成長因子媒介インテグリン力学と接着を定量するためのテンションゲージテザープローブ

サマリー

TGT表面は、成長因子 - インテグリンクロストークを研究するための革新的なプラットフォームです。柔軟なプローブ設計、接着リガンドの特異性、刺激条件の正確な変調により、EGFR-インテグリン相互作用の堅牢な定量的評価が可能になります。この結果は、EGFRがインテグリン力学を「メカノオーガナイザー」チューニングし、焦点接着アセンブリと細胞拡散に影響を与えることを強調しています。

要約

多細胞生物は、周囲の細胞外マトリックス(ECM)中の膜受容体と同族リガンドとの間の相互作用に依存して、接着、増殖、遊走、分化を含む複数の機能を調整する。機械的力は、接着受容体インテグリン を介して 細胞からECM内のリガンドに伝達することができる。これらの細胞生成力の量および空間組織は、上皮成長因子受容体(EGFR)を含む成長因子受容体によって調節することができる。細胞力学におけるクロストーク媒介性の変化を定量化し、それらを焦点接着、細胞形態学、およびシグナル伝達に関連付けるために現在利用可能なツールは限られている。張力ゲージテザー(TGT)として知られるDNAベースの分子力センサは、これらの変化を定量化するために採用されている。TGTプローブは、根底にある力閾値を調節し、回折制限された空間分解能で付着細胞表面全体にわたってピコネウトンスケール受容体力を報告する能力においてユニークである。ここで使用されるTGTプローブは、蛍光シグナルを生成する受容体 - リガンド力によるDNA二重鎖の不可逆的解離に依存している。これにより、細胞の累積インテグリン張力(力履歴)の定量化が可能になる。この記事では、インテグリン力学および接着形成に対するEGFRの影響を研究するためにTGTを使用するプロトコルについて説明します。TGTメカニカルセンシングプラットフォームの組み立ては体系的に詳細であり、力、焦点接着、および細胞拡散を画像化する手順が概説されています。全体として、プローブの根底にある力閾値、接着リガンド、および刺激に使用される成長因子の種類と濃度を調節する能力は、インテグリン媒介性力を調節する際の多様な膜受容体の相互作用を研究するための堅牢なプラットフォームとなる。

概要

細胞は、機械的力を感知し、生成し、応答する固有の能力を有し、細胞表現型の変化および局所微小環境のリモデリングをもたらす^1,2。力は、接着、遊走、増殖、分化、創傷治癒など、細胞行動の多くの側面を調節する上で重要な役割を果たします^3,4。細胞と微小環境との間の双方向の機械的交換における収差は、癌を含む罹患状態をもたらし得る⁵。多数の膜受容体が細胞マトリックス恒常性の維持に関与している。これらのうち、インテグリンおよび上皮成長因子受容体(EGFR)は、強固な相乗効果を有する^6,7。古典的には、インテグリンは微小環境と細胞内細胞骨格との間の機械的リンクを確立し、EGFRは細胞増殖、増殖、および生存を調節する^8,9。EGFRは、細胞内シグナル伝達を促進するアウトサイドイン調節に焦点を当てた、高度に研究された治療標的である。EGFR-インテグリンクロストークは、癌を含む複数の疾患の進行を調節するために遺伝的および生化学的に確立されている^10、11。研究はEGFR-インテグリン相互作用の存在を示しているが、その転帰は原形質膜^から離れたシグナル伝達経路に起因する7、^12、13、14。EGFRまたは他の成長因子が細胞力学に及ぼす影響は、細胞力およびシグナル伝達結果を測定するためのツールの欠如のために、ほとんど未解明のままである。課題は、これらの並列シグナル伝達パラダイム間の通信を研究し、細胞力学への具体的な寄与を定量化するための適切なツールを特定することにあります。

細胞接着受容体によって生成される力を測定するためにいくつかのアプローチが開発されており、読者はこれらの技術の詳細なレビューに向けられている^15、16。簡単に説明すると、牽引力顕微鏡法およびマイクロピラーアレイ検出は、ナノニュートン(nN)力を推測するために、個々の受容体力よりも一桁大きいナノニュートン(nN)力を推測するために、基礎となる基板の変形に依存する^17、18。AFMおよび光ピンセットを含む単一分子技術は、単一タンパク質ピコネウトン(pN)力に敏感であるが、一度に1つの受容体のみを測定し、良好な(または任意の)空間分解能を提供しない。DNAベースの分子張力プローブおよびテンションゲージテザー(TGT)プローブは、回折制限(またはそれ以上)の空間分解能でpN力分解能を提供し、線維芽細胞、癌細胞、血小板、免疫細胞を含む多様な細胞型からの単一細胞力^19,20を研究する上で独自の役割を果たします^21,22,23,24.分子張力プローブは、リアルタイムイメージングに最適な拡張可能な「スプリング」要素を備えていますが、TGTプローブは不可逆的に破裂し、蛍光の「力履歴」を残します。TGTは、下地基板の張力閾値をさらに調節する。類似した化学組成を有するが、異なる破裂力、または張力公差(T_tol)を有する一連のプローブを使用して、焦点接着形成および細胞拡散に必要な最小張力を定量化することができる。TGTプローブは、2つの相補的なDNA鎖からなり、1つは表面に固定され、もう1つはリガンドを細胞に提示する。受容体がリガンドと結合し、プローブの_Ttolよりも大きい力を発揮すると、鎖は分離されます。T_tolは、理想的な条件下でプローブの50%を2秒間隔で破裂させるのに必要な一定の力として定義されます。「ターンオン」TGTプローブでは、トップストランドのクエンチャーをボトムストランドの蛍光色素分子から分離できます。TGTプローブが破裂した場所、おそらく_Ttol以上の力によってのみ、蛍光シグナルが生成されます。TGTプローブは固定することもでき、生物学的システムの操作や複数の条件の試験を容易に行うことができます。これらの理由から、TGTプローブがこの作業に使用された。

