNAライブラリーの作製

注: このセクションで使用される資料は、ライブラリ準備キット(資料表)で入手できます。

  1. 修復の終了
    1. 磁気ビーズをRTで30分間平衡化します。
    2. ステップ 2.2.12 でのフラグメント選択の DNA 産物を RT に平衡化します。DNA を含む各バイアルのタグを確認して記録します。
    3. 1.5 mL 遠沈管に 30 μL の DNA 産物、10 μL の末端修復バッファー、0.5 μL の末端修復酵素、および 9.5 μL のヌクレアーゼフリー水を使用して、DNA 末端修復システムを調製します。チューブを30秒間ボルテックスし、RTで短時間(5秒間)遠心分離して、すべての液体をチューブ底部に取得します。
    4. 25°Cで30分間インキュベートし、インキュベーション後のチューブを短時間遠心分離(5s)した。
    5. 磁気ビーズを渦巻きまたはリバースミックスし、75 μLの磁気ビーズを末端修復DNAサンプルを含むチューブに移します(元のサンプル:ビーズ(体積)= 1:1.5)。ピペットまたは穏やかにボルテックスでビーズをよく混合し、短時間遠心分離機(5秒)ですべての懸濁液をチューブの底まで回転させます。DNA結合プロセスのためにRTでチューブを5分間セットします。ビーズを分散させるためにチューブを静かにひっくり返します。
    6. 遠沈管をマグネットラックに挿入し、すべての磁気ビーズが側壁に引き寄せられ、上清が透明になるまで5分間待ちます。上清を取り除き、ビーズをピペッティングしないようにして、ピペッティング時にチューブをラックに保持してください。
    7. 新しく調製した70%エタノール300μLをチューブに移し、チューブを180°の角度で2回静かに回転させ、ビーズをチューブ壁に沿って動かして徹底的に洗浄します。ピペットで上清を捨てる。ビーズをピペッティングしないでください。
    8. 洗浄手順を 1 回繰り返します。
    9. マグネットラックから 1.5 mL 遠沈管を取り外し、短時間 (5 秒) 遠心分離します。チューブをマグネットラックに挿入し直し、すべての磁気ビーズがチューブの側壁に引き寄せられるまで5分間待ちます。
    10. 底部に残っている液体を慎重にピペットで送り出します。1.5 mL 遠沈管のキャップを開け、ビーズを RT で 3 ~ 5 分間乾燥させます。ビーズから水分を逃がしてください。
      メモ:ビーズのペレットに亀裂が生じた場合は、すぐに蓋を閉めてください。
    11. 33 μLのDNA溶出バッファーをチューブにピペットで入れ、キャップを閉め、ボルテックスした。短時間遠心分離機(5秒)して濁った懸濁液をチューブの底部に取得し、チューブをRTで5分間セットした。
    12. チューブを磁気ラックに挿入し直し、すべてのビーズが側壁に引き寄せられ、溶液が透明になるまで待ちます。DNA溶液を適切なタグを付けた新しい1.5 mL遠心分離チューブに慎重に移し、ビーズをピペッティングしないようにします。
  2. バーコードライゲーション
    1. ステップ3.2.2のバーコードライゲーション試薬を氷の上に置き、凍結試薬をすべて溶かします。
    2. 1.5 mL の遠沈管に、32 μL の末端修復 DNA 産物、10 μL のヌクレアーゼフリー水、5 μL のリガーゼバッファー、1 μL のリガーゼ、および 1 μL の P1 を適応させてライゲーションシステムを調製します。各バーコード試薬 1 μL を溶液ミックスにピペットで取り出し、チューブ内の溶液ミックスを 1 サンプル、ボルテックスを 5 秒間、短時間 (5 s) 遠心分離してチューブ底部内のすべての液体を取得します。
      メモ: バーコードを追加するときは、バーコードとサンプルの数が対応していることを確認してください。バーコードの混合汚染を避けるために、毎回1つのバーコードバイアルのみを開きます。5 つまたは 6 つのバーコードを追加するごとに手袋を交換します。
    3. チューブを25°Cで30分間インキュベートする。
    4. チューブに磁気ビーズ75 μLのピペット(原試料:ビーズ(容量)=1:1.5)を入れ、ピペットまたは穏やかにボルテックスしてビーズをよく混合した。遠心分離機を短時間(5秒)して、ビーズ凝集を避けて、すべての懸濁液を底まで回転させます。DNA結合プロセスのためにRTでチューブを5分間セットします。ビーズを分散させるためにチューブを静かにひっくり返します。
