方法論記事

チベットミニブタの駆出率が保たれた心不全の外科的モデル

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DOI：

10.3791/63526

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2022年2月18日

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1Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, 2Department of Cardiovascular Surgery, the First Affiliated Hospital, Jinan University, 3College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルは、下行大動脈狭窄を使用して駆出率を維持した心不全のミニブタモデルを確立するための段階的な手順を記述する。また、この疾患モデルの心臓の形態、組織型、および機能を評価する方法も紹介します。

要約

心不全(HF)症例の半数以上は、世界中で駆出率保持型心不全(HFpEF)に分類されています。HFpEFの基本的なメカニズムを調査し、潜在的な治療標的を特定するための大型動物モデルは限られています。この研究は、HFpEFの大型動物モデルを確立するために、チベットのミニブタにおける下行大動脈狭窄(DAC)の外科的処置の詳細な説明を提供します。このモデルは、下行大動脈の狭窄を正確に制御して、左心室の慢性的な圧力過負荷を誘発しました。心エコー検査は、心臓の形態学的および機能的変化を評価するために使用されました。DACストレスの12週間後、心室中隔は肥大したが、左心室の拡張を伴って後壁の厚さは有意に減少した。しかし、モデル心臓のLV駆出率は、12週間の間、>50%に維持された。さらに、DACモデルでは、線維化、炎症、心筋細胞肥大などの心臓障害が認められました。心不全マーカーレベルはDAC群で有意に上昇した。このDAC誘導性HFpEFは、この疾患の分子メカニズムの調査や前臨床試験のための強力なツールです。

概要

駆出率が保たれた心不全(HFpEF)は、心不全症例の半数以上を占めており、世界的な公衆衛生上の問題となっています1。臨床観察では、HFpEFのいくつかの重要な特徴が示されています:(1)収縮期硬化の増加を伴う心室拡張期機能障害、(2)運動能力の低下を伴う安静時の正常駆出率、および(3)心臓リモデリング2。提案されたメカニズムには、ホルモン調節不全、全身性微小血管炎症、代謝障害、およびサルコメアおよび細胞外マトリックスタンパク質の異常が含まれます3。しかし、実験的研究は、駆出率の低下を伴う心不全(HFrEF)がこれらの変化を引き起こすことを示しています。臨床研究では、アンジオテンシン受容体阻害剤とHFpEFのHFrEF治療薬の治療効果が調査されています4,5。しかし、HFpEFには独自の治療法が必要です。臨床症状の理解と比較すると、HFpEFの病理学、生化学、および分子生物学の変化は十分に定義されていません。

HFpEFの動物モデルは、そのメカニズム、診断マーカー、および治療アプローチを探求するために開発されています。ブタ、イヌ、ラット、マウスなどの実験動物はHFpEFを発症する可能性があり、高血圧、糖尿病、老化など多様な危険因子を誘導因子として選択しました6,7。例えば、酢酸デオキシコルチコステロン単独または高脂肪/高糖質飼料と組み合わせると、豚にHFpEFが誘導されます8,9。心室圧過負荷は、大動物および小動物モデルでHFpEFを発症するために使用される別の技術です10。また、欧州心臓病学会のガイドライン、米国心臓病学会財団/米国心臓協会11、日本循環器学会/日本心不全学会12に見られるように、近年、HFpEFを定義するための特定のEFカットオフ値が大陸を超えて採用されています。したがって、臨床基準が採用されれば、以前に確立された多くのモデルがHFpEF研究に適している可能性があります。例えば、Youselfiらは、遺伝子改変マウス系統Col4a3-/-が有効なHFpEFモデルであると主張した。この株は、拡張期機能障害、ミトコンドリア機能障害、心臓リモデリングなどの典型的なHFpEF心臓症状を発症した13。以前の研究では、高エネルギー食を使用して、代謝障害、線維症、および心筋のアクトミオシンMgATPaseの減少を特徴とする高齢のサル14で中程度のEFによる心臓リモデリングを誘発しました。マウス横大動脈狭窄術(TAC)は、高血圧誘発性心室性心筋症を模倣するために最も広く使用されているモデルの1つです。左心室は、EFの増加を伴う同心円状の肥大から、EF15,16の減少を伴う拡張型リモデリングへと進行する。これら2つの典型的な病期の間の移行表現型は、大動脈狭窄法を使用してHFpEFを研究できることを示唆しています。

