この論文は、 ショウジョウバエ の光受容体から数種類の脂質を同定し定量するための、汎用性が高く、堅牢で高感度な質量分析プロトコルを示しています。
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この論文は、 ショウジョウバエ の光受容体から数種類の脂質を同定し定量するための、汎用性が高く、堅牢で高感度な質量分析プロトコルを示しています。
ホスホリパーゼCβ(PLCβ)の活性化は、 ショウジョウバエ の光受容体における感覚伝達中の重要なステップです。PLCβ活性は、膜脂質ホスファチジルイノシトール4,5ビスリン酸[PI(4,5)P2]の加水分解をもたらし、最終的に一過性受容体電位(TRP)およびTRP様(TRPL)チャネルの活性化につながります。PLCβの活性は、その後、多くの脂質種の生成にもつながり、そのうちのいくつかはTRPおよびTRPL活性化に関与することが提案されています。さらに、いくつかのクラスの脂質が、光受容体の細胞生物学を組織化してシグナル伝達反応を最適化し、最適な感覚伝達を実現する上で重要な役割を果たすことが提案されています。歴史的に、これらの発見は、特定の脂質のレベルを制御する酵素のために ショウジョウバエ 変異体を単離し、これらの変異体の光受容体生理学の解析を行う能力によって推進されてきました。最近では、高感度で特異性の高い脂質の単離と定量分析のための強力な質量分析法が開発されています。これらは、放射性核種の標識を必要とせずに光受容体からの脂質分析が可能になった ショウジョウバエ での使用に特に適しています。この記事では、 ショウジョウバエ の光受容体におけるさまざまなシグナル伝達脂質の堅牢で高感度かつ正確な定量評価のための脂質質量分析の使用における概念的および実用的な考慮事項について説明します。分子遺伝学や生理学的解析の既存の方法とともに、このような脂質は、生物学における発見のモデルシステムとして、光受容体の力を高める可能性があります。
ショウジョウバエの光伝達は、Gタンパク質共役PLCβカスケードによって媒介され、光活性化チャネルTRPおよびTRPL1の活性化につながります。PLCβは、膜結合リン脂質であるホスファチジルイノシトール4,5ビスホスフェート[PI(4,5)P2]を加水分解し、ジアシルグリセロール(DAG)とイノシトール1,4,5トリスホスフェート(IP3)を生成します。その後、DAGはDAG-キナーゼによってリン酸化され、ホスファチジン酸(PA)が生成されます。その後、脂質中間体の生成を伴う一連の反応を通じて、PI(4,5)P2が再生されます2。このPI(4,5)P2サイクルのいくつかの成分は、ショウジョウバエの光受容体で機能を持っています。PLCの活性化がTRPおよびTRPLチャネルゲーティングにつながるメカニズムは未解決のままです。しかし、いくつかの証拠は、PI(4,5)P2加水分解によって生成された脂質中間体がこのプロセスを媒介する可能性があることを示唆しています3。したがって、ショウジョウバエの光伝達におけるTRPおよびTRPLの活性化メカニズムを明らかにするためには、こ....
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1.ハエの飼育と薬品の調製
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MSにおける測定の直線性の決定。直線性とは、脂質分析種の濃度に正比例する結果を提供する MS 分析法の能力です。直線性は、(a)脂質分析種のイオン化効率、および(b)異なる濃度での脂質分析種のイオン化挙動は、使用するイオン源に依存します。この研究で使用したエレクトロスプレーイオン化(ESI)では、(a)ESIソースから質量分析器へのイオン輸送、(b)質量分析器の設計、および検出器の信号の直線性に応じて、低濃度で直線性が維持されます。分析対象の分子の内部標準を使用した線形性測定は、実験ごとに推定する必要があります。データセットの例として、 図4 は、2桁にわたる濃度範囲にわたるDIMS実験のPA(12:0/13:0)標準の線形性応答を示しています。
DIMSアプローチ。図5は、グローバルDIMSアプローチを使用して野生型のショウジョウバエから検出および定量されたすべての脂質クラスを.......