TGTプローブは、インテグリン依存性細胞接着および機械的力が活性化^EGFR21によってどのように調節されるかを研究するために使用された。この研究は、EGFRを「メカノオーガナイザー」として確立し、焦点接着組織と張力発生をチューニングしました。さらに、EGF刺激が局所接着の分布および成熟および細胞拡散の増強に影響を及ぼすことが見出された。このアプローチは、成長因子が腫瘍の進行および動態における機械的力にどのように影響するかを調査するために、将来の研究で使用することができる。上皮から間葉への移行を調節する上でのEGFR-インテグリンクロストークの役割は確立されているが、このプロセスにおける機械的力の役割は未だに検討されていない¹⁰。

ここでは、56pN TGTプローブの合成および組み立て、ガラスカバーグラス上のTGT表面の生成、TGT表面上のCos-7細胞の適用およびEGFによる刺激、ファロイジンによる細胞の固定および染色、ならびに抗パキシリン抗体、高解像度全反射蛍光(TIRF)および反射干渉コントラスト顕微鏡(RICM)イメージング、 画像の定量化。このプロトコルは、Cos-7細胞のEGF刺激を調査するために書かれたものの、多くのTGTベースの実験に容易に適応可能である。異なるリガンド、T_tol、細胞型、刺激パラメータ、固定後に標識されたタンパク質、および定量分析で簡単に置換できるため、このプロトコルは堅牢で広く有用です。

プロトコル

1. TGTオリゴヌクレオチド調製物

注:オリゴヌクレオチドプローブ合成の詳細は、ここで概説されています。いくつかの変更と精製手順は、カスタム合成のために外部委託することができますのでご注意ください。

1. シクロ[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(PEG-PEG)]ペプチドの第1級アミンを、Zhangら²² によって記載されているように、1:1.5の比率(100:150nmoles)で10μLのジメチルホルムアミド中で混合することによって、アジド-NHSリンカーと共に活性化する。0.1 μLの有機塩基トリエチルアミンを加え、4°Cで12時間インキュベートする。
2. 0.1M TEEA(溶媒A)および100%アセトニトリル(溶媒B)を用いて、流速1mL/分、初期条件を10%溶媒Bを用いて逆相HPLCにより生成物を精製し、0.5%/分の勾配で設定した。溶出したピーク(203nmにおける吸光度)を結合し、MALDI-TOF質量分析法によって検証する。生成物はcRGDfK-アジドである。
3. TGTトップストランドを生成するには、cRGDfK-アジドとアルキン-21-BHQ2オリゴヌクレオチド(TGTトップストランド:5Hexynyl/GTGAAATACCGCAGATGCG/3BHQ_2)を2:1の比率(͂200 μM:100 μM)で100 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と5 mMのアスコルビン酸ナトリウムおよび0.1 μMの予め形成されたCu-THPTAと組み合わせます。反応を室温(RT)で最低4時間、または4°Cで一晩進行させる。
4. 混合物をP2脱塩ゲルを通して処理し、過剰な染料、副生成物、有機溶媒、および未反応試薬を除去する。650 μL の予備水和 P2 ゲルで遠心分離カラムを 18,000 x g で 1 分間回転させて調製します。フロースルー液体を捨て、反応混合物を加える。再び18,000 x g で1分間スピンし、フロースルーを収集します。反応混合物を超純水で300μLの最終容量にする。
   注:P2ゲルを水で6時間予備水和します。
5. 脱塩反応混合物を逆相HPLCにより精製する。この精製に使用される有機溶媒には、_H2O中の0.1M TEAA(溶媒A)および100%MeCN(溶媒B、または移動相)が含まれる。
   1. 混合物を注入する前に、カラムを10%の初期条件と平衡化します 溶媒 B 1%/分の勾配で。流量を1mL/分に調整します。反応混合物を500μL注射針でHPLCループに注入する。
   2. DNAの260 nmおよびBHQ2消光剤の560 nmでのピーク吸収を視覚化することによって生成物を収集します。溶出した生成物を真空遠心濃縮器で一晩乾燥させる。
6. Maらに記載されているように、TGTボトムストランドをCy3B−NHSエステルに結合するために求核置換を採用する。アル²⁵。100 μM の 56 pN TGT ボトムストランド (5Biosg/TTTTTT/iUniAmM/CGCATCTGTGTGCGGTATTTCACTTT) と、10 μL の DMSO に予め溶解した 50 μg の Cy3B-NHS エステルを混合します。この混合物のpHを0.1 M炭酸水素ナトリウムで9に調整し、1x PBSで最終容量を100 μLにします。反応混合物をRTで一晩インキュベートする。
7. P2ゲルろ過および逆相HPLCを使用して混合物を順次精製し、未反応の試薬、塩、および有機溶媒を分離します(ステップ1.4および1.5に記載)。
8. 精製オリゴヌクレオチド-色素コンジュゲートの濃度は、分光光度計を用いて260nmにおける吸光度を記録することによって推定する。
9. 精製物をMALDI-TOF質量分析法により特徴付ける。過剰の3-ヒドロキシピコリン酸をTA50溶媒(50:50 v/vアセトニトリルおよび_ddH2O中の0.1% TFA)に溶解し、新鮮なMALDIマトリックスを調製する。標識された生成物の推定および測定された分子量は、cRGDfK-1-BHQ2 - 8157.9(計算)、8160.1(見つかった)である。標識されたCy3Bは56pN TGT - 10272.7(計算)、10295.8(見つかった)。
10. 上部ストランドと下部ストランドをヌクレアーゼフリーの水に別々に30~50μMの濃度で溶解します。ストックの汚染を避けるためにDNaseフリーのピペットチップを使用してください。短期用途は4 °C、長期用途は-20 °Cで保管してください。オリゴヌクレオチドの安定性は、繰り返し凍結融解サイクルの影響を受けない。