    5. 遠沈管をマグネットラックに挿入し、すべての磁気ビーズが側壁に引き寄せられ、上清が透明になるまで5分間待ちます。上澄み液を取り除き、ビーズをピペッティングしないようにして、ピペッティング時にはチューブをラックに保管してください。
    6. 新しく調製した70%エタノール300μLをチューブに移し、チューブを180°の角度で2回静かに回転させ、ビーズをチューブ壁に沿って移動させて徹底的に洗浄します。ピペットで上清を捨てる。ビーズをピペッティングしないでください。
    7. 洗浄手順を 1 回繰り返します。
    8. マグネットラックから 1.5 mL 遠沈管を取り外し、短時間 (5 秒) 遠心分離します。チューブをマグネットラックに挿入し直し、すべての磁気ビーズがチューブの側壁に引き寄せられるまで5分間待ちます。底部に残っている上清を慎重にピペットで取り除きます。
    9. チューブキャップを開けたままにして、RTでビーズを3〜5分間乾燥させます。ビーズから水分を逃がしてください。
      メモ:ビーズのペレットに亀裂が生じた場合は、すぐに蓋を閉めてください。
    10. チューブ内にDNA溶出バッファーを15 μLのピペットで入れます。ビーズのペレットをチューブの底まですすぎ、キャップを密封し、渦巻きます。短時間(5秒)遠心分離機で濁った懸濁液をチューブの底に着き、チューブをRTで5分間安定させます。
  3. フラグメント増幅
    1. 凍結試薬が溶解したら、図書館の建築試薬を氷の上に置きます。
    2. 溶出したDNAとビーズを含むチューブに酵素ミックス47.5 μLとプライマーミックス2.5 μLを移し、5秒間ボルテックスし、短時間(5 s)遠心分離して、すべての液体をチューブ底部に取得します。
    3. チューブをRTで5分間セットします。チューブを磁気ラックに挿入し直し、すべてのビーズが側壁に引き寄せられ、上澄み液が透明になるまで待ちます。DNA溶液をタグがはっきりとマークされた0.2 mL PCRチューブに慎重に移し、ビーズをピペッティングしないでください。
    4. 次のプログラムで設定されたサーマルサイクラーでサンプルをインキュベートする:72°C、20分;98°C、2分;98 °C, 15 秒;62 °C, 15 秒;70°C、1分(6サイクル);70°C、5分間反応が終了したらチューブを短時間遠心分離機(5s)し、生成物を4°Cで保存した。
    5. PCR 産物を 1.5 mL 遠沈管に移します (低アタッチメント)。反応終了時に97.5 μL(元のサンプル容量:ビーズ(容量)= 1:1.5)の磁気ビーズをチューブに加え、ピペットまたは穏やかにボルテックスでビーズをよく混合し、短時間遠心分離機(5 s)してすべての液体を底部まで回転させます。ビーズの凝集は避けてください。チューブをRTで5分間セットします。ビーズを分散させるためにチューブを静かにひっくり返します。
    6. 遠沈管をマグネットラックに挿入し、すべての磁気ビーズが側壁に引き寄せられ、上清が透明になるまで5分間待ちます。上澄み液を取り除き、ビーズをピペッティングしないようにして、チューブをラックに固定してください。
    7. 新しく調製した70%エタノール300μLをチューブに移し、チューブを180°の角度で2回静かに回転させ、ビーズをチューブ壁に沿って移動させて徹底的に洗浄します。ピペットで上清を捨てる。ビーズをピペッティングしないでください。
    8. 洗浄手順を 1 回繰り返します。
    9. マグネットラックから 1.5 mL 遠沈管を取り外し、短時間 (5 秒) 遠心分離します。チューブをマグネットラックに挿入し直し、すべての磁気ビーズがチューブの側壁に引き寄せられるまで5分間待ちます。底部に残っている液体を慎重にピペットで送り出します。
    10. チューブキャップを開けたままにして、RTでビーズを3〜5分間乾燥させます。ビーズから水分を逃がしてください。
      メモ:ビーズのペレットに亀裂が生じた場合は、すぐに蓋を閉めてください。
    11. 22 μLのDNA溶出バッファーをチューブにピペットで入れ、ビーズのペレットをすすぎ、キャップとボルテックスを閉じます。短時間遠心分離機(5秒)して濁った液体をチューブの底に取得し、チューブをRTで5分間セットした。
    12. 構築したDNAライブラリーの濃度を蛍光光度計11 で定量し、構築したDNAライブラリーを-20°Cで保存する。選択されたDNA断片の濃度は0.6~10 ng/μLの範囲であり、ライブラリ情報をライブラリデータベースに再コードし、それに応じてサンプルを保存します。