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多くの証拠は、ショウジョウバエの光受容体の組織と機能の調節におけるシグナル伝達脂質の複数の役割に収束しています。光伝達3の調節における脂質のよく研究された役割に加えて、シグナル伝達脂質は、タンパク質輸送および細胞内組織化にも関与している23,30,39,40,41。これらの研究は、ショウジョウバエモデル系における光受容体機能の生理学的42および遺伝的解析43のための十分に開発された方法によって可能になった。しかし、ショウジョウバエの光受容体における脂質分.......
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著者は何も開示していません。
この原稿に記載されている作業は、インド政府原子力省(Project Identification No.RTI 4006)、バイオテクノロジー省、インド政府(BT / PR4833 / MED / 30/744/2012)およびインドアライアンスシニアフェローシップ(IA / S / 14/2/501540)にPRします。NCBS質量分析施設、特にDhananjay Shinde博士とPRラボのメンバーの皆様には、これらのメソッドの開発に貢献していただいたことに感謝いたします。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.1 N メタノール酸 HCL | 全脂質単離用 | ||
| 0.88% KCl | シグマ アルドリッチ | P9541 | 総脂質単離用 |
| 1.5 ml / 2ml LoBind エッペンドルフチューブ | エッペンドルフ, | 022431081/022431102 | 全脂質単離用 |
| 2.3.18 16:0/18:1 Diether PE | Avanti 極性脂質 | 999974 | 脂質内部標準 |
| 37% 純粋な HCl | シグマ・アルドリッチ | 320331 | 全脂質単離用 |
| 96ウェルプレート | 全有機リン酸塩アッセイ | ||
| アセトン | フィッシャーサイエンティフィック | 32005 | 解剖用 |
| モリブデン酸アンモニウム | 全有機リン酸塩アッセイ | ||
| アスコルビン酸 | 全有機リン酸塩アッセイ | ||
| バスソニケーター | |||
| BEH300 C18 カラム [1.0 mm x 100mm x 1.7 mm] | Waters India Pvt. Ltd. | 186002352 | LC |
| ブレードホルダー | ファインサイエンティフィックツール | 10052-11 | 解剖用 |
| BODインキュベーター | 全有機リン酸塩アッセイ | ||
| 壊れやすいブレード | ファインサイエンティフィックツール | 10050-00 | 解剖用 |
| バターペーパー | GEヘルスケア | 10347671 | 解剖用 |
| C4, 300 A0, [1.7μm x1 mm x 100 mm] コラム | Waters India Pvt. Ltd. | 186004623 | LC |
| クロマトグラフィー 琥珀色ガラスバイアル インサート付き | Merck | 27083-U | |
| d18:1/17:0) | Avanti 極性脂質 | 860517 | 脂質内部標準 |
| d5-ホスファチジルイノシトール 3,5-ビスリン酸 [PI(3,5)P2]-16:0/16:0 | Avanti 極性脂質 | 850172 | 脂質内部標準 |
| 解剖顕微鏡 | オリンパス | SZ51 | 解剖用 |
| ドライヒートバス。 | |||
| 溶離液A | キサン:イソプロピルアルコール:100 mM酢酸アンモニウム水溶液(68:30:2)、LC溶 | ||
| 離液B | ヘキサン:イソプロピルアルコール:100 mM酢酸アンモニウム水溶液(70:20:10)、LC | ||
| フィルターペーパー | Indica-HM2 | 74039 | 解剖用 |
| フラスコ | ボロシル | 剖用 | |
| フライ | NA | NA | Raghu Padinjatラボ |
| フライフード | NA | NA | NCBSラボキッチン、組成:トウモロコシ粉80 g / L、D-グルコース20 g / L、スクロース40 g / L、寒天8 g / L、酵母抽出物15 g / L、プロピオン酸4 mL、TEGO(メチルパラヒドロキシ安息香酸)0.7 g / L、オルトリン酸0.6 mL) |
| 鉗子 | ファインサイエンティフィックツール | 11254-20 | 解剖用 |
| ヒュームフード | |||
| ファンネル | 解剖用ボロシル | ||
| 氷河酢酸 | フィッシャーサイエンティフィック | A35-500 | 誘導体化用 |