2. 表面処理

1日目:

1. 25 mm のガラス製カバースリップ (最大 8 枚) をポリテトラフルオロエチレンラックに入れます。ラックを、40 mL の 200 プルーフエタノールを含む 50 mL ホウケイ酸ビーカーに入れます。ビーカーをパラフィンフィルムで覆い、水が入らないようにし、RTで10〜15分間35kHzの動作周波数で超音波処理します(図1A)。
2. パイレックスビーカーに硫酸と過酸化水素を3:1の比率で混合して調製したばかりのピラニア溶液40mLを50mLビーカーに充填する。ガラスピペットでかき混ぜる。カバースリップラックをビーカーに移し、ヒュームフードのRTで30分間インキュベートしてカバースリップ表面をエッチングします(図1B)。
   メモ: 白衣、手袋、ゴーグルなどの PPE をフル装備し、化学ヒュームフードで作業してください。過酸化水素を酸にゆっくりと加えて、溶液の過熱を防ぎます。
3. エッチング後、ピンセットを使用してカバースリップラックを超純水でビーカーに移します。このステップを15秒間隔で6回繰り返して、酸を完全に中和します(図1C)。
   注:ピラニア溶液は、酸廃棄物容器に捨てる前に、化学ヒュームフードに一晩放置してください。
4. カバースリップを目視で検査し、ガラス表面に模様やほこりの粒子がなく、表面がきれいに見えることを確認します。パターンまたはほこりが検出された場合は、手順2.1~2.4を繰り返します。
   メモ:処理したカバースリップを水に浸し、垂直に取り外して、表面の親水性をテストします。処理されたカバースリップ上の水は、パッチを形成する未処理のカバースリップと比較して、ヤングのリングを形成する均一なシートとして後退する。
5. カバースリップラックを200プルーフエタノールを入れたビーカーに移し、15秒間2回洗浄して表面を有機溶媒に平衡化させます。カバースリップラックをRTで1時間、3%APTESを含む200プルーフエタノール溶液に移し、カバースリップをシラン化します(図1D)。ビーカーをパラフィンフィルムで覆います。
   注:APTES堆積パラメータは、表面洗浄方法、溶媒含水率、APTES濃度、インキュベーション時間、およびアニーリングの温度によって異なります。
6. ラックを200プルーフエタノール溶液の入った清潔なビーカーに浸します。この洗浄を3回、それぞれ15秒間繰り返します(図1E)。
7. 低い出口圧力で窒素(_N2)ガスを使用してカバースリップを乾燥させます。カバースリップを10cmのポリスチレン皿に入れ、その中にパラフィンフィルムを平らに置きます。カバースリップが乾いていて、分離されていることを確認します(図1F)。
8. DMSO中の2mg/mL NHSビオチン溶液100μLをパラフィンフィルム上に置いた4つのカバースリップに加える。他の4つのカバースリップを上にして「サンドイッチ」をセットし(2つのカバースリップを間に機能化溶液を入れて互いに向いている)、皿を4°Cで一晩インキュベートします(図1G)。
   注:4°Cでは、NHS試薬はより安定しており、均一な表面官能化が容易になります。さらに、サンドイッチは試薬を保存します。サンドイッチに余分な溶液を加えると、サンドイッチが漏れてカバースリップが滑る可能性があるため、避けてください。

2日目:

9. 4°Cから皿を取り出し、挟んだカバースリップを分離します。図 2A に示すように、コーティング面を互いに向くようにラック内のスリップを向けます。200プルーフエタノール溶液で3回、それぞれ15秒間洗浄します。N2ガスで乾燥させ、パラフィンフィルムを入れた新しい皿に入れます。
   メモ: カバースリップの向きを指示どおりにすると、機能化された表面を識別するのに役立ちます。
10. カバースリップを1mLの1x PBSで3回洗浄し、水相に平衡化します。各カバーグラスに1x PBS(w/v)中の0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を800μL加え、RTで30分間インキュベートして表面を不動態化し、その後の機能化試薬の非特異的結合をブロックします(図2B)。
11. インキュベーション後、カバースリップを1mLの1x PBSで3回洗浄する。1 μg/mL のストレプトアビジンを 800 μL を RT で 1x PBS に 45 ~ 60 分間加え、カバーグラスを機能化します(図 2C)。
    メモ: パッシベーション効率を確認するために、ストレプトアビジンを含まないカバースリップを 1 つ保持します(オプション)。Add10nMビオチン化分子を実験条件に用いた画像。この表面強度は、カメラの暗いノイズに近いものにする必要があります。
12. ステップ2.11と同時に、サーモサイクラーを用いてPCRチューブ中で、1 M NaClの100 μL中に終濃度50 nMのTGTプローブ(上:下鎖、1:1のモル比で)を組み立てます。ストランドを95°Cで5分間解離させ、温度を25°Cまで下げて25分間維持することで徐々にアニールします(図2D)。TGTプローブの長時間の光への暴露を避けてください。
13. ストレプトアビジンインキュベーション後、1x PBSを使用してカバースリップを3回洗浄します。事前に組み立てられたTGTプローブを4つのカバースリップに100μL加え、残りの4つのカバースリップを使用して官能化側をプローブに向けてサンドイッチを作ります(8つの表面にはハイブリダイズTGTプローブの4本のチューブが必要です)。アルミホイルで覆い、RTで1時間インキュベートして、プローブを表面に結合させます(図2E)。
14. インキュベーション後、サンドイッチを分離し、カバースリップを1x PBSで3回洗浄します。これで、TGT サーフェスをイメージングする準備が整いました。カバースリップを洗浄済みのイメージングチャンバーに慎重に組み立て、1x PBSを追加して表面を水和させます(図2F)。
    メモ:チャンバーを締めすぎると、表面に亀裂が入ります。表面の乾燥を防ぎます。