シークエンシングテンプレートの作製13,14

注:このセクションで使用される材料は、シーケンシング反応ユニバーサルキット(材料表)のテンプレート調製キットセット(試薬/溶液/材料)で入手できます。

  1. ライブラリミックス
    1. サーバーシステムの事前実行記録シートのフォームに記入し、サンプルチューブにライブラリ濃度とバーコード番号をタグ付けします。1 回の実行で異なるサンプルに同じバーコードを使用することは避けてください。
    2. ボルテックスとライブラリー試料を混合し、短時間遠心分離機(5秒)した。すべてのサンプルをヌクレアーゼフリーの水で100pMに希釈し、30秒間ボルテックスし、サンプルを短時間遠心分離します。
      注: DNA の平均長が 260 bp で、1 bp が 660 g/mol である場合、1 ng/μL = 5,827.5 pM/L の式を使用して、ng/μL から pM への変換を計算します。
    3. 100 pM希釈ライブラリーのピペット10 μLを1.5 mL遠沈管に入れ、30秒間ボルテックスし、2秒間短時間遠心分離した。混合ライブラリを氷の上に保管してください。
  2. テンプレートの準備
    1. テンプレート増幅システムを起動し、クリーンプログラムを選択します。反応油をチューブの1/2に加え、乳化剤破砕液をチューブの1/3に加える。
    2. 増幅プレートと洗浄アダプターが ON の位置に設定されていることを確認します。廃液瓶をきれいにし、新しい50mL遠沈管に針を入れて廃液を回収します。テンプレート増幅システムの画面で処理手順を確認します。 NEXT を押してクリーンプログラムを開始しますが、これには約15分かかります。
    3. クリーンプログラム後に増幅プレートを新しいプレートに交換し、150 μLの破砕液IIを含む収集チューブをローターに挿入し、収集チューブにブリッジを置きます。反応油をチューブの1/2に、乳化剤破砕液をチューブの1/3に加える。
    4. PCR 試薬調製物を乳化する: 乳化 PCR バッファーが溶解するまで RT で平衡化し、すべての試薬を短時間遠心分離 (5 秒) し、使用前に氷の上に置きます。
    5. 乳化 PCR 酵素ミックスのピペット 120 μL、鋳型イオンスフェア粒子 (ISP) バッファー 100 μL、ヌクレアーゼフリー水 170.5 μL、および混合ライブラリー 9.5 μL (100 pM) を、2,000 μL の乳化 PCR バッファーを含むチューブに入れます。繰り返しピペッティングで溶液をよく混合する。
      注:混合溶液は、15分以内にテンプレート増幅システムにロードする必要があります。RTですべての手順を実行します。
    6. テンプレート調製用の新しいフィルターを、サンプルポータルを上向きにしてチューブラックにしっかりと置きます。溶液を5秒間ボルテックスし、短時間遠心分離機(5s)し、800μLを3回繰り返しピペッティングした後に溶液をフィルターのサンプルポータルに移した。チューブを遠心分離して、最後の注入前に気泡を減らします。フィルターに空気を注入しないでください。以下の混合溶液に反応油IIを200μL注入する。
    7. フィルターのサンプルポータルを下向きに回し、洗浄適応をフィルターと交換します。サンプル針をローター蓋の中央の穴に挿入し、針を底に押します。
    8. 画面の RUN ボタンを押し、対応するキットに従ってプログラムを選択し、 ASSISTED を押してすべての手順を確認します。実行が開始されるまで NEXT を押します。完了するまでに約4.5時間かかります。
