共培養からの侵襲的細胞亜集団のリアルタイム検出と捕捉

サマリー

侵襲的な細胞亜集団をリアルタイムで検出して捕捉するアプローチについて説明します。実験計画では、セルの電気インピーダンスの変化を監視することによってリアルタイムセルラー解析を使用しています。浸潤性癌、免疫、内皮または間質細胞を複雑な組織に捕捉することができ、共培養の影響を評価することができる。

要約

癌細胞の浸潤および転移性拡散は、癌による死の主な原因である。癌細胞集団の浸潤性ポテンシャルを測定するために早期に開発されたアッセイは、典型的には、異なる浸潤ポテンシャルを有するがん細胞サブポピュレーションを区別しない単一のエンドポイント測定を生成する。また、腫瘍微小環境は、癌細胞の浸潤挙動を変化させ、関与する異なる常在間質および免疫細胞からなる。組織への侵入はまた、組織リモデリングおよび血管新生の間に微生物をかわすか、または実質および内皮細胞から罹患細胞を排除する免疫細胞亜集団において役割を果たす。インピーダンスバイオセンサーを利用して細胞浸潤を監視するリアルタイム細胞解析(RTCA)は、エンドポイントの浸潤測定を超えた大きな前進でした:これは、時間の経過とともに継続的な測定を提供し、エンドポイントアッセイで失われる浸潤率の違いを明らかにすることができます。現在のRTCA技術を使用して、間質および/または免疫細胞を含むことができ、共培養間質または免疫細胞からの分泌因子の影響下での浸潤速度を経時的に測定できるさらなるチャンバーを追加することによって、デュアルチャンバーアレイを拡張した。これを超えて、このユニークな設計により、いつでもチャンバーを剥離し、最も浸潤性の高いがん細胞、または試験した腫瘍分離株の不均一な混合物中に存在する他の細胞亜集団を単離することができます。これらの最も浸潤性の高いがん細胞および他の細胞亜集団は、転移性疾患への悪性進行を駆動し、それらの分子特性は、詳細な機構的研究、それらの検出のための診断プローブの開発、および脆弱性の評価にとって重要である。したがって、小分子または大分子の薬物の包含は、(例えば、癌細胞)浸潤行動を阻害または増強する(例えば、免疫細胞)ことを目的として、癌および/または間質細胞亜集団を標的とする治療法の可能性を試験するために使用することができる。

概要

細胞浸潤は、間質細胞によって提供される環境的手がかりに応答して、細胞が基底膜障壁を通過することを可能にする重要なプロセスである。これは、免疫応答、創傷治癒、組織修復、および局所病変から浸潤性および転移性癌に進行する可能性のある悪性腫瘍の発達のいくつかの段階における重要なステップである¹。細胞集団の侵襲的可能性を測定するために早期に開発されたアッセイは、典型的には、単一のエンドポイント測定を生成するか、または侵襲的細胞の事前標識を必要とする²。マイクロエレクトロニクスとマイクロフルイディクス技術の統合は、微小電極^3,4上の生細胞の電気インピーダンスを使用して、生存率、動き、および付着などの細胞生物学のさまざまな側面を検出するために開発されています。インピーダンス測定により、ラベルフリー、非侵襲的、定量的な細胞状態の評価^{が可能になります3}。ここでは、Abassiらによって開発されたリアルタイム細胞解析(RTCA)システムの設計に基づく3チャンバーアレイについて説明します^。3チャンバーアレイは、細胞侵入に関する共培養細胞の評価および追加の分析または拡張のための侵襲性細胞の回収を可能にする。