3. 細胞調製と染色

1. 上皮成長因子(EGF)刺激がCos-7のメカニズム、接着、および細胞拡散に及ぼす影響を調べるために、Cos-7細胞を0.05%トリプシン-EDTAで2分間トリプシン化した。HBSSで洗浄し、800 x g で5分間遠心分離することにより、トリプシンを中和する。中和工程をもう一度繰り返します。
2. ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)に50 ng/mL EGFまたはEGFを含まないDMEMを添加した、組み立てられたTGT表面上の^{4 x 104} 細胞の密度のプレート細胞。細胞培養インキュベーター内で5%_CO2 を用いて37°Cで60分間細胞を拡散させる(図3A)。
   注:細胞は、成長因子からの刺激を避けるために血清を含まないDMEM中でインキュベートされる。EGFを10mM酢酸で希釈して1mg/mLのストックを作る。DMEMで50ng/mLでイメージング実験に使用します。
3. インキュベーション後、細胞を1x PBSで3回洗浄し、2mLの4%パラホルムアルデヒドでRTで12分間固定します(図3B)。
   注:すべてのインキュベーションステップは、溶液の均一な拡散のために〜35rpmのロータリーシェーカーで実行されます。TGT表面をイメージングの準備ができるまで覆って光から保護します。
4. 固定液を吸引し、RTで5分間隔で1x PBSでカバースリップを5回洗浄します。オプションで、カバースリップを1x PBS中の50 mM NH₄Clで37°Cで30分間インキュベートしてパラホルムアルデヒド関連の自己蛍光を消光し、1x PBSで5分間隔で3回洗浄します(図3B)。
5. バッファーA(1x PBS、5%正常ウマ血清、5%正常ヤギ血清、1%BSA、0.025%Triton X-100)を加え、37°Cで30分間インキュベートして細胞をブロックし透過除去します。1x PBSで5分間隔で3回洗浄します(図3B)。
6. カバースリップ付きのイメージングチャンバーを湿度容器に入れます。一次抗パキシリン抗体(局所接着マーカー)をブロッキングバッファー(1x PBS、5%正常ウマ血清、5%正常ヤギ血清、1%BSA、0.005%Triton x-100)中で1:250で希釈する。カバースリップあたり200 μLの一次抗体溶液とともに37°Cで2時間インキュベートします(図3B)。
   メモ: 表面を乾燥させないでください。
7. カバースリップを1x PBSで5分間隔で5回洗い、湿度容器に戻します。カバースリップあたり200μLのブロッキングバッファー中の1:800希釈で色素結合ヤギ抗ウサギ二次抗体および1:400希釈で色素結合ファロイジン(アクチン)の混合物と同時に細胞を標識する。37°Cで60分間インキュベートする(図3B)。
8. 表面を1x PBSで5分間隔で5回洗浄し、イメージングの準備ができるまで4°Cで保管します(図3B)。
   メモ:信号の劣化を避けるために、表面処理から3日以内に画像サンプルを作成します。

4. 画像取得

1. 488、561、および647 TIRF励起、RICM励起、完全焦点システム、およびデジタルカメラを備えた倒立顕微鏡で、高い開口数(1.49)のオイル浸漬60倍対物レンズを使用します。
   1. 対物レンズにオイルを加え、サンプルチャンバーのカバースリップ底部を清掃し、サンプルをステージ上に置きます。細胞に集中し、完璧な焦点を当てます。
2. 顕微鏡を落射蛍光励起と発光フィルターを除去したGFPフィルターキューブを備えたRICMイメージングモードにします。落射照明絞りを閉じてセンタリングして、RICMを合わせます。
3. 顕微鏡をレーザー励起とクワッドパスTIRFフィルターキューブを備えたTIRFモードにします。488nmレーザーを部屋の天井の小さなスポットに焦点を合わせ、ライブモードでカメラの蛍光を監視しながら臨界角を過ぎるまで入射角を高くします。臨界角を超えたときの背景蛍光と単一の焦点面の急激な減少を観察します。
   注:TIRFは、サンプルカバースリップ界面に最も近い薄い領域(〜100nm)を励起し、細胞内からの焦点ずれ蛍光を排除しながら、開いたTGTプローブと焦点接着を強調します。TIRFが利用できない場合は、落射蛍光を使用することができる。ただし、信号対雑音比は低くなります。
4. RICMを使用してカメラの「ライブ」モードを使用してイメージングする細胞を同定します。
5. アクチン(640 nm ex)、インテグリン張力(561 nm ex)、およびパキシリン(488 nm ex)のRICM画像およびTIRF画像を取得します。200msの露光時間で順次画像を取得します。
   メモ:露出時間は、対物レンズ、レーザー出力、発光フィルタ、カメラ感度など、多くの要因に依存します。信号はバックグラウンドより少なくとも2倍大きくなければなりません。バックグラウンドは約 1000 AU なので、信号は少なくとも 2000 ~ 3000 AU である必要があります。
6. 少なくとも30セルについて4.4-4.5を繰り返します。カバースリップを交換し、焦点を合わせ、4.4-4.5を繰り返します。

