方法論記事

マウス頸部異所性心臓移植モデルのための修正カフ法

DOI：

10.3791/63504

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2022年2月7日

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1Department of Urological Oncology Surgery, Chongqing University Cancer Hospital, 2School of Medicine, Chongqing University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Basic Medical Science, Army Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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本プロトコールでは、心臓同種移植片拒絶反応のメカニズムを調べるためにマウス心臓移植モデルが用いられる。この異所性心臓移植モデルでは、手術効率が向上し、修正カフ技術を用いた心臓移植の頸部エンドツーエンド吻合によって心臓移植片の生存が確保されます。

要約

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心臓同種移植片拒絶反応は、心臓移植後の患者の長期生存を制限します。マウス心臓移植モデルは、ヒト遺伝子との相同性が高いため、前臨床試験における心臓同種移植片拒絶反応のメカニズムを調べるのに最適です。この理解は、心臓同種移植片で治療された患者の長期生存を改善するための独自のアプローチを開発するのに役立ちます。マウスモデルでは、腹部ドナー心臓移植は、通常、ステッチを使用してレシピエントの大動脈および下大静脈にエンドツーエンドの吻合で行われます。このモデルでは、ドナーの心臓は、修正カフ技術によってレシピエントの頸動脈と頸静脈にエンドツーエンドの吻合によって移植されます。移植手術は縫合せずに行われるため、血液供給や下半身の静脈逆流に干渉しないため、レシピエントの生存率を高めることができます。このマウスモデルは、心臓同種移植片の免疫学的および病理学的(急性/慢性)拒絶反応の根底にあるメカニズムを調査するのに役立ちます。

概要

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心臓移植は末期心不全の標準的な治療法となっています。国際心臓肺移植学会に登録されている組織では、年間5,500件以上の心臓移植が行われています。同種異系心臓移植レシピエントでは、1年間の拒絶率は依然として>10%ですが、3年間の拒絶率は36%に増加しました1,2。しかし、心臓同種移植片拒絶反応を有する患者に対する効果的な予防的治療は不足している。したがって、心臓同種移植片の免疫学的および病理学的拒絶の根底にある生理学的メカニズムを解明する動物モデル研究が保証されています。このような研究は、効果的な薬剤の開発に必要な新規標的の調査に貢献し、心臓同種移植片拒絶反応を防ぎ、これらの患者集団の生存率を改善するのに役立ちます。

心臓同種移植片拒絶反応のいくつかの潜在的な免疫学的および病態生理学的メカニズムが、異所性心臓移植のマウスモデル研究において最近提案されている3,4,5。その結果、マウスヘテロトピック心臓移植は、ヒト遺伝子との相同性が高いため、心臓移植後の心臓同種移植片で発生する免疫拒絶反応と病理学的損傷のメカニズムを調べるための理想的な前臨床モデルになりました。一般的な概念は、通常の人体解剖学的構造と同様に、ステッチを使用してレシピエント大動脈と下大静脈の腹部エンドツーエンド吻合によってマウスモデルで異所性移植を行うことです。しかしながら、この手順は、レシピエントの血液供給および下半身6の静脈逆流を妨げる可能性がある。したがって、マウスモデルにおける修正異所性心臓移植手順がここで提案される。

ドナーの心臓には、修正されたカフ技術を使用したエンドツーエンドの頸部吻合によって、レシピエントの頸動脈と頸静脈が埋め込まれます。この修正された手順は、手術の実現可能性を促進し、下半身の血液供給および静脈逆流を妨げることなく心臓移植片の生存を確保した。

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プロトコル

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すべての動物実験は、実験動物の世話と使用のためのガイド、第8版、国立研究評議会(米国)2011に準拠して実施されました。動物を対象とする手順は、中国の重慶にある重慶大学がん病院の動物管理および使用委員会によって承認されています。市販の供給源から入手した体重20〜30gの雄のBALB / cおよびC57BL / 6マウス( 材料の表を参照)を同種異系心臓移植研究に使用しました。C57BL/6マウスはドナーおよび同系レシピエントとして使用され、BALB/cマウスは同種異系レシピエントとして使用されました。プロトコルの概略図を 図1に示します。
注意: 手術器具や溶液を含む、手術中に使用されるすべての消耗品は無菌です。外科的処置は、無菌手術技術の原則に準拠しています。