細胞分析システムでは、細胞は多孔性膜上にコーティングされた細胞外マトリックスを介して侵入し、障壁の反対側に位置するデジタル化された電極アレイに到達する。侵襲的なセルが時間の経過とともにこの電極アレイを取り付けて占有し続けると、電気インピーダンスは並列に変化します。現在のシステムは、2つのチャンバーを有する細胞浸潤および遊走(CIM)16ウェルプレートを含む。RTCA-DP(デュアルパーパス)(以下、デュアルパーパスセルアナライザと呼ぶ)機器には、インピーダンス測定用のセンサと、インピーダンスデータを分析および処理するための統合ソフトウェアが含まれています。ベースラインでのインピーダンス値は、ウェル内の培地のイオン強度に依存し、細胞が電極に付着するにつれて変化します。インピーダンスの変化は、細胞の数、その形態、および細胞が電極に付着する程度に依存する。細胞が添加される前の培地を含むウェルの測定は、バックグラウンドシグナルとみなされます。バックグラウンドは、セルが電極に付着および拡散して平衡に達した後のインピーダンス測定から差し引かれます。セルインデックス(CI)と呼ばれる電極上のセルの状態の単位のないパラメータは、CI =(平衡後のインピーダンス - セルの非存在下でのインピーダンス)/公称インピーダンス値⁶のように計算されます。異なる細胞株の遊走速度を比較する場合、デルタCIを使用して、最初の数回の測定で表された付着の違いに関係なく、細胞の状態を比較することができます。

新しく設計された3チャンバーアレイは、既存の設計に基づいて構築され、電極を含むデュアルパーパスセルアナライザシステムのトップチャンバを使用します。修正された中央チャンバとボトムチャンバは、統合されたソフトウェアを使用してインピーダンス測定と解析を行うために、アセンブリをデュアルパーパスセルアナライザに適合させるように適合されています。新しい設計が既存のデュアルチャンバーCIMプレート(以下、セルアナライザープレートと呼ぶ)に対して提供する2つの大きな進歩は、i)異種細胞ミックスに存在する侵襲性細胞亜集団を回収し、分析する能力と、ii)共培養間質または免疫細胞からの分泌因子が細胞浸潤に及ぼす影響を評価するオプションです(図1)。

この技術は、異なる侵襲能力を有する細胞の亜集団を研究するのに有用であり得る。すなわち、(a)周囲の組織または血液およびリンパ管に侵入する浸潤性癌細胞、または遠隔臓器の転移性播種部位で溢出する浸潤性癌細胞、(b)病原体または罹患細胞に対処するために組織に侵入する免疫系からの細胞、(c)組織再編成または創傷治癒中に組織に侵入して新しい血管を形成する内皮細胞、 (d)腫瘍微小環境からの間質細胞が癌細胞と共に支持および浸潤する。このアプローチは、細胞の運動性および浸潤を調節することができる間質クロストークの包含を可能にする。ここに示した実現可能性研究は、癌細胞からの差異シグナルに応答した内皮浸潤を含むモデル系として、癌細胞浸潤および間質との相互作用に焦点を当てたこの改変アレイを使用する。このアプローチは、癌細胞および免疫細胞、線維芽細胞、または内皮細胞の亜集団などの他の細胞型を単離するために外挿され得る。我々は、原理の証明として浸潤性および非浸潤性の確立された乳癌細胞株を試験した。また、ヒト骨髄由来の免疫細胞に応答した患者由来の異種移植片(PDX)浸潤由来の細胞を用いて、臨床診断の現場においても将来の使用の可能性を示した。PDXは、元の患者に対する成長、進行、および治療選択肢の研究を可能にするために免疫不全またはヒト化マウスモデルに移植された患者腫瘍組織^7、8である。

プロトコル

この研究は、ジョージタウン大学の治験審査委員会(IRB # 2002-022)によって審査され、「免除」とみなされました。新たに採取された骨髄組織は、脱同定されていた廃棄された健康なヒト骨髄採取フィルターから採取した。

1. 新しいチャンバー設計(図2)

