脱髄の動物モデルにおける磁気活性化細胞選別によるマウス原発性ミクログリアの単離

サマリー

ここでは、柱状磁気活性化細胞選別を利用して、脱髄疾患の動物モデルにおける原発性ミクログリアを単離および精製するためのプロトコルを提示する。

要約

ミクログリアは、脳内の常在する自然免疫細胞であり、中枢神経系(CNS)の炎症または傷害に対する主要な応答因子である。ミクログリアは安静状態と活性化状態に分けることができ、脳の微小環境に応じて急速に状態を変化させることができる。ミクログリアは、異なる病理学的条件下で活性化され、異なる表現型を示す。さらに、活性化ミクログリアの多くの異なるサブグループおよび異なるサブグループ間の大きな不均一性が存在する。不均一性は、主にミクログリアの分子特異性に依存する。研究は、ミクログリアが活性化され、炎症性脱髄の病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たすことを明らかにした。多発性硬化症や神経脊髄炎視神経スペクトラム障害などの炎症性脱髄疾患におけるミクログリアの特徴をよりよく理解するために、我々は病変周囲一次ミクログリア選別プロトコルを提案する。このプロトコルは、柱状磁気活性化細胞選別(MACS)を利用して高度に精製された原発性ミクログリアを取得し、ミクログリアの分子特性を保存して、炎症性脱髄疾患におけるミクログリアの潜在的な影響を調査する。

概要

ミクログリアは卵黄 - 嚢前駆細胞に由来し、非常に早期に胚性脳に到達し、CNS ^1,2の発達に関与する。例えば、彼らはシナプス剪定³と軸索成長⁴の調節に関与しています。それらはニューロンの生存を促進し、ニューロンの局^{在化を助ける}因子を分泌する5。同時に、異常な細胞やアポトーシス細胞の除去に関与し、正常な脳の発達を確保し^{ています6}。さらに、脳の免疫コンピテント細胞として、ミクログリアは脳実質を継続的に監視し、死細胞、機能不全シナプス、および細胞破片を除去する⁷。ミクログリアの活性化は、炎症性脱髄疾患、神経変性疾患、脳腫瘍など、さまざまな疾患において重要な役割を果たしていることが実証されています。多発性硬化症(MS)における活性化ミクログリアは、希突起膠細胞前駆細胞(OPC)の分化およびミエリン破片8を包み込むことによってミエリンの再生^{に寄与する。}

アルツハイマー病(AD)では、アミロイドベータ(Aβ)の蓄積がミクログリアを活性化し、ミクログリアの貪食および炎症機能に影響を及ぼす⁹。グリオーマ関連ミクログリア(GAM)と呼ばれるグリオーマ組織中の活性化ミクログリアは、グリオーマの進行を調節し、最終的に患者の予後に影響を与える可能性がある¹⁰。この活性化はミクログリアトランスクリプトームを深く変化させ、形態学的変化、免疫受容体の発現、貪食活性の増加、およびサイトカイン分泌の増強をもたらす¹¹。疾患関連ミクログリア(DAM)、活性化応答ミクログリア(ARM)、およびミクログリア神経変性表現型(MGnD)などの神経変性疾患における活性化ミクログリアの異なるサブセットが存在する⁸。

同様に、ミクログリアの複数の動的機能サブセットも、炎症性脱髄疾患¹²において脳内に共存する。ミクログリアの異なるサブセット間の不均一性を理解することは、炎症性脱髄疾患の病因を調査し、それらの潜在的な治療戦略を見つけるために不可欠である。ミクログリアの不均一性は、主に分子特異性⁸に依存する。ミクログリアの分子変化を正確に記述することは、不均一性の研究に不可欠である。単一細胞RNAシーケンシング(RNA-seq)技術の進歩により、病理学的状態における活性化ミクログリアの分子特性の同定が可能になった¹³。したがって、細胞集団を単離する能力は、特定の条件下でこれらの標的細胞をさらに調査するために重要である。

ミクログリアの特徴と機能を理解するために行われる研究は、培養フラスコに付着し、他の混合グリア細胞と共にプラスチック表面上で増殖するマウスの子犬脳(1〜3日齢)から多数の初代ミクログリアを調製および培養できることが見出されているので、通常 、インビトロ 研究である。続いて、純粋なミクログリアは、混合グリア細胞^14、15の異なる接着性に基づいて単離され得る。しかし、この方法は周産期脳からミクログリアを単離することしかできず、数週間かかる。細胞培養における潜在的な変数は、分子発現¹⁶などのミクログリア特性に影響を与え得る。さらに、これらの方法で単離されたミクログリアは、CNS疾患の状態をシミュレートすることによってのみ インビトロ 実験に参加することができ、 in vivo 疾患状態におけるミクログリアの特徴および機能を表すことができない。したがって、成体マウスの脳からミクログリアを単離する方法を開発する必要がある。