ブタHFpEFモデルの病理学的特徴、細胞シグナル伝達、およびmRNAプロファイルは、以前に発表されています17。ここでは、このモデルを確立するためのステップバイステップのプロトコルと、このモデルの表現型を評価するためのアプローチを示します。この手順を 図 1 に示します。簡単に言うと、手術計画は、主任研究者、外科医、検査技師、および動物ケアスタッフによって共同で作成されました。ミニブタは、生化学検査や心エコー検査などの健康診断を受けました。手術後、抗炎症薬と鎮痛薬の処置が行われました。心エコー検査、組織学的検査、およびバイオマーカーを使用して表現型を評価しました。

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プロトコル

すべての動物実験は、広東省実験動物モニタリング研究所の動物管理および使用委員会によって承認されました。IACUC2017009)です。すべての動物実験は、実験動物のケアと使用に関するガイド(第8版、2011年、米国国立アカデミー)に従って実施されました。動物は、広東省実験動物監視研究所(ライセンス番号)のAAALAC認定施設に収容されました。SYXK (YUE) 2016-0122, 中国)。6匹のオスのチベットミニブタ(偽群とDAC群でそれぞれn=3匹、体重25〜30kg)を使用してHFpEFモデルを開発しました。

1.動物と器具の準備

  1. 手術前の14日間、動物を施設に順応させます。
  2. 手術前に生化学検査や心エコー検査などの健康診断を行ってください。T/CALAS85-2020 実験動物 - 大型実験動物の心臓、肝臓、腎臓、脳などの主要臓器の健康評価に関するガイドライン (中国実験動物科学協会、中国) に従って、構造 (心室拡張または肥大) および機能 (EF <50%) の心臓異常のある動物を除外します。
  3. 手術当日は給餌しないことで、麻酔前に12時間以上絶食します。
  4. 手術室とデバイスを準備します(図2)。麻酔人工呼吸器ステーション、獣医および患者モニター、獣医超音波システム、吸引器、およびその他の手術器具を確認してください。はさみ、鉗子、リトラクター、メスのハンドル、吸引器の頭、手術針などをオートクレーブします( 材料表を参照)。

2.鎮静、気管挿管、静脈カニューレ挿入

  1. 動物の体重を量り、麻酔薬を計算します。1 mg / kgのゾレチル注射(注射用のチレタミンとゾラゼパム)と0.5 mg / kgの塩酸キシラジン注射でミニブタを鎮静させます( 材料表を参照)。
  2. ミニピグを拘束し、手術台の右横臥位に置きます。動物の体温を維持するために暖房システムをオンにします。
  3. 心エコー検査(ステップ5)を行い、2mLの血液サンプルを採取します。
  4. 獣医用麻酔人工呼吸器ステーションに接続された気管内チューブでミニブタを挿管します(図3A)( 材料表を参照)。
  5. 8 mL / kgの一回換気量と30回の呼吸/分で換気を開始します。外科的処置中は、1.5%〜2.5%のイソフルランで動物を維持します。
  6. 耳の静脈(通常は辺縁の耳静脈、図3B)から末梢静脈内カテーテル(26 G)(材料表を参照)を使用して静脈内カニューレ挿入を確立します。
  7. 動物を獣医モニターに接続します。