1. 新しいデュアルチャンバーセルアナライザープレートを開きます。電極のある上部チャンバーを脇に置いておきます。
2. フライス盤を用いて、細胞分析装置プレートのU字型底ウェルの2mmを削り取る。
3. UVキュレーション接着剤を使用して、孔径0.2μmの2 cm x 7 cmのポリエーテルスルホン(PES)膜を削ったウェルの底部に取り付けます。接着剤が完全に硬化し、不活性であることを確認するために30分のキュレーション時間を許可します。
4. フライス盤を使用して、側面に沿って2つの縦スリット(1.5 mm x 5.6 mm)を切り出し、新しく製造された第3チャンバーの隆起部にスナップします。
5. フライス盤を使用して、セルアナライザープレートの全体的な寸法を複製する第3のポリカーボネートチャンバーを作成します。72 mm x 18 mm (材料表).
6. 深さ 4.8 mm および直径 4.75 mm のウェルを作成し、細胞分析装置プレートの 16 ウェル設計を再現します。これにより、ウェルあたり90μLの容量が可能になります。
7. 側面に 2 つの三角形の隆起を作成して、チャンバーがステップ 1.4 で作成した元のスリットにロックされるようにします。三角形の水平部分は1.5mm、垂直部分は1.4mm、斜辺は2.052mmです。
8. 直径50.8 mm、高さ1.397 mmの短辺に、元のプレートの切り込みに収まるようにつまみを作成します(図2、中央)。
9. 各ウェルに厚さ0.9mmのゴムワッシャーを使用して、密閉されたフィット感を提供します。

細胞培養(MDA-MB-231、DCIS、DCIS-Δ4、J2-線維芽細胞)

1. 付着細胞培養物(約70%コンフルエント)を1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄する。
2. 0.05%トリプシン-EDTA溶液を加えて細胞を持ち上げます。
3. 血清を含む細胞培養培地でトリプシン溶液を中和し、細胞懸濁液のアリコートを用いて細胞を計数する。
   注:特定の細胞培養培地は、 表1に見出すことができる。

3. 患者由来異種移植片解離

1. 新鮮な腫瘍片(^1cm2)を滅菌メスを使用して細かいマッシュに刻む。
2. 3 mg/mL トリプシンおよび 2 mg/mL コラゲナーゼを添加した 20 mL の DMEM F12 培地を入れた 50 mL の円錐形チューブに入れます。
3. サーマルシェーカー(150RPM)中で37°Cで20分間インキュベートする。
4. チューブを500 x g で5分間回転させる。上清を取り除く。
5. 20 μLのDMEM F12 + 2% FBSを加えて細胞を洗浄する。300 x g で5分間スピンし、上清を除去します。さらに2回洗濯を繰り返します。
6. 1mLのPDX培地(表1)に再懸濁し、細胞を計数した。

4. 骨髄細胞抽出

1. 骨髄(BM)収集フィルターを25mLの1x PBSで洗い流します。
   注:この研究では、PBSを病院からの使用済みBM収集フィルターに追加し、フィルター内の残りのBMを収集しました。
2. フラッシュしたBMを、25mLの密度勾配培地を含む50mLの円錐形チューブにゆっくりと加え、層をできるだけ別々に保つように注意する。
3. 800 x g で 18 °C で 20 分間スピン
4. 遠心分離(脂肪/血漿)後に最上層を吸い上げ、BM細胞を有する密度勾配培地の上にある白色層の5mLを15mL円錐管に移す。
   注: または、5 mL のピペットを最上層に浸して中間層 (BM) に触れ、ピペットを動かさずに中間層を非常にゆっくりと取り出します。
5. 15 mL の円錐形チューブに 1x PBS (約 10 mL) を充填し、300 x g で 15 分間スピンします。
6. 上清を取り除く。残りの白いペレットはBMです。
7. ペレット中に赤血球が観察された場合は、5mLのRBC溶解溶液(材料表)を加え、室温(RT)で5分間放置する。300 x g で5分間スピンし、上清を除去します。
8. 10 mL の 1x PBS を加えて細胞を洗浄し、300 x g で 5 分間スピンし、上清を除去します。ペレットが白色になるまでRBC溶解(ステップ4.7)を繰り返す。