| ガラス瓶:透明で琥珀色 | 全脂質分離用 | ||
| 高温耐性リン酸塩フリーガラス管。 | 全有機リン酸塩アッセイ | ||
| 酸化ジルコニウムビーズ | 全脂質分離 | ||
| 用 ホモジナイザー機器 | Precellys | ||
| フライパッド | プッシング用 | ||
| 照明制御インキュベーター | パナソニック 三洋電機 | MIR-553 | フライ用飼育 |
| 初期有機混合物 | メタノール:クロロホルム(2:1)、全脂質単離用 | ||
| LC-MSグレード クロロホルム | シグマアルドリッチ | 650498 | 全脂質単離用 |
| LC-MSグレード メタノール | アルドリッチ | 34860 | 全脂質単離用 |
| LC-MSグレード水 | シグマアルドリッチ | 34877 | 全脂質単離用 |
| ライトメーター | HTC 機器 | LX-103 | |
| 低保持チップ | Eppendorf | 0030072006/72014/72022/72030 | 全脂質分離用 |
| LTQ Orbitrap XL 機器 | サーモフィッシャーサイエンティフィック、ブレーメン、ドイツ | ||
| リゾホスファチジン酸 (LPA)- 13:0 | アバンティ極性脂質 | LM-1700 | 脂質内部標準 |
| リゾホスファチジン酸 (LPA)- 17:1 | Avanti極性脂質 | LM 1701 | 脂質内部標準 |
| リゾホスファチジルコリン (LPC) -13:0 | Avanti 極性脂質 | LM-1600 | 脂質内部標準 |
| リゾホスファチジルコリン (LPC) -17:1 | Avanti 極性脂質 | 855677 | 脂質内部標準 |
| リゾホスファチジルコリン (LPC)- 19:0 | Avanti 極性脂質 | 855776 | 脂質内部標準 |
| 過塩素酸。 | 全有機リン酸塩アッセイ | ||
| リン酸標準リン酸二水素 | 全有機リン酸塩アッセイ | ||
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | NA | NA | 組成:137mMNaCl、2.7mM KCl、10 mM Na2HPO4、および1.8 mM KH2PO4、pH 7.4 |
| ホスファチジン酸 (PA)- 12:0/13:0 | アバンティ極性脂質 | 、LM-1400 | 脂質内部標準 |
| ホスファチジン酸(PA)-17:0/14:1 | アバンティ極性脂質 | LM-1404 | 脂質内部標準 |
| ホスファチジン酸(PA)-(17:0/17:0) | アバンティ極性脂質 | 830856 | 脂質内部標準 |
| ホスファチジン酸(PA)-16:0-D31/18:1 | バンティ極性脂質 | 860453 | 脂質内部標準 |
| ホスファチジルコリン(PC)-12:0/13:0 | アバンティ極性脂質 | LM-1000 | 脂質内部標準 |
| ホスファチジルコリン (PC)- 17:0/14:1 | アバンティ極性脂質 | LM-1004 | 脂質内部標準 |
| ホスファチジルエタノールアミン (PE) - 17:0/14:1 | アバンティ極性脂質 | LM-110 | 脂質内部標準 |
| ホスファチジルイノシトール (PI) - 17:0/14:1 | アバンティ極性脂質 | LM-1504 | 脂質内部標準 |
| ホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート [PI(4,5)P2)]-17:0/20:4 | Avanti極性脂質 | LM-1904 | 内部標準 |
| ホスファチジルイノシトール4-リン酸(PI4P)-17:0/20:4 | Avanti極性脂質 | LM-1901 | 内部標準 |
| ロボットナノフローイオン源 | TriVersa NanoMate(Advion BioSciences、イサカ、ニューヨーク、米国) | ||
| ロトスピン機器 | ターソン | 3090X | |
| シリコンパッド | 解剖 | ||
| 用溶媒 A | 水中の0.1% ギ酸、LC溶剤 | ||
| B | アセトニトリル中の0.1% ギ酸 | ||
| LC卓上遠心分離機 | |||
| サーモミキサー | |||
| TMS-ジアゾメタン | Acros | AC385330050 | 誘導体化用 |
| トリプル四重極質量分析計 | AB Sciex | QTRAP 6500 | |
| UPLC システム | Waters Acquity | ||
| 真空遠心濃縮器 | Scanvac , Labogene | ||
| Vortex マシン |
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