1. 受取手続き

  1. フードに接続された15 x 10 x 10 cmの誘導チャンバーを通して5%イソフルランを吸入 することにより 全身麻酔を誘発します( 材料の表を参照)。
  2. 受信者のマウスを加熱パッドで手術台に固定します。鼻と口の上のフェイスマスクを通して2%イソフルランの連続吸入で麻酔を維持します。.
    注:呼吸数とリズムが遅いこと、角膜反射が消失していること、およびつま先にペダル反射がないことは、麻酔の有効性を示しています。
  3. 髪を剃った後、ポビドンヨードスクラブとそれに続くアルコールの3ラウンドを交互にラウンドして手術領域を消毒します。次に、右下顎角から尾端まで頸部の正中線に平行に1.5〜2 cmの皮膚を切開します。
  4. 電気凝固装置とマイクロ鉗子を使用して右外頸静脈の~1cmを解剖します。近位端の静脈を非外傷性微小血管クランプでクリップし、遠位端で結紮します。
  5. 静脈の遠位端を、ベベル端と表面溝のある22 Gポリウレタンとげのあるカフ( 材料表を参照)に通します。微小血管クランプを使用してカフのハンドルで静脈を固定します。
  6. 8-0を削除します遠位端の結紮縫合糸、表面のとげで引っ掛けられたカフの上に内腔を裏返し、表面の溝に10-0の外科用縫合糸で固定します。
  7. 右舌下腺を切除して心臓移植片を移植するための窩を形成し、顎下腺の右葉と右胸鎖乳突筋を予約します。
  8. マイクロ鉗子を使用して右総頸動脈を~1 cm解剖し、近位端の非外傷性微小血管クランプで動脈をクリップします。遠位端で、動脈を結紮して切断します。
  9. 動脈の遠位端を、ベベル端と表面に溝がある26 Gのポリウレタンとげのあるカフ( 材料の表を参照)に通します。微小血管クランプを使用して、カフのハンドルで動脈を固定します。
  10. 遠位端の結紮縫合糸を取り外し、内腔をカフの上で裏返しにし、10-0外科用縫合糸で表面的なとげと溝で固定します。
  11. レシピエントの血管を準備した後、血栓症を防ぐために100IU / mLのヘパリン生理食塩水を血管に落とします。その後の移植のために、頸部切開部を滅菌済みの湿った生理食塩水ガーゼで覆います。

2. 寄付者の手続き

  1. ドナーマウスに同じ麻酔手順(ステップ1.1)を採用します。
  2. 電気かみそりを使用して腹毛を剃り、ポビドンヨードスクラブとそれに続くアルコールを交互に3回に分けて手術部位を消毒します。
  3. 腹部(2〜3 cm)を恥骨結合から恥骨下への正中線に沿ってハサミで切開し、開創器で切開領域を広げます。
  4. 電気凝固装置と微小鉗子を用いて腹部大動脈と下大静脈1cmを解剖し、下大静脈からヘパリン250IU/mLを添加した生理食塩水1mLを注入してヘパリン化を行う。この後、腹部大動脈と下大静脈を切除します。
  5. 外科用ハサミを使用して両側の前腋窩線に沿って胸部を切除し、胸壁を分離します。上大静脈を8-0で結ぶ外科用縫合糸。
  6. 肝上下大静脈に頭皮針を挿入します。次に、肝上下大静脈から頭皮針に100IU / mLのヘパリンを添加した氷冷生理食塩水を注入し、血液の色が薄くなるまでドナーの心臓に灌流します。
  7. ドナー心筋を保護するために、大動脈弓から頭皮針を使用して、2〜3 mLの氷冷ヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸(HTK)溶液( 材料の表を参照)でドナー心臓を再灌流します。平均温虚血時間は5分です。
  8. 上大静脈と下大静脈と肺静脈を5-0の外科用縫合糸で結紮します。分岐する前にドナー大動脈と肺動脈を解剖して切断します。その後、上大静脈と下大静脈と肺静脈を分けてドナーの心臓を取り除きます。

3.移植

  1. ドナーの心臓をレシピエントマウスの頸部ポケットに逆さの位置で移植します。
  2. エバーテッドレシピエント頸静脈でカフをドナー肺動脈の内腔に引き込み、ドナー肺動脈をレシピエントの外頸静脈にエンドツーエンドで吻合します。吻合を固定するために、10-0外科用縫合糸を通して表面の溝を使用してカフを結紮します。
  3. レシピエント頸動脈へのドナー大動脈のエンドツーエンドの吻合にも同様の手順を採用します。
  4. 頸静脈の非外傷性微小血管クランプを解放し、続いて頸動脈を解放して、ドナーの心臓を再灌流します。平均寒冷虚血時間は15分です。
  5. 心臓移植片を固定し、移植片のねじれを防ぐために適切に縫合します。
  6. 5-0ポリアミドモノフィラメント縫合糸を使用して、連続縫合糸で頸部切開を閉じます(材料の表を参照)。
    注意: 傷が完全に治癒したら、縫合糸を取り外します。
  7. 麻酔から回復するまで、レシピエントマウスを暖かく乾燥した清潔なケージに入れたままにします。
    注意: 回復には5〜10分かかります。
  8. 術後鎮痛のために、ブプレノルフィン(0.05 mg / kg)をレシピエントマウスに6時間ごとに48時間皮下注射します。.
    注:鎮痛剤の投与量は、この研究のために最適化されました。ただし、鎮痛レジメンは、施設の動物使用ガイドラインに従って痛みの兆候がある場合は延長/変更できます。