5. 細胞の播種と組み立て

1. 3つの滅菌チャンバーすべてを組織培養フードに入れます。
2. 下部チャンバーの短辺にあるノブの位置を確認します。ノブが実験者の方を向くように下のチャンバーを向けます。
3. 30,000~50,000個の細胞を90μLの培地で下部チャンバーの各ウェルに加える。泡を形成しないでください。これらは、分泌された因子を提供するが、上部チャンバーの電極によって検出されない間質細胞である。
4. 細胞運動性の陽性対照として、2つの下部チャンバーウェルで5%ウシ胎児血清補充培地を使用する。ネガティブコントロールとして0%血清添加培地を使用する。
5. 細胞のある下の部屋をフードの中に10〜15分間座らせて落ち着かせます。
   注:このステップは、細胞が接着しているか、懸濁状態で増殖する場合に推奨されます。
6. 下部チャンバを90°回転させ、下部チャンバのノブが中央チャンバの切り込みにスライドするように中央チャンバを上に置きます。
   メモ: 下部チャンバーのノブと中央チャンバーの青い点は、アセンブリの両端にあります。
7. アセンブリの長辺からカチッという音が聞こえるまで垂直に押し下げます。
8. 160 μLの無血清培地を中央チャンバーのすべてのウェルに加える。
9. 井戸が満たされた後、ドーム型のメニスカスが見えることを確認してください。それ以外の場合は、ピペットキャリブレーションに基づいて最終ボリュームを調整します。泡を形成しないでください。
10. 電極が中央のチャンバーに下を向いた状態で上部チャンバーを配置し、中央チャンバーと上部チャンバーの青い点を揃えます。
11. アセンブリの長辺からカチッという音が聞こえるまで垂直に押し下げます。
12. 25~50 μLの無血清培地を上部チャンバーに加える。
13. 組織培養インキュベーター内のデュアルパーパス細胞分析装置にアセンブリをマウントし、30分間待ってからバックグラウンドを測定します。
    注:この時間はアレイを平衡化するために必要であり、トップチャンバーに添加する細胞株を調製するために使用することができる。
14. 背景を測定し(セクション6を参照)、アセンブリを組織培養フードに戻します。
15. 100 μLの無血清培地中の30,000~50,000個の細胞をトップチャンバーの各ウェルに加える。これらは、電極が膜を通って正常に移動した後に検出するセルです。
    注: 最大の応答を達成するには、アッセイを実行する前に、無血清または低血清培地で細胞を 6 ~ 18 時間増殖させることをお勧めします。
16. アセンブリをフード内に30分間放置してから、インピーダンス測定用のデュアルパーパスセルアナライザに取り付けます。

6. バックグラウンドおよびインピーダンス測定

1. アレイをデュアルパーパスセルアナライザ装置のクレードルに置きます。
2. セルアナライザーソフトウェアを開き、使用するクレードルを選択します。
3. [ メッセージ ]タブをクリックし、[ 接続OK] と表示されていることを確認して、アレイがクレードルに正しく配置され、電極がセンサーと適切に整列していることを確認します。
4. [ 実験メモ] タブをクリックし、実験に関するできるだけ多くの情報を入力します。
5. [レイアウト]タブをクリックし、配列レイアウトの説明を入力します。
6. [スケジュール]タブをクリックし、[ステップ]メニューから2つのステップを追加します。バックグラウンドステップ(1スイープ)と100スイープのテストステップ-15分ごとにスイープ、合計25時間。
7. アレイをデュアルパーパス細胞分析器インキュベーターに30分間入れた後、 再生 ボタンをクリックしてバックグラウンド測定を開始します。データを保存するフォルダを選択するように求めるウィンドウがポップアップ表示されます。
8. バックグラウンド測定が完了したら、アレイをクレードルから取り出し、細胞培養フードに戻します。
9. ステップ5.13で説明したように細胞を上部チャンバーに追加し、細胞が沈降するために組織培養フードにアセンブリを30分間保持する。
10. アレイをデュアル・パーパス・セル・アナライザーに戻し、「メッセージ」タブで「接続OK」メッセージを確認します。
11. 再生ボタンをクリックしてインピーダンス測定を開始します。
12. [プロット]タブをクリックして、信号の進行状況を監視します。
13. エンドポイントが 25 時間前に達した場合は、[実行] ドロップダウン メニューから [中止] ステップをクリックします。
14. データをエクスポートするには、グラフを右クリックし、リスト形式で [ コピー] を選択してから、スプレッドシートにデータを貼り付けます。
    メモ: データは、セルインデックスまたはデルタセルインデックスとしてエクスポートできます。グラフやレイアウト情報もエクスポート用に選択できます。