5. データ解析

注:フィジーソフトウェアを使用して定量的な画像分析を実行し、統計ソフトウェアを使用して分析を実行します。

1. 1 つのセルのイメージ セットを開きます。
2. ImageJ フリーハンド選択ツールを使用して RICM 画像内のセルの境界をトレースして、セル領域のマスク(RICM マスク)を作成します。関心領域 (ROI) を ROI マネージャー (ROI マネージャー>>ツールの分析) に保存します (図 4A1,2)。
3. インテグリン張力画像内のセルの外側の代表領域を選択し、少なくとも200 x 200ピクセルのROIを描画します。他の細胞または蛍光破片をROIから除外します。測定ツール(分析>測定)を使用してROI内のバックグラウンド蛍光を測定します(図4A3)。
4. 張力画像からステップ5.2で得られた平均バックグラウンド蛍光を減算(処理>数学>減算)する(図4A4)。
5. ステップ5.2で設定したRICMマスクを使用して、セルフットプリント内の張力信号を定義します(ROIマネージャ>マスク>編集>外側をクリア>選択)します(図4A5)。
6. Huangの自動しきい値設定方法(画像>>しきい値の調整)を使用して、張力画像のしきい値マスクを作成します(図4A6)。しきい値マスクが、生成されたインテグリン張力の領域を最もよく表していることを確認してください。経験則として、しきい値を平均バックグラウンド蛍光の 2 倍に設定します。
7. しきい値テンションマスクの選択を作成します(>選択の編集>作成)(図4A7)。
8. 選択したマスクをステップ5.4で生成された張力画像に転送し、オープンプローブの積分強度を測定します(ROIマネージャ > 選択 (テンションマスク)> 分析 > 測定 > RawIntDen)(図4C)。
9. RICMマスク(ROIマネージャ > 選択 (RICMマスク)>マスク の適用 > 分析 >測定)からセルの形態測定特性領域、円形度、およびアスペクト比 を測定します(図4B)。
10. 張力マスク画像を選択し、RICMマスク(ROIマネージャ>選択(RICMマスク)または分析>測定>%面積)を適用することにより、破裂プローブによるセルフットプリントのパーセントとして定義さ>る機械的破裂密度を測定します(図4C)。
11. さらなる分析と視覚化のために測定値を統計ソフトウェアにエクスポートします。
12. すべてのセルに対して 5.1 ~ 5.11 を繰り返します。

結果

ターンオンTGTプローブを用いて、Cos−7細胞²¹におけるインテグリン媒介性細胞力学および接着形成に対するリガンド活性化上皮成長因子受容体(EGFR)の効果を調査した。プローブは、リガンド環状Arg−Gly−Asp−Phe−Lys(cRGDfK)21、23^、25、26を提示し、これは^α5β1インテグリン^27、28、29、30に対してわずかな親和性しか持たないインテグリンヘテロ二量体αVβ3に対して選択的である。TGTプローブは、ビオチン-ストレプトアビジン結合を使用してボトムストランドを介してガラスカバースリップ表面に官能化された二重鎖DNAを含む。一番上の鎖はインテグリンリガンドを表示し、細胞膜上の同族インテグリン受容体に結合するために利用可能である(図5A)。下部の鎖は蛍光色素分子で標識され、上部の鎖は消光剤で標識されているため、二重鎖TGTが無傷のときにバックグラウンド蛍光が最小限に抑えられます。インテグリンがリガンドと結合し、プローブの_Ttolよりも大きな大きさの力を加えると、DNA二重鎖が分離して蛍光が発生します(図5A)。機械的な力によって破裂していないTGTプローブは、非蛍光性のままです。この力選択的ターンオン蛍光は、回折制限分解能でpNスケールのインテグリン生成力の系統的かつ定量的なマッピングを可能にします。TGTプローブは、基質の張力閾値をさらに調節する。

ここに示すのは、56pNの_Ttol を有するTGT表面の代表例である。EGF刺激の有無にかかわらず、このTGT表面にCos-7細胞を播種し、リガンド刺激によるEGFR活性化が細胞接着およびインテグリン力学に及ぼす影響を調べた(図5A、B)。細胞をTGT表面上のEGFの有無にかかわらず60分間インキュベートし、固定し、免疫染色して、細胞骨格(F-actin)の焦点接着分布(パキシリン)および組織を表示した(図5B)。次いで、細胞をRICMおよびTIRF顕微鏡を用いて画像化した。RICM画像に明瞭に見られるように、56pN TGT表面上のCos−7細胞拡散は、刺激なしと比較してEGF刺激で有意に増強された。これをRICM画像から細胞間基質接触領域の大きさを測定することにより各条件における50個の細胞について定量した(図5C)。EGFによる刺激は、より円形の形態をもたらし、Cos−7細胞がそれらの天然の生理学的環境において拡散および増殖するのを表す(図5D)。オープンプローブからの蛍光は、張力蛍光画像で観察されるようにEGF刺激でも高い。オープンプローブの数に比例するオープンプローブの積分強度は、EGF刺激がない場合と比較してはるかに高かった(図5B、E)。これは、インテグリンが_Ttol (56pN)を超える力を加えたすべての受容体 - リガンド結合の表現である。