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結果

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このマウス子宮頸部異所性心臓移植モデルでは、レシピエントマウスの生存率は約95.2%でした(21匹中20匹が生存しました)。主な死因は術後出血でした。規則的なリズムを伴う速い心拍は、移植されたドナー心臓の生存の指標として役立つ。

C57BL/6およびBALB/cマウスは、このモデルにおいてMHC(H-2b)およびMHC(H-2d)タイプであり、それぞれ7,8であった。これら2つの株は、急性T細胞媒介拒絶反応を引き起こすH-2によって異なる9。すべての心臓同種移植片のうち、心拍を触診して評価したように、62.5%が移植後7日以内に失われました。すべての心臓同種移植片は移植後8日以内に失われました。対照的に、すべての同種心臓移植は4週間を超えて生存しました(図2)。4週間を超えて生存したマウスを、CO2吸入により安楽死させた。

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ディスカッション

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マウス心臓移植モデルは、心臓移植後の拒絶反応メカニズムの解明に貢献し、心臓同種移植レシピエントの長期生存率を向上させる独自のアプローチの開発に貢献しています。しかし、マウスの心臓移植は複雑で困難な作業であり、特に血管吻合において、高度な顕微手術技術が必要です11、12、13。マウス腹部異所性心臓移植モデルは、レシピエント大動脈および下大静脈へのドナー大動脈および肺動脈の吻合によるステッチを用いて行われる。この手術では、レシピエントの大動脈と下大静脈をブロックする必要があります。したがって、下半身の虚血および下大静脈の血栓症は、レシピエントマウスの障害および死亡を増加させる可能性がある。移植中の血管吻合の困難を軽減するために、松浦らは1991年にカフ技術を使用してマウスに頸部心臓移植モデルを最初に導入しました14。このモデルでは、カフとの結紮による血管のオーバースリーブ状のエバーテッド吻合が吻合効率を高めた...

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開示事項

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著者は開示するものは何もありません。

謝辞

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この研究は、中国国家自然科学財団(81870304)からJun Liの支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
 5-0 ポリアミドモノフィラメント縫合糸B.Braun Medical Inc.C3090954
 8-0ポリアミドモノフィラメント縫合糸B.Braun Medical Inc.
10-0ポリアミドモノフィラメント縫合糸B.Braun Medical Inc.
22 G ポリウレタン カフB.Braun Medical Inc.4251628-02
26 Gポリウレタンカフ蘇州Linhua Medical Instrument Co.、LTDREF383713
麻酔誘導室RWDライフサイエンス株式会社、株式会社V100
非外傷性微小血管クランプBeyotimeFS500
BALB / cおよびC57BL / 6マウス(20–30 g)Centre of Experimental Animals(陸軍医科大学、重慶、中国)
BuprenorphineUS Biological life Sciences352004
ElectrocoagulatorGuangzhou Runman Medical Instrument Co., LtdZJ1099
GauzeHenan piaoan group Co., Ltd10210402
Heating padGuangzhou Dewei Biological Technology Co.,株式会社DK0032
ヘパリン北中国薬剤Co.、株式会社2101131-2
HTKの解決シンセンChangyiの薬剤Co.、株式会社YZB/Min8263-2013
の注入のシリンジ(10のmL)山東weigaoのグループ医学ポリマーCo.、株式会社20211001
イソフルランRWDの生命科学Co.、株式会社21070201
生理食塩水南西製薬株式会社H50021610
頭皮針Hongyu Medical Group20183150210
ShaverBeyotimeFS600
小動物麻酔器RWD Life Science Co., LtdR500
外科手術顕微鏡Tiannuoxiang Scientific Instrument Co. , Ltd, 北京, 中国SZX-6745
綿棒Yubeiの医学材料Co.、株式会社21080274
C2090880G0090781

参考文献

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