    9. プログラムが終了したら NEXT を押します。システムは10分間の遠心分離を開始します。遠心分離が止まったら、 蓋を開け るボタンを押して、回収チューブをラックに移動します。手順が15分以内に次のステップに進まない場合は、 Final Spin を押して再遠心分離機にします。
    10. 収集チューブ内の上清を除去し、チューブ内に100μLの溶液を残す。残りのサンプルをピペッティングで混合し、OT(ワンタッチ2システム)と表示された新しい1.5mL遠心チューブにサンプルを移します。
      メモ: 上澄み液をピペッティングするときは、チューブ底面の側面に触れないでください。
    11. それぞれの回収管にヌクレアーゼフリー水100 μLをピペットで入れ、溶液をOT管に移し、ピペッティングを繰り返して洗浄した。OTチューブにヌクレアーゼフリーの水600μLを加えて、全容量を1mLにし、30秒間ボルテックスし、15,500 x g で8分間遠心分離します。
    12. 100 μL残ったOTチューブの上清をやさしく取り除き、先端を使って油層を徹底的に廃棄します。ヌクレアーゼを含まない水 900 μL を加え、ボルテックスを 30 秒間、遠心分離機を 15,500 x g で 8 分間遠心分離します。
    13. 20 μLが残るまで上清を取り除き、テンプレート再懸濁溶液を加えて容量を100 μLにし、30秒間ボルテックスし、2秒間短時間遠心分離します。
      メモ: この手順で得られたソリューションは、12 時間以内に次の手順に進む必要があります。
    14. 電源をシャットダウンする前に、テンプレート増幅システムでクリーンプログラムを実行します。
  3. テンプレートの強化
    1. 280 μL の tween-80 および 40 μL の 1 M NaOH を含むメルトオフミックスを調製します。
    2. C1ビーズを洗う。C1ビーズ溶液を30秒間ボルテックスする。100 μL のビーズを 1.5 mL 遠沈管に移し、チューブを磁気ラックに 2 分間挿入して上清を捨てます。
    3. 1mLのC1ビーズ洗浄液をチューブに移し、30秒間ボルテックスする。短時間(5秒)遠心分離機で、チューブを磁気ラックに2分間挿入し、上清を捨てた。チューブ内にC1ビーズ再懸濁溶液130 μLをピペットで入れ、ピペッティングを繰り返してビーズを混合した。バブルの作成は避けてください。
    4. 図1に示すように、希釈ライブラリーの100 μL、C1ビーズ130 μL、300 μL x 3テンプレート洗浄溶液、および300 μLのメルトオフ溶液を8ウェルストリップに負荷します。
    5. 濃縮モジュールに 8 ウェル ストリップを取り付け、ピペッティングチップをロードし、200 μL 遠沈管を収集位置にセットします。 START を押してプログラムを実行します。所要時間は約35分です。
    6. サンプルは自動的に200μLの遠沈管に集められます。蓋を閉め、15,500 x g で5分間遠心分離します。チューブの底面をチェックして、C1ビーズが残っているかどうかを確認します。
    7. C1ビーズが残っている場合は、テンプレート溶液10xを繰り返しピペットし、チューブを磁気ラックに4分間挿入する。すべての上清を新しい0.2 mL遠沈管に移し、15,500 x g で5分間遠心分離します。
    8. 目に見えるC1ビーズが残っていない場合は、10 μLが残るまで上清を捨て、200 μLのヌクレアーゼフリー水を加え、ピペッティング10xで混合します。15,500 x g で 5 分間遠心分離します。
    9. 10 μL 残った上清を捨て、ヌクレアーゼを含まない水 90 μL を加えて全量 100 μL に達します。ピペットを 10 倍上下にして溶液を混合し、5 秒間ボルテックスし、短時間遠心分離機 (5 s) します。溶液は、2〜8°Cで3日間未満保存することができる。