パキシリンによる染色は、焦点癒着の分布、数、成熟(サイズ)、および組織もEGF刺激によって影響を受けることを示した。EGF刺激細胞における焦点接着は、EGF対照なしと比較して、より成熟し、放射状に配向しているように見えた。F-アクチン細胞骨格組織も、ファロイジン染色によって評価されるように、EGF刺激で増強された(図5B)。これらの定性的評価は、両方の治療群からの画像の視覚的比較によって行われた。焦点接着の定量的分析は行うことができるが、このプロトコルの範囲外である。この実験では、TGT表面は、細胞拡散、インテグリン力学、および焦点接着形成に対するEGFR活性化の影響を体系的に詳述するためのプラットフォームを提供しました。

図1:TGT表面処理の1日目の概略図。(A)カバーグラスを清掃する。(B)カバースリップ面をエッチングする。(C)ピラニア溶液を中和する。(d)表面をシラン化して反応性アミン基を作る。(E)カバースリップを有機相に平衡化する。(F) カバースリップを不活性ガスで乾かします。(g)表面アミン基をビオチン化する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:TGT表面処理の2日目の概略図(A)カバースリップをきれいにして乾燥させ、前日から残留ビオチンを除去します。(B)BSAで不動態化して、後続のステップにおける試薬の非特異的結合を防止する。(C)ストレプトアビジンでカバースリップを機能化します。(D)サーモサイクラーでプローブをハイブリダイズさせる。(E)合成したプローブをカバースリップに塗布する (F)カバースリップを細胞イメージングチャンバー内で組み立てる。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:実験セットアップ全体にわたる幅広いステップを強調する一般的なワークフロー(A)EGF刺激の有無にかかわらず、基礎培地(DMEM)中のTGT表面上の細胞剥離およびめっきのプロセス。(b)TGT表面への付着後および拡散後の固定および免疫染色に関与するステップのフローチャート。(c)染色後、細胞をRICMおよびTIRF顕微鏡による倒立蛍光顕微鏡上で画像化する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:データ処理と定量分析の例(A)フィジーでRICMと張力画像の定量化に採用されている分析パイプライン(ImageJ)の段階的な内訳。(b)上記のパイプラインを用いて解析された細胞形態測定結果の代表例。(c)上述のパイプラインを用いて分析された細胞機械的転帰の代表例。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:TGT実験からのデータ例(A)細胞膜-TGT表面界面における接触ゾーンを強調する図。インセットは、その同族リガンドcRGDfKと相互作用するインテグリンを、EGF刺激(右)またはなし(左)で投影する。(B)56pN TGT表面に広がるCos-7細胞のRICMおよびTIRF画像。画像は、EGF刺激の有無にかかわらず60分ポストプレーティングで得られる。個々のRICM(取得済み)、インテグリン張力(グレースケール)、パキシリン(オレンジホット)、およびF-アクチン(青緑色)の画像を、両方の刺激条件についてオーバーレイで示しています。スケールバー:10μm。挿入図は、パキシリンによってマークされる接着形成部位で生成されたインテグリン張力の共局在、およびアクチンによってマークされる基礎となる細胞内細胞骨格組織の共局在を詳述するズームインROI(関心領域)を強調する。スケールバー:5μm。(C-E)EGF刺激の有無にかかわらず、Cos-7細胞の拡散領域(RICM細胞フットプリント)(C)、円形度(D)、および統合張力(E)の散布図。小節は平均±s.d.を示します。群間の差は、スチューデントのt検定で統計的に評価された。P < 0.0001.n=3つの独立した実験にわたって50細胞。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 6: 考えられるさまざまな問題を持つ TGT サーフェスの例。 (A)細胞接着前にクエンチされたプローブを組み立てた理想的なTGT表面の張力およびRICM画像。(B)TGTプローブがトップストランド(クエンチャー)を欠いているTGT表面の張力およびRICM画像。張力画像は、最下鎖における開いた蛍光色素分子からの均一な蛍光を示す。(C)理想的なTGT表面に広がる細胞の張力およびRICM画像。(D)細胞の張力およびRICM画像は、限られたパッシベーションまたは劣化プローブで、あまり作られていないTGT表面に広がる。(E) cRGDfK-インテグリン相互作用を示すcRGDfKリガンドで理想的な表面にメッキされた細胞の張力、RICMおよび明視野画像は、細胞の付着および張力生成に不可欠であることを示す。(F)TGT上にcRGDfKリガンドを含まない表面に播種された細胞の張力、RICMおよび明視野画像。細胞は明視野画像で可視であるが、細胞付着または生成されたインテグリン張力は観察されない。スケールバー:10μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

上記で概説した詳細なステップバイステップの手順により、TGT表面を調製して、EGFによる処理後の細胞付着および拡散中に接着細胞によって生成される細胞形態およびインテグリン張力を定量化することができる。簡単なプローブ設計と合成、表面処理、および簡単な実験セットアップにより、EGFRとインテグリンの相互作用を研究するための安定したプラットフォームが提供されました。全体として、この結果は、EGFRのリガンド依存性活性化が細胞拡散を増強し、インテグリン受容体の力保持特性を調整し、局所接着組織および成熟を促進することを検証した。TGTプローブを用いて得られた結果は、EGFRなどの成長因子が「メカノオーガナイザー」として作用し、インテグリン張力の量と空間組織を増加させ、焦点接着の向きと力学を調節するという包括的な仮説を支持しています。