3.外科的処置

  1. 左胸部を剃ります。0.7%のヨウ素と75%のアルコールを塗布して、肩甲骨から横隔膜までの皮膚を無菌的に準備します(図3C)。
  2. 手術部位に滅菌ドレープを置きます。
  3. 全身麻酔を維持するために、プロポフォール(5 mg / kg)( 材料表を参照)を静脈内注射で投与します。.
  4. 電気焼灼による皮膚切開の前に、第4肋間腔に沿って切開(~15cm)に印を付けます。
  5. 焼灼と筋肉と結合組織の鈍的解剖を組み合わせて胸を開きます。手術中は吸引器を使用して血液を抜いてください。
  6. リブリトリトラクターを使用してリブを広げます(図3D)。
  7. 胸部下行大動脈セグメントの位置を特定し、狭窄部位を決定します(図3E)。2つの3-0外科用縫合糸を使用して、セグメントを2回ループさせます(図3F)。縫合糸と大動脈の間に医療用ガーゼを3層重ねて、縫合による組織の損傷を防ぎます。
  8. 収縮の程度を決定するための圧力測定ユニットを設定します(図3F-H)。
    注:このユニットには、血管壁に穴を開けるカテーテル、接続チューブ、圧力トランスデューサー、および患者モニターが含まれています。
  9. 下行する大動脈セグメントを囲む外科的縫合糸を徐々に締めて、目的の収縮度を達成します。圧力測定値を20分間安定させ、外科用結び目を恒久的に締めます。
  10. ドレナージ胸腔チューブを使用して、胸腔内の空気と余分な液体を排出します。
  11. 胸壁を層状に閉じ、吸収性縫合糸で肋骨と分割された筋肉を再近似します。
  12. 出血がないか確認し、止血が良好であることを確認してください。
  13. ベンジルペニシリン(800,000単位)( 材料表を参照)のボトルを手術後の手術部位に塗布します。
  14. 動物のまばたきと手足の動きの存在を監視します。人工呼吸器を外しますが、気管内チューブは残します。自発呼吸の存在を監視します。
  15. 動物を飼育室に戻し、自動的に目を覚ますのを待っておきます。

4. 術後のケア

  1. ベンジルペニシリンを毎日1週間(20,000 U / kg)塗布します。.
  2. 1 mg / kgのフルニキシンメグルミン( 材料表を参照)を毎日1週間適用します。.
    注:オピオイドおよびNSAID鎮痛薬は、術中および術後に投与する必要があります。.

5.経胸壁心エコー検査

  1. 1 mg / kgのゾレチルで動物を鎮静させます。.
  2. 動物をキャンバスカバー付きの移動式拘束ユニットに入れます。
    注意: 移動式拘束ユニット( 資料表を参照)には、動物の前肢と後肢を伸ばすように設計された4つの開口部があります。
  3. 動物の左胸を剃ります。
  4. 胸の左中央に指を置き、頂端の脈を感じます。超音波ジェルを周囲に塗布します。
  5. 超音波システムのフェーズドアレイトランスデューサ(3〜8 Hz)を3番目の肋間腔に配置します。トランスデューサーを前後方向に動かし、ノッチ角度を調整します。
  6. 心房、心室、大動脈を特定します。BモードおよびMモードの胸骨傍長軸画像を記録します。
    注:Bモード画像は乳頭筋レベルでの左心室の断面を表し、Mモード画像は時間の経過に伴う左心室の動きを示しています。
  7. トランスデューサーヘッドを時計回りに90°回して、胸骨傍の短軸ビューを取得します。左心室、右心室、乳頭筋を特定します。BモードとMモードの画像を記録します。
  8. 超音波システムの製造元が提供するワークステーションを使用して、心臓の構造と機能を評価します。

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結果

心エコー検査
心臓の構造と機能は、0、2、4、6、8、10、および12週で評価されました。胸骨傍短軸図のBモードおよびMモードの記録を図4Aに示す。心エコー検査の測定には、心室中隔の厚さ (VST)、後壁の厚さ (PWT)、および左心室の内寸 (LVID) が含まれていました。DAC心臓では拡張末期のVSTが増加し、拡張末期のPWTは観察期間中に増加し、その後減少したことから、DACミニブタの左心室に肥大型リモデリングが見られることが示唆された(図4B、C)。拡張末期のLVIDは4週目と6週目に減少し、8週目以降は徐々に増加しており、拡張前に心室が同心円状肥大を起こしたことが示唆された(図4D)。モデル心臓のLVEFは、12週間の間、>50%に維持されました(図4E)。