蛍光活性化細胞選別(FACS)と磁気分離は、広く使用されている2つの方法ですが、それぞれ異なる制限があります^16,17,18,19。それぞれの長所と短所は、議論のセクションで対比されます。MACS技術の成熟は、細胞を迅速に精製する可能性を提供する。Huangらは、脳内の脱髄病変を標識する便利な方法を開発した²⁰。これら2つの技術的アプローチを組み合わせることで、我々は迅速かつ効率的な柱状CD11b磁気分離プロトコルを提案し、成体マウス脳の脱髄病変の周りのミクログリアを単離し、ミクログリアの分子特性を保存するための段階的な説明を提供する。局所脱髄病変は、プロトコル²¹を開始する3日前に脳梁に2μLのリゾレシチン溶液(0.9%NaCl中の1%LPC)を定位注射することによって引き起こされた。このプロトコルは、インビトロ実験で次のステップを実行するための基礎を築きます。さらに、このプロトコルは時間を節約し、さまざまな実験で広く使用するために実現可能です。

プロトコル

すべての動物の手順は、同済医科大学の動物ケア委員会研究所、華中科技大学、中国によって承認されています。

1. 素材

1. プロトコルを開始する前に、次の解決策を準備します。
   1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)にウシ胎児血清(FBS、2%)を加えてローディングバッファーを調製する。
   2. ニュートラルレッド(NR)色素(最終1%)をPBSに加える。
2. 市販の成人脳解離キットを用いて以下の溶液を調製する( 材料表参照)。
   1. 酵素ミックス1を調製するために、1.9 mLのバッファーZおよび50 μLの酵素Pを15 mLの遠沈管にピペットで入れた。
   2. 酵素ミックス2を調製するには、20 μLのバッファーYと10 μLの酵素Aを1.5 mLの微量遠心チューブにピペットで入れます。
   3. 破片除去液を準備する。

2.マウスの灌流と解剖

1. 腹腔内(すなわち)麻酔の2〜3時間前にPBS中の500μLの1%NR色素をマウスに注射する。
   注:脱髄マウスモデルにおけるNRの腹腔内注射は、病変の識別に役立つ(図1)。
2. マウスをペントバルビタール(50mg/kg、i.p.)で麻酔し、疼痛反応を調べることによってマウスが正常に麻酔されていることを確認する。
3. マウスの胸腔を開き、心臓を露出させる。
4. 右心房の小さな角を慎重に切り取り、左心室から20〜30mLの冷たいPBSでマウスを心臓内に灌流する。
5. 麻酔下でマウスを斬首する。
6. マウスの頭蓋骨を開き、慎重に頭蓋骨から脳を解放します。
7. 脳をマウス脳スライス型に移し、脳を0.1cmスライスに切断する。
8. 脳のスライスを取り除き、ペトリ皿(60/15mm)の冷たいPBSに入れます。脳梁の周囲のNR色素で標識された病変部を顕微手術用鉗子を用いて実体顕微鏡下で微小解剖する。
   注:その後の移送を容易にするために、解剖された組織ができるだけ完全であることを確認してください。解剖の全進行は2時間で完了する必要があります。
9. 解剖した組織を、適量のコールドローディングバッファーを含む15mL遠沈管に移す。
   注:2〜3匹のマウスの脳梁組織を1つのサンプルとして1本のチューブにまとめる。

3. 組織解離

1. 解剖した組織を300×gで30秒間遠心分離し(この速度に達した後)、チューブの底部でサンプルを回収した。
2. 酵素ミックス1および酵素ミックス2をインキュベーター内で37°Cに予熱する。
3. 1,950 μLの予熱酵素ミックス1を1つのサンプルに加え、37°Cのインキュベーターで5分間消化する。
4. 予熱した酵素ミックス2を30μL加え、優しく混ぜる。
5. 37°Cのインキュベーターで15分間消化し、5分ごとに穏やかに混合する。
6. 消化後に4mLの冷たいPBSをチューブに加え、優しく振る。
7. 70 μm のフィルターを 50 mL の遠沈管に置き、フィルターを 500 μL の冷たい PBS でプリウェットします。消化した組織サンプルをフィルターに通すことによって解離した組織をろ過し、50 mL遠沈管内のろ過懸濁液を15 mL遠沈管に移した。
   メモ: 組織の量が少なすぎる場合は、この手順をスキップしてください。
8. 濾過した組織サンプルを300×g で4°Cで10分間遠心分離し、上清をゆっくりと完全に吸引する。
   注:酵素消化を除くすべてのステップは氷上で実行する必要があります。

4. がれきの除去

1. 細胞ペレットを1,550 μLの冷たいPBSで穏やかに再懸濁する。
2. 破片除去のために450μLの低温溶液を加え、よく混合する。
3. 上記の混合物を、1,000 μLのピペットを使用して2 x 1 mLの冷たいPBSで非常にゆっくりと穏やかに重ねます。
   注:遠沈管を45°傾け、ピペットで管壁に沿ってPBSをゆっくりと加えます。
4. チューブをゆっくりと穏やかに遠心分離機に移し、4°Cおよび3,000× g で10分間スピンする。
5. 遠心分離後に3つの層を探します。1,000 μLのピペットを使用して、2つの最上層を完全に吸引します(図2)。
6. チューブを5 mLまでのコールドローディングバッファーで満たし、チューブを静かに3回反転させます。
7. 4°Cで1,000× g で10分間遠心分離する。上清を完全に吸引し、細胞ペレットを乱さないでください。