7. 剥離と細胞収集

1. デュアルパーパスセルアナライザーで移行速度をリアルタイムで監視し、目的の停止点(6-18時間)を決定します。
   注:停止点は、細胞の浸潤速度と、陰性対照からの明確な侵入信号が達成された時期に依存する。
2. 完了したら、アセンブリをデュアルパーパス細胞分析装置から取り外し、組織培養フードに入れます。
3. 適切な数の1.5 mL微量遠心チューブを準備し、目的のウェルから細胞を回収する。
4. アセンブリを 10 cm の皿に入れて、チャンバーが外れたときに液体を入れます。
5. 中央のチャンバーの長側にある柔軟なスナップ端を、カチッという音が聞こえるまで内側に押し込みます。
6. 上部のチャンバーを解体し、新しい10cmの皿に反転させます。
7. 13mmブレードを備えたセルリフターを使用して、同じ実験条件(細胞タイプ、薬物処理など)を保持するすべてのウェルから細胞を収集します。
   注: 陰性対照から統計的に有意な変化を達成するために、各実験条件に対して少なくとも 2 つのウェルを持つようにセットアップを設計します。
8. ブレードを 1x リン酸緩衝生理食塩水ですすいか浸し、1.5 mL の微量遠心チューブで細胞を回収します。
9. 細胞を500 x g で5分間スピンダウンします。
10. 収集した細胞を増殖させるか(セクション8を参照)、または単一細胞RNA-seqなどのエンドポイント分析を実行します。
    注: バルク RNA-seq の場合は、細胞数の低い RNA 抽出キットを使用してください。

8.3D 細胞の増殖と検索

注: 収集される細胞の数が少ないため、生存率を高めるために細胞外マトリックス (ECM) を使用して細胞を 3D にシードします。そうは言っても、2D培養は、特に使用される細胞が確立された細胞株からのものである場合、この時点でも選択肢である。

1. 基底膜マトリックスのアリコートを4°Cで一晩解凍する。使用する準備ができるまで、地下室の膜マトリックスを氷の上に保管してください。
2. 回収した生細胞のペレットに25 μLの冷たい地下室膜マトリックスを加え、静かにピペットを上下させて混合します。泡を形成しないでください。
3. 細胞基底膜マトリックスミックスを小さな組織培養ウェルの底部(すなわち、96ウェルプレート中)に添加し、ドームを形成する。井戸の壁に触れないようにしてください。37°Cで20分間インキュベートした後、100μLの培地を静かに滴下する。
4. 細胞を取り出すには、培地を吸引し、各ウェルに100μLのディスパーゼを加える。
5. RTで10分間インキュベートし、時折上下にピペッティングする。
6. 細胞および溶解した基底膜マトリックスを1.5mL微量遠心管に移す。1 mL の 1x PBS を加え、300 x g で 5 分間スピンし、上清を除去します。洗濯を1回繰り返します。
7. 上清を吸引する。ペレット内のセルを分割するか、エンドポイント分析を実行します。