次世代シーケンシング 9,15

メモ:このセクションのすべての手順は、DA8600シーケンスプラットフォーム上で実行されます。このセクションで使用される材料は、シーケンシング反応ユニバーサルキット(材料表)のシーケンシングキットセット(試薬/溶液/材料)で入手できます。

  1. ランオンシーケンシングプラットフォームに必要なすべての試薬と材料を確認してください。
    1. シーケンシング試薬:-30-10 °Cで保存したシーケンシング酵素溶液(6 μL)、シーケンシングプライマー(20 μL)、品質管理テンプレート(5 μL)、およびdGTP/dCTP/dATP/dTTP(70 μL)の可用性を確認します。
    2. シーケンシング溶液:シークエンシング溶液II(100 mL)、シークエンシングソリューションIII(50 mL)、アニーリングバッファー(1,015 μL)、ローディングバッファー(10 μL)、発泡剤(2 μL)、塩素錠剤(1錠)、およびストレプトアビジンビーズ(100 μL)の利用可能性を確認し、4°Cで保存します。
    3. 材料:RTで保存された250 mL試薬チューブ(8)、250試薬チューブキャップ(8)、シッパーII(8)、シッパー(1)、2 L試薬ボトル(1)、シーケンシングチップ(1)の入手可能性を確認します。
  2. 使用前にチップを洗ってください。
    1. 1 つのチップを作業プレートに安定してセットし、ヌクレアーゼフリーの水 100 μL をサンプル穴に注入し、アウトポータルで溶液を取り出し、手順を繰り返します。
    2. チップに100 μLの0.1 M NaOH溶液を注入し、RTで1分間インキュベートします。
    3. 100 μLのイソプロパノールをサンプルホールに注入し、アウトポータルの余分な溶液を除去して、手順をもう一度繰り返します。
    4. アウトポータルをろ紙で覆い、窒素を流してチップのフローセル内の残りのイソプロパノールを乾燥させ、すぐに使用できるチップをRTに保ちます。
  3. シーケンサーの開始
    1. 窒素バルブのスイッチを入れ、圧力を30psiに調整します。シーケンサーを起動し、メイン画面で CLEAN を押し、水または塩化物を選択してそれに応じて機械を洗浄します。
      注:毎回実行する前に水で洗うか、毎週塩化物で洗うか、機械が48時間以上の試薬で待機している時間。
    2. 塩化物洗浄:塩化物洗浄用に指定された試薬ボトルを1本選択し、18MΩの水でボトルを2回洗浄し、ボトルを1Lの18MΩ水で満たします。塩化物錠剤1錠をボトルに入れ、錠剤を10分間溶解し、1mLの1M NaOHを加え、次いでボトルを逆にして溶液を混合する。調製後3時間以内に塩化物溶液を使用してください。
    3. 塩化物溶液100 mLを0.45 μmフィルターでろ過し、2本のチューブで収集します。2 本の塩化物チューブを位置 C1 および C2 に取り付けます。メイン画面の CLEAN を押し、塩化物洗浄用のチップを装備します。
    4. NEXTを押し、画面上のすべての手順をチェックして、洗浄プログラムを開始します。プログラムは30分で終了します。塩化物洗浄後に水洗を開始する。
    5. 水洗い:水専用のチューブ2本にC1とC2のマークを付け、18MΩの水でチューブを2回洗います。各水洗浄管に18MΩの水100mLを加え、それぞれC1位とC2位にセットします。
    6. CLEANプログラムを選択し、水洗浄用に準備されたチップをインストールし、NEXTを押してから、画面上のすべての手順を確認して洗浄プログラムを開始します。
  4. 初期化
    1. 洗浄液IIで洗浄ボトルを洗浄し、W2としてマークし、18MΩの水で3回洗浄します。
    2. 窒素チューブをエアレイドペーパーで清掃し、チューブ底部に挿入し、エアフローを0.5 L/minに調整します。ボトル内の酸素を排出し、ボトルに1,920mLの18MΩ水を満たします。シーケンス溶液IIおよび10 μLの1 M NaOHをボトルに加え、キャップを閉め、ボトルを数回裏返して溶液を混合する。
    3. 2 つの新しいチューブを W1 と W3 としてマークします。W1 に 32 μL の 1 M NaOH を加え、40 ~ 50 mL の 1x シーケンス溶液 III を W3 に加え、キャップを閉じます。
      注: 1x シーケンス溶液 III は、最初に使用したときに 37 °C のウォーターバスに 30 分間入れる必要があります。シーケンスソリューションIIは、光から保護し、RTで保存する必要があります。洗浄ボトルは、20回使用した後に新しいボトルと交換する必要があります。