5. ミクログリア細胞の磁気分離

1. 細胞ペレットを90 μLのローディングバッファーで再懸濁し、10 μLのCD11b(ミクログリア)ビーズを加える。
2. よく混ぜ合わせ、4°Cで15分間インキュベートする。
3. 1 mLのローディングバッファーとピペットを加え、液体を1,000 μLのピペットで穏やかに上下させ、インキュベーション後の細胞を洗浄した。細胞を4°C、300×g で10分間遠心分離し、上清を完全に吸引して未結合ビーズを除去した。
4. 細胞を500 μLのローディングバッファーに再懸濁する。
5. MSカラムとそのセパレータを配置して、磁場中で正の選択を行います。
6. カラムを 500 μL のローディングバッファーですすぎ、細胞を保護し、メーカーのプロトコルに基づく磁気選別効率を確保します。
7. 細胞懸濁液をMSカラムに塗布し、標識されていない細胞を含むフロースルーを破棄します。
8. 500 μL のローディングバッファーをカラムに 3 回加えて、カラム壁に付着した細胞を洗い流し、フロースルーを廃棄します。
   注: カラムリザーバが完全に空である場合にのみ、洗浄用の新しいローディングバッファを追加してください。
9. カラムを洗浄した後、カラムを分離器から取り出し、15 mL 遠沈管の上に置きます。
10. 1 mL のローディングバッファーをカラムに加え、プランジャーをカラムの底部に押し込んで磁気標識された細胞を洗い流します。この工程を3回繰り返して、磁気標識された細胞を完全に回収する。

結果

CD11bビーズを用いて単離されたミクログリアは高純度である
脱髄マウスモデルにおける病変の周囲のミクログリア細胞を、上述のプロトコールを用いて単離し、フローサイトメトリーによって試験した。細胞をCD11b-フルオレセインイソチオシアネート(FITC)およびCD45-アロフィコシアニン(APC)で蛍光標識し、製造業者の指示に従ってフローサイトメトリーでミクログリアを決定する。CD11bおよびCD45抗体が単離ミクログリア^19、22の純度をチェックするのに十分であることを実証する複数の文献がある。蛍光補償を、未染色および単一染色対照サンプルを用いてフローサイトメーター上で完了した。細胞を前方散乱高さ(FSC−H)および側方散乱高さ(SSC−H)によってゲーティングした;単一細胞を前方散乱領域(FSC−A)およびFSC−Hによってゲーティングした。磁気分離の前後のミクログリア(CD11b ⁺ CD45^中間体として同定される)の割合をフローサイ...

ディスカッション

このプロトコルは、脱髄病変の周囲のミクログリアを単離する方法を提案しており、これは炎症性脱髄疾患におけるミクログリアの機能的特徴の研究に役立つ可能性がある。CD11bビーズを用いて捕捉されたミクログリアは、高純度および生存率を示す。プロトコルの重要なステップには、病巣の正確な局在化と最適なミクログリア精製が含まれます。プロトコルステップ2.1では、病変を正確に表示できるようにマウスを犠牲にする前にNR溶液を2時間注射する必要がある²⁰。プロトコールステップ2.8では、解剖のために脳組織切片を氷箱の上に置き、できるだけ早くこのステップを完了し、それによって細胞生存率を改善するように注意が払われた。ステップ2.9では、酵素消化とデブリ除去の両方のために、適切な組織を1つのサンプルとして選択する必要があります。ステップ3.7は、破片除去の効果が十分でない場合、スキップすることはできません。ステップ4.3では、PBSの添加は、異なる層を形成するために穏やかでなければならず、できるだけ多くの破片が除去されるようにしなければならない。酵素消化を除くプロトコルのすべてのステップは、細胞の生存率を確保し、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mLマイクロ遠心チューブ	BIOFIL	CFT001015
15 mL遠心チューブ	BIOFIL	CFT011150
50 mL遠心チューブ	BIOFIL	CFT011500
70 & micro;m フィルター	Miltenyi Biotec	130-095-823
成人脳解離キット、マウスおよびラット	Miltenyi Biotec	130-107-677
マウス	SJA Labs
CD11b (ミクログリア) ビーズ、ヒトおよびマウス	Miltenyi Biotec	130-093-634
ウシ胎児血清	BOSTER	PYG0001
FlowJo	BDBiosciences	V10
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MiniMACS セパレーター	Miltenyi Biotec	130-042-102
MS カラム	Miltenyi Biotec	130-042-201
ニュートラル レッド	Sigma-Aldrich	1013690025
NovoCyte Flow Cytometer	Agilent		A システムさまざまな部品の
NovoExpressア	ジレント	1.4.1
PBS	ボスター	PYG0021
ペントバルビタール	シグマアルドリッチ	P-010
実体顕微鏡	MshOt	MZ62