TGT表面に適用すると、細胞はインテグリン(αVβ3)受容体がcRGDfKリガンドを感知して結合するように着陸、付着、および広がります。そうすることで、TGTプローブを機械的に破裂させ、リガンド結合部位で蛍光を発生させることができる。読み出しは、表面と相互作用する細胞の累積的な「力履歴」です。TGTサーフェスには、これらの実験中に存在する可能性のある一般的な問題がいくつかあります。高い表面バックグラウンド蛍光(図6A、B)、斑点のある表面外観、張力シグナルを生成する細胞の障害(図6C、D)、および細胞の拡散の障害(図6E、F)は、TGTプローブまたは表面合成の技術的欠点に起因する可能性がある。これらの一般的な問題の解決策を表 1 に示します。

TGTプローブの簡単な設計により、細胞生物学者は、特定のリガンドと刺激のみを提供することにより、他の細胞表面受容体からの干渉なしに、特定の成長因子インテグリンシグナル伝達結果を単離して研究するための強力なツールを提供します。さらに、TGTプローブは、pN感受性での細胞接着中の個々のインテグリン受容体に下線を引く張力閾値の調査を可能にする。代替アプローチは、固定サンプル³¹において高い空間分解能を有する個々の受容体によって及ぼされる力を報告することができない。牽引力顕微鏡は、個々のインテグリン受容体¹⁵によって加えられる力よりも一桁高いnN力にのみ敏感であり、分子張力プローブはpN力を測定するが、可逆的であるため、固定に堅牢に耐えない。これらの理由から、TGTプローブは、成長因子-インテグリン相互作用のメカニズムを研究するための魅力的なツールです。

TGTプローブに関連するいくつかの技術的なニュアンスは、実験を設計する前に考慮する必要があります。張力画像は時間のスナップショットであり、力の履歴を表し、任意の時点での受容体 - リガンドの関与の指標ではない。シグナル生成はプローブの分離に依存するため、TGT蛍光は、受容体-リガンド結合による活性緊張下にないオープンプローブから生じる。これは、TGT表面上で得られたインテグリン張力の読み出しが、本質的に歴史的かつ累積的であり、_Ttolよりも大きい力があった場所を表すことを意味する。_Ttol未満の現在の受容体リガンド力の位置は報告されていない^19,32。TGT破裂は受容体-リガンド結合の終結をもたらすので、細胞拡散は、_Ttolよりも低い力を経験するインテグリン-リガンド相互作用によるものである。したがって、ユーザーは、インテグリンベースの接着に関連する機械的結果を推定するために、めっき後の時間を定義する際に注意する必要があります。最後に、T_tol の意味を考慮する必要があります。ここで使用されるTGTプローブのTtolは56pNで、_Ttolは2秒間印加したときにプローブの50%を破裂させるのに必要な一定の力です。複雑な生物学的システムを考慮すると、TGTは、異なる時間依存性を有する不均一で多様な力グラデーションを経験する可能性が高い。TGTが_Ttolより大きい力によって破裂した場合、蛍光は総張力の過小評価となる。あるいは、より長い時間適用される_Ttol以下の力は、より短い時間に適用される高い閾値の力と同数のプローブを破裂させる可能性がある。これらのシナリオは両方とも、同じ蛍光強度読み出しをもたらし得、TGTプローブ^33、34を用いて正確な張力の大きさまたはダイナミクスを解決することを困難にする。

全体として、成長因子刺激によるインテグリン張力の評価は、内部コントロールによる実験の設計、他のマトリックスコーティングされた表面での拡散プロファイルの比較、成長因子刺激の有無における細胞におけるTGT蛍光の並行評価、および異なる_Ttolを有するTGTの使用によって慎重に行われるべきである。.TGTは、インテグリン受容体のメカニズム、局所接着ダイナミクス、および細胞拡散の調節における成長因子シグナル伝達の役割の定量化を可能にする。このプロトコルは、異なるT_tol、異なるリガンド、異なる細胞型、または異なる刺激条件を有するプローブを使用する多くのTGTベースの実験のテンプレートとして使用することができる。任意の目的のタンパク質を固定後に標識することができ、任意のタイプの定量的画像解析を実施することができる。そのため、多数のTGT実験のテンプレートを提示します。