結果

新たに設計された3チャンバーアレイを用いて、細胞の浸潤を、線維芽細胞などの間質細胞の存在下または非存在下で試験した。照射されたスイス3T3線維芽細胞(J2株)を底部チャンバーに播種するとMDA-MB-231細胞浸潤が増強され、2つの細胞株間での因子の交換が可能になった。興味深いことに、MDA-MB-231の浸潤は、3T3-J2細胞の数が2倍になったときに増加した(図3A)。一方、MCFDCIS細胞(DCIS-Δ4)⁹ の侵襲性クローンの浸潤速度は、3T3-J2細胞とのクロストークによって抑制されるようである(図3B)。このデータは、細胞浸潤に対する間質(この場合は線維芽細胞)の様々な影響を測定するための3チャンバーアレイの有用な適用を示す。

次に、浸潤性(MDA-MB-231)^10、11または非侵襲性(DCIS)¹²癌細胞...

ディスカッション

デュアルチャンバーアレイの設計を変更し、間質細胞の存在下で細胞侵入をリアルタイムで監視するための第3チャンバーを含めました。我々は、共培養線維芽細胞が浸潤性および非浸潤性癌細胞に対して有する明確な効果を観察し、このアレイを使用して、共培養間質細胞によって産生される因子に対して異なる応答を示す癌細胞亜集団を区別することができることを示している。このアレイはまた、間質組織への内皮細胞浸潤をモニターするためにも使用され、これは、血管が様々な浸潤電位の癌細胞の存在下で血管新生刺激に向かって発芽する際の重要なステップである。これらの実験は、癌細胞または他の細胞単離のためのアレイの多目的な使用を示す。

各チャンバに追加する細胞の数を最適化することをお勧めします。私たちの経験とメーカーの推奨から、30,000-50,000セルが最適です。このアレイでは2つの細胞タイプを共培養することができ、そのうちの1つは間質細胞の初代培養であり得るので、生存率を維持するために使用される細胞に対する異なる培地の影響を監視することが示唆される。我々は、監視対象の細胞の飢餓が反復間の変動を減少させることを見出した。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.05% トリプシン-EDTA	サーモフィッシャー	25300-054
接着剤	ノーランド光学接着剤	NOA63
ウシ血清アルブミン (BSA)	シグマ	A9418
セルリフター	Sarstedt	83.1832
コレラ毒素 コレ	サーモフィッシャー	12585-014
CIM プレート	Agilent	5665817001	細胞分析プレート
Clostridium histolyticum	Sigma	C0130
Dispase	StemCell	7913
DMEM	サーモフィッシャー	11995-065
DMEM-F12	サーモフィッシャー	11875-093
ウシ胎児血清 (FBS)、熱不活化	オメガサイエンティフィック	FB-12
HEPES	サーモフィッシャー	15630106
馬血清 (HS)	Gibco	16050-122
ヒト EGF	Peprotech	AF-100-15
ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC)	LONZA (RRID:CVCL_2959)	C-2517A
HUVEC media	LONZA	CC-3162
ヒドロコルチゾン	Sigma	H4001
インスリントランスフェリンセレンエタノールアミン (ITSX) (100x)	サーモフィッシャー	51500056
インスリン、ヒト組換え、亜鉛溶液	Sigma	C8052
J2 線維芽細胞幹	細胞 (RRID:CVCL_W667)	100-0353
LymphoPrep	Stemcell	7851	単核細胞単離用密度勾配培地
マトリゲル	コーニング	354230	基底膜マトリックス
MCFDCIS.com 細胞(DCIS)	RRID:CVCL_5552
MDA-MB-231細胞	RRID:CVCL_0062
フライス盤			Bridgeportシリーズ1垂直
リン酸緩衝生理食塩水(1x)	サーモフィッシャー	10010049
ポリエーテルスルホン(PES) メンブレン	Sterlitech	PCTF029030
RBC 溶解液	Stemcell	7800
RNeasy マイクロキット	Qiagen	74004
RTCA DP アナライザー	Agilent	3X16	デュアルパーパスセルアナライザー
トリプシン	Sigma	T4799