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ディスカッション

本研究では、DAC技術を用いて、チベットミニブタのHFpEFモデルを開発しました。ここでは、鎮静、気管挿管、静脈カニューレ挿入、外科的処置、術後ケアなど、動物および器具の準備手順を段階的に説明します。また、心エコー検査のBモードおよびMモードの心臓画像の記録技術についても紹介します。DAC後、心臓は4週目と6週目に左心室肥大を起こし、8週目以降に拡張しました。LVEFは12週間の間保存されました。DAC心臓では線維化と炎症が観察されました。

開胸手術と大動脈狭窄術の組み合わせは、大小の動物の心不全モデルの開発に使用されています。例えば、げっ歯類の大動脈狭窄誘発性高血圧症は、早くも1950年代に報告されています18。ブタの上行大動脈の狭窄は、2〜4週齢のブタに軽度の左心室肥大を誘発した。上行大動脈の位置を特定するための手術部位については、いくつかの研究が第3肋間腔を選択し19,20、別の研究では外側開胸術のために第4肋...

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開示事項

著者らは、競合する利害関係はないと宣言しています。

謝辞

本研究は、広東省科学技術プログラム(2008A08003、2016A020216019、2019A030317014)、広州科学技術プログラム(201804010206)、中国国家自然科学基金会(31672376、81941002)、広東省実験動物重点実験室(2017B030314171)の支援を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
吸収性外科用縫合Putong Jinhua Medical Co. Ltd、中国4-0
麻酔ベンチレーターステーション Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd、中国WATO EX-35vet
AspiratorShanghai Baojia Medical Apparatus Co., Ltd、中国YX930D
ベンジルペニシリン四川製薬.INC、中国H5021738
カフ付き廃棄気管内チューブShenzhen Verybio Co., Ltd, 中国20 cm, ID 0.9
廃棄トランスデューサ広東省Baihe Medical Technology Co., Ltd, 中国
解剖ブレード上海 医療 インスツルメンツ(グループ) Co., Ltd, China
ElectrochateryShanghai 胡同メディカルインスツルメンツ(グループ) Co., Ltd, ChinaGD350-B
酵素結合免疫吸着アッセイ ELISAキットCusabio Biotech Co., Ltd, ChinaCSB-E08594r
EosinSigma-Aldrich Corp.E4009
Flunixinのmeglumine上海Tongrenの薬剤Co.、株式会社、中国Shouyaozi(2012年)-090242103
鉗子上海 医療 計器(グループ) Co., Ltd.,China
HematoxylinSigma-Aldrich Corp.H3136
イソフルランRWD ライフサイエンス (株) 中国動物
喉頭鏡Taixing Simeite Medical Apparatus and Instruments Limited Co., Ltd (中国)大人
LED 手術灯明台医療集団 (中国) ZF700
マイクロプレート リーダーサーモフィッシャーサイエンティフィック (米国) Multiskan FC
顕微鏡ライカ、ドイツDM2500
移動式拘束ユニットカスタマイズN/A金属製のフレームとホイールで作られた移動式拘束ユニット、キャンバスカバー付き
酸素地元のサプライヤー、広州、中国
パラホルムアルデヒドSigma-Aldrich Corp.
患者モニターShenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, ChinaBeneview T5
Peripheral Intravenous (IV) CatheterShenzhen Yima Pet Industry Development Co., Ltd., Ltd., China26G X 16 mm
PropofolGuangdong Jiabo Phamaceutical Co., Ltd.
リブレトラクター上海 医療 インスツルメンツ(グループ) (株)中国
定規デリ 製造業 会社、中国
を扱っています 医療 計器(グループ) Co., Ltd.,China
Scissors (g)Shanghai 医療 インスツルメンツ(グループ) (株)、中国
縫合メドトロニック・コビーデン(株)3-0、4-0
超音波ゲル天津Xiyuansi生産研究所、中国TM-100
獣医モニター深センMindrayバイオメディカルエレクトロニクス会社、中国ePM12M獣
医獣医用超音波システムEsatoe、イタリアMyLab30フェーズドアレイトランスデューサー(3-8 Hz)
Xylazine塩酸塩注射Shenda動物を装備Phamarceutical Co., Ltd., ChinaShouyaozi(2016)-07003
Zoletil注射Virbac, FranceZoletil 50Tiletamine and zolazepam for injection
糸 用 Veteasy用V900894H20051842メスは上海糸

参考文献

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