TGTプローブの使用は、インテグリンの研究に限定されず、リガンドを修飾することによって、異なる細胞型にわたる細胞膜受容体の多様なアレイに拡張することができる。TGTプローブは、胚発生および神経新生³⁵におけるNotch受容体力学の機械的役割の同定、B細胞受容体³⁶による抗原の同定および内在化を媒介する力、およびシグナル伝達の強度および特異性を高める力の変化を検出するT細胞表面受容体の機械的プルーフリーディング能力37を含む、様々な受容体シグナル伝達カスケードを調節する力の役割を調査するために使用されてきた³⁷.これらの知見は、さまざまな実験環境におけるTGTプローブの計り知れない可能性を浮き彫りにしています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン	ミリポアシグマ	440140	表面調製
3-ヒドロキシピコリン酸(3-HPA)	ミリポアシグマ	56197	マルジ-TOF-MSマトリックス
酢酸、氷河	フィッシャーサイエンティフィ	A38S	希釈EGF
アセトニトリル(HPLC)	フィッシャーサイエンティフィ	A998SK	オリゴヌクレオチド調製
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Cell Signaling Technology	8878S	Immunocytochemistry
Ammonium Chloride	Fisher Scientific	A687	Immunocytochemistry
抗パキシリン抗体 [Y113]	Abcam	ab32084	Immunocytochemistry
BD Syringes only with Luer-Lok	BD bioscience	309657	Surface
Preparation Bio-Gel P-2	バイオ・ラッド	1504118	オリゴヌクレオチド調製
ウシ血清アルブミン (BSA) プロテアーゼフリー粉末	フィッシャーサイエンティフィック	BP9703100	表面調製
Cos-7 細胞		ATCC CRL-1651	細胞培養、継代番号 11-20
カバースリップ ミニラック、カバースリップ 8 枚用	フィッシャーサイエンティフィック	C14784	表面調製
c(RGDfK(PEG-PEG)), PEG=8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸	ビビチド	PCI-3696-PI	オリゴヌクレオチド製剤
Cy3B NHSエステル	GEヘルスケア	PA63101	オリゴヌクレオチド製剤
ジメチルホルムアミド	ミリポアシグマ	PHR1553	オリゴヌクレオチド製剤
L-グルタミン、4.5g / Lグルコース、ピルビン酸ナトリウムを含むDMEM	ッシャーサイエンティフィック	MT10013C	細胞培養
上皮成長因子ヒトEGF	ミリポアシグマ	E9644	細胞培養
エタノール、200プルーフ(100%)	フィッシャーサイエンティフィック	22032601	表面調製
ファルコン標準組織培養皿	フィッシャーサイエンティフィック	08-772E	表面調製
胎児ウシ血清	フィッシャーサイエンティフィック	10-438-026	細胞培養
フルロブライトDMEM	Fisher Scientific	A1896701	Cell Culture
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21244	Immunocytochemistry Goat
Serum	Fisher Scientific	16-210-064	Immunocytochemistry
Hank'Fisher	Scientific	14-170-161	細胞培養
馬血清	Fisher Scientific	16050130	免疫細胞化学
過酸化水素	Fisher Scientific	H325-500	表面調製
Nanosep MF 遠心装置	ポール研究室	ODM02C35	オリゴヌクレオチド調製
NHS-アジ	ド フィッシャー科学的な	88902	オリゴヌクレオチドの準備
窒素ガスシリンダー	空気ガス		表面処理
No.2丸いガラスカバースリップ-25 mm	VWR	48382-085	表面処理
パラフィルムM実験室フィルム	フィッシャーサイエンティフィック	13-374-10	表面処理
パラホルムアルデヒド16%	フィッシャーサイエンティフィック	50-980-487	免疫細胞化学
PBS, 1X	Fisher Scientific	21-030-CV	表面調製/免疫細胞化学
ペニシリン-ストレプトマイシン (5,000 U/mL)	Fisher Scientific	15-070-063	細胞培養
PYREX 低型グリフィンビーカー	Fisher Scientific	02-540G	表面調製
アスコルビン酸ナトリウム	Fisher Scientific	18-606-310	オリゴヌクレオチド調製
重炭酸ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィ	S233	オリゴヌクレオチド調製
塩化ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィ	BP358	表面調製
ストレプトアビジン	フィッシャーサイエンティフィック	434301	表面調製
スルホ-NHS-LC-ビオチン	フィッシャーサイエンティフィ	21335	表面調製
硫酸	フィッシャーScientific	A300-500	表面調製
TEAA	フィッシャー サイエンティフィ	NC0322726	オリゴヌクレオチド調製
トリエチルアミン	ミリポア シグマ	471283	オリゴヌクレオチド調製
トリフルオロ酢酸 (TFA)	フィッシャー サイエンティ	サイエン	オリゴヌクレオチド調製
THPTA	フィッシャー サイエンティフィック サイエンティフィ	ック NC1296293	オリゴヌクレオチドの調製
Triton X 100 Detergent Surfact Ams Solution	Fisher Scientific	85111	免疫細胞化学
水、DNA グレード、DNASE、プロテアーゼフリー	Fisher Scientific	BP24701	オリゴヌクレオチド Preparation
Equipment
Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 カラム、4.6 x 150 mm、2.7 μm	Agilent	653950-702	オリゴヌクレオチド調製
高速液体クロマトグラフィー	Agilent	1100	オリゴヌクレオチド調製
低速軌道シェーカー	フィッシャーサイエンティフィック	10-320-813	免疫細胞化学
マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析計 (MALDI-TOF-MS)ボ	イジャー STR		オリゴヌクレオチド調製
分子プローブ Attofluor セルチャンバー	フィッシャーサイエンティフィック	A7816	表面調製
ナノドロップ2000 UV-Vis分光光度計	サーモフィッシャー		オリゴヌクレオチド調製
ニコンエクリプス Ti倒立顕微鏡	PE ニコン	顕微鏡
パーフェクトフォーカスシステム	ニコン		顕微鏡
NIS Elements software	ニコン		顕微鏡
ORCA-Flash4.0 V3 デジタルCMOSカメラ	浜松顕微鏡
クワッドバンド TIRF 405/488/561/647 cube	CHROMA		顕微鏡
RICM Cube	CHROMA		顕微鏡
SOLA v-nIR Light Engine	Lumencor		顕微鏡
Thermo Forma Steri Cycle370 CO2インキュベーター	フィッシャーサイエンティフィック		細胞培養
VWR75D超音波	クリーナーVWR13710		表面準備
データ分析			Use
フィジー(画像J)		https://imagej.net/software/fiji/downloads	定量分析
グラフパッドプリズム	グラフパッド		統計解析
オリゴ名<	strong>5'修飾/ 3'修飾	配列(5'〜3')	Use
>Alkyne-21-BHQ2	5'ヘキシニル/ 3'BHQ_2	GTGAAATACCGCAGATGCG	トップストランドTGTプローブ
56pN TGT	5'Biosg/TTTTTT/iUniAmM	CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT	ボトムストランド TGT プローブ
12 pN TGT	5' AmMC6/ 3' BioTEG	CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT	ボトムストランド TGT プローブ