    4. メイン画面で INITIALIZE を押し、W1、W2、および W3 の位置のシッパーを変更し、それに応じてチューブをその位置に設定し、回転によってしっかりとシールします。初期化用のチップをインストールし、マシンの状態パラメータを確認します。
    5. NEXT を押して初期化プログラムを開始します。最初のセクションでは40分かかります。
      メモ:シッパーの本体を汚染しないように、新しいシッパーを交換する前に手袋を交換する必要があります。水洗浄と初期化に使用されると、チップは初期化に適用できますが、初期化に塩化物洗浄チップに使用されるチップは使用しないでください。
    6. 氷上でdGTP、dCTP、dATP、dTTPを溶解し、渦を混ぜ合わせます。4つの新しいチューブをG、C、A、およびTとしてマークし、チューブのタグに従って溶液のピペット70μLをピペットで留めます。
  5. 実行するためのライブラリを準備します。
    1. 品質管理テンプレート、プライマー、酵素溶液を氷の上に置きます。
    2. 初期化プログラムの残り時間が約 20 分になったら、DNA ライブラリを準備します。品質管理テンプレートを30秒間ボルテックスして混合し、2秒間短時間遠心分離します。5 μL の品質管理テンプレートをテンプレート溶液に移し、5 秒間ボルテックスし、チューブを 15,500 x g で 5 分間遠心分離します。慎重にピペッティングして上清を取り除き、ペレットに触れないようにし、チューブ内に10μLの容量を残します。
    3. 15 μLのアニーリングバッファーをチューブに加えます。溶液の全容量は25μLである。
    4. 配列プライマーが氷上で完全に溶解したらボルテックスし、2秒間短時間遠心分離する。配列プライマーの20 μLを前のステップからチューブに移し、ボルテックスを5秒間、まもなく遠心分離機で2秒間、使用前にRTで保存した。
  6. サンプルのロードとシーケンシング
    1. 前工程で調製した試料溶液55 μLをピペットで切り込み、チップの試料孔に注入する。
    2. チップを遠心分離機にセットします。切り込みを外側に、サンプルポータルを内側に保ち、別の使用済みチップとのバランスを取り、10分間遠心分離します。
    3. ローディング溶液を準備します。
      1. 1.5 mL の遠沈管で 0.5 mL のアニーリングバッファーと 0.5 mL のヌクレアーゼフリー水を混合します。50%アニーリングバッファーとしてマークし、7日以内に使用してください。
      2. 0.5 mLのイソプロパノール溶液と0.5 mLのアニーリングバッファーを混合する。50%洗浄バッファーとしてマークし、24時間以内に使用してください。
      3. 配列酵素6 μLと50%アニーリングバッファー60 μLを混合する。それを酵素反応緩衝液としてマークし、調製後に溶液を氷上に置く。
      4. 49 μL の 50% アニーリングバッファーと 1 μL の発泡剤を混合し、発泡溶液としてマークします。
    4. 発泡溶液に空気100μLを吹き込み、泡が緻密な発泡状態になるまで溶液をピペットで繰り返し、泡の体積を250μL前後に保つ。
    5. 遠心分離機後のベンチにチップを置き、サンプル穴に100μLの泡を注入し、アウトポータルの押し出された溶液を除去する。チップを遠心分離機に戻して、30秒間短時間遠心分離します。
    6. 手順 5.6.4 ~ 5.6.5 を繰り返します。
    7. 100 μL の 50% 洗浄バッファーを 2 回注入し、注入のたびにアウトポータルの押し出し溶液を除去します。
    8. 100 μL の 50% アニーリングバッファーを 3 回注入し、各注入後にアウトポータルの押し出し溶液を除去します。
    9. 65 μL の 50% 酵素反応バッファーを注入し、気泡を避け、押し出された溶液をアウトポータルから取り出します。
    10. ロードされたチップをRTで5分間安定させ、シーケンサーチップポータルにチップを取り付けます。ステップ 6 でプログラムされた計画を選択し、情報をチェックして、実行を開始します。完了するまでに約1.5時間かかります。
    11. 実行終了後 72 時間以内に水洗浄プログラムを実行します。水洗前に塩化物洗浄を行い、時間が72時間を超えた場合は水洗を行う。シーケンサーをシャットダウンし、窒素のバルブを閉じます。

6. レポーターサーバシステム16における指示されたシーケンシング実行を計画する

メモ: このセクションのすべての手順は、レポーターサーバーシステムを搭載した Ion プロトンシーケンサーで実行されます。

  1. サーバー・システムにサインインし、「プラン 」 タブを選択して、「 プラン・テンプレートの実行」をクリックします。実行タイプとして 全ゲノム を選択し、計画実行テンプレートのリストから適切なテンプレートを選択します。
  2. 「 計画」 タブで、以下の項目を入力または選択します。
    1. サンプルのバッチに従って新しい実行計画名を入力し、「参照ライブラリー」ドロップダウン・リストから「hg19 (ホモ・サピエンス)」を選択し、「ターゲット領域」ドロップダウン・リストから「なし」および「ホットスポット領域」ドロップダウン・リストから「なし」を選択します。
    2. サンプルセットで使用するバーコードの数を入力し、各サンプルのドロップダウンリストからバーコードを選択し、サンプルのグループ化と追跡に役立つ一意のわかりやすい名前を入力します。デフォルトの サンプル 1 などは使用しないでください。
    3. 「イオンレポーター」タブで「なし」を選択し、「次へ」をクリックして、アプリケーション内の「DNA」および「全ゲノム」をターゲット手法として選択します。
    4. [ キット ] タブで、選択内容を確認するか、実行に適した変更を行います。
      1. 「ライブラリキットタイプ」ドロップダウンリストから「イオンプラスフラグメントライブラリキット」を選択します。[テンプレート キット] ドロップダウン リストで [Ion PI HI-Q OT2 200 キット] を選択し、デフォルトとして [OneTouch] を選択します。「シーケンシングキット」ドロップダウンリストから「イオン PI HI-Q シーケンシング 200 キット」を選択します。
      2. 300 フローを入力し、[チップ タイプ] ドロップダウン リストから [イオン PITM チップ] を選択し、[バーコード セット] ドロップダウン リストから [IonXpress] を選択します。
      3. 「重複読み取りとして マーク 」の選択と「 再配置の有効化」の選択を取り消します。
    5. 「プラグイン」タブで適切なプラグインを選択して、ステップ 7 でデータ分析を実行します。プロジェクトステップで選択を完了し、「次へ」をクリックし、右下隅の「実行の計画」をクリックして、計画実行をリストします。
    6. [計画実行] タブで、新しく作成した実行を選択し、レビューウィンドウですべての設定を確認します。

7. データ解析

  1. バイオインフォマティクスワークフローを使用してコピー数バリアント(CNV)を分析します。
    注:CNVは、隠れマルコフモデル(HMM)に基づくアルゴリズムの実装により、バイオインフォマティクスワークフローで分析されました17。このモデルは、ゲノム全体の読み取りカバレッジを使用して、コピー数または整数の倍数性状態(すなわち、0、1、2、3など)を予測する。バイオインフォマティクスのパイプライン全体は、シーケンスサーバーシステムのプラグインで構築されました( 図2を参照)。バイオインフォマティクス分析ステップは、完了までに平均4時間かかります。

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結果

マシンで実行中のプロセスが終了した後にシーケンス計画が終了すると、シーケンス・サーバー・システムは、 図 2 に示すように、生成されたデータ、チップ状況、ISP ロード・レート、およびライブラリー品質の説明情報とともに要約を報告します。この結果実証では、全ベースで17.6Gのデータが得られ、ISPの全体的な負荷率はチップの全ウェルで88%でした。ヒートマップは、サンプルがチップの全面積に均等にロードされていることを示しました(図2A)。代表的な実行では、99,761,079の合計読み取りが得られ、77%が使用可能でした。ISPがロードされたすべての井戸では、100%がテンプレートが強化されており、78%がクローンでした。すべてのクローンテンプレートのうち、97%が最終ライブラリとして認定されました(図2B)。読み取りの平均長さは、それぞれ平均、中央値、およびモードを含む117 bp、176 bp、および174 bpでした(

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ディスカッション

胚の染色体異数性は、自然に妊娠したか体外受精(IVF)かにかかわらず、妊娠喪失の大部分の原因である。体外受精の臨床現場では、異数性の胚をスクリーニングし、倍数性胚を移入することが体外受精の結果を改善することができることが提案されている。蛍光in situハイブリダイゼーションは、性選択およびPGT-Aに採用された最も初期の技術である。しかし、この技術は実験室の職員からより多くの技術的専門知識を必要とし、比較的労働集約的である。蛍光in situハイブリダイゼーションを用いたPGT-Aの研究の増加は、出生率の改善を示さない17,18。

しかし、着床前遺伝子検査におけるコピー数解析を評価する技術の急速な進歩が行われている。さまざまな方法には長所と短所があります。定量的蛍光PCR、一塩基多型(SNP)アレイ、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション(aCGH)、次世代シーケンシングなどの新しく開発された包括的な分子技術は...

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開示事項

著者らには開示するものは何もありません。

謝辞

LIMS拡張アプリケーションに関するアドバイスをしてくれたZhangyong Ming 博士と Rongji Hou 氏に感謝します。本研究は、人民解放軍家族計画特別研究プロジェクト(17JS008, 20JSZ08)、広西チワン族自治区代謝性疾患研究基幹研究所基金(No.20-065-76)、広州市民健康科学技術研究プロジェクト(201803010034)の支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.45 μ;m シリンジフィルターユニットMerkmilliporeMillex-HV
1.5 mL DNA LoBindチューブEppendorf30108051
15 mLチューブGreiner Bio-One188261
2.0 mLDNA LoBindチューブEppendorf30108078
50 mLチューブGreiner Bio-One227261
5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)FAPON&
nbsp;Anstart Tap DNA ポリメラーゼFAPON
AMPure XP 試薬 (DNA 結合用磁気ビーズ)BeckmanA63881
https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 細胞溶解バッファーSouthern Medical University細胞溶解バッファーピロリン酸、2 mM &β;-グリセロリン酸、0.1% SDS
ClinVarNCBI
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ DNA 溶出バッファーNEBT1016L
dNTPVazymeP031-AA
DynaMag-2 MagnetLife Technologies12321D
エチルアルコール広州化学試薬工場 サーモフィッシャー科学http://www.chemicalreagent.com/
独自に開発した全ゲノム増幅試薬南部医科大学試薬は、以下の成分で構成されています:
1.細胞溶解
2.増幅プレミックス溶液
   1) プライマー WGA-P2 (10 μM)
   2) dNTP (10 mM)
   3) 5x Anstart Taq バッファー (Mg2+ Plus)
3.増幅酵素
   1) Anstart Tap DNAポリメラーゼ(5 μ;L)
Ion PI Hi-Q OT2 200 KitThermo Fisher ScientificA26434ステップ 4.2.8 で言及
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit  サーモフィッシャーサイエンティフィックA26433
イオンプロトンシステムライフテクノロジー4476610
イオンレポーターサーバーシステムライフサイエンス4487118
イソプロパノール広州化学試薬工場http://www.chemicalreagent.com/
ライブラリ準備キットDaan Gene Co.、Ltd114https://www.daangene.com/pt/certificate.html
NaOHSigma-AldrichS5881-1KG
Nuclease-Free WaterLife TechnologiesAM9932
Oligo WGA-P2Sangon Biotech5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN
NNNNATGTGG-3'OneTouch
2 SystemLife Technologies4474779 テンプレート、増幅および濃縮システム
、PCRチューブ、AxygenPCR-02D-C
PicoPLEX、WGAキットタカラバイオUSA、R300671
ピペットチップ、高品質の科学製品https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
ポータブルミニ遠心分離機、LX-300QilinbeierE0122
Qubit 3.0蛍光光度計Life TechnologiesQ33216蛍光光度計
Qubit Assay TubesLife TechnologiesQ32856
Qubit dsDNA HS Assay KitLife TechnologiesQ32851
シーケンサーサーバーシステムThermo Fisher ScientificTorrent Suite Software
Sequencing Reactions Universal KitDaan Gene Co., Ltd113https://www.daangene.com/pt/certificate.html
このキットには、次のコンポーネントが含まれています:
1.テンプレート調製キットセット

1.1 テンプレート調製キット:
エマルジョンPCRバッファー
エマルジョンPCR酵素ミックス
テンプレートキャリア溶液

1.2 テンプレート調製溶液:
テンプレート調製反応油 I
乳化剤破砕液 II
テンプレート調製反応油 II
ヌクレアーゼフリー水
Tweensolution
解乳化液 I
テンプレート洗浄液
C1ビーズ洗浄液
C1ビーズ再懸濁液
テンプレート再懸濁液

1.3 テンプレート調製材料:
試薬チューブ I
コネクタ
採取チューブ
試薬チューブピペット I
増幅プレート
8ウェルストリップ
専用ヒント
テンプレート準備洗浄アダプター
テンプレート準備フィルター

2.シーケンシングキットセット

2.1 シーケンシングキット:
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
シーケンシング酵素溶液
シーケンシングプライマー
品質管理テンプレート

2.2 シーケンシングソリューション:
シーケンシングソリューション II
シーケンシングソリューション IIII
アニーリングバッファー
ローディングバッファー
発泡剤
塩素錠剤
C1ビーズ

2.3 シーケンシング材料:
試薬チューブ II
試薬チューブキャップ
試薬チューブシッパー II
試薬ボトル シッパー
試薬ボトル

3.チップ
酸化ナトリウム溶液シグマ72068-100ML
サーマルサイクラーライフテクノロジー4375786
40 mM Tris (pH 8)、100 mM NaCl、2 mM EDTA、1 mM エチレングリコール四酢酸 (EGTA)、1% (v/v) Triton X-100、5 mM ナトリウムを含む した 、、、、、水

参考文献

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  10. PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA. , Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019).
  11. Qubit® 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf (2014).
  12. Ion AmpliSeq™ DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf (2019).
  13. Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf (2015).
  14. Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf (2017).
  15. Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf (2017).
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