Method Article

生きた シロイヌナ ズナ根の表皮細胞の物性を調べる原子間力顕微鏡

DOI:

10.3791/63533

⸱

March 31st, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía, Universidad de la República (UdelaR), 2Laboratorio de Señalización Celular y Nanobiología, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE)

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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原子間力顕微鏡インデンテーションプロトコルは、正常または制約された成長中(すなわち、水不足下)の組織または器官の特定の細胞の細胞壁の物理的特性の役割を解剖する可能性を提供する。

Abstract

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ここでは、原子間力顕微鏡(AFM)と光学倒立蛍光顕微鏡を組み合わせたナノインデンテーションにより、生きているシロイヌナズナの根の表皮細胞の細胞壁の物理的特性を特徴付ける方法について説明します。この方法は、サンプルの変形を測定しながら制御された力を加えることで構成され、細胞壁の見かけのヤング率などのパラメータを細胞内分解能で定量化できます。サンプルの慎重な機械的固定化と、圧子とくぼみの深さの正しい選択が必要です。外部組織でのみ使用できますが、この方法は、発生中の植物細胞壁の機械的変化を特徴付けることを可能にし、これらの微視的変化と臓器全体の成長との相関を可能にします。

Introduction

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植物細胞は、細胞の種類や成長段階に応じて厚さが0.1から数μmまで変化する多糖類、タンパク質、代謝物、水の相互作用ネットワークで構成される複雑な構造である細胞壁に囲まれています1,2。細胞壁の機械的特性は、植物の成長に不可欠な役割を果たします。細胞壁の低い剛性値は、細胞増殖と細胞壁拡張の前提条件として提案されており、すべての細胞がその機能を実行するために機械的な力を感知するという証拠が増えています。しかし、細胞壁の物理的性質の変化が細胞の運命を決定するかどうかはまだ議論されています2,3,4。植物細胞は発生中に動かないため、臓器の最終的な形状は、細胞がどれだけ遠く、どの方向に拡大するかによって異なります。したがって、シロイヌナズナの根は、根の異なる領域で異なるタイプの増殖が起こるため、細胞増殖における細胞壁の物理的特性の影響を研究するための優れたモデルです。例えば、異方性拡大は伸長帯において、特に表皮細胞5において顕著に顕著である。

ここで説明した方法は、倒立蛍光位相顕微鏡6と組み合わせた原子間力顕微鏡(AFM)を使用して、生き....

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Protocol

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1.植物材料の調製と成長条件

  1. 必要な植物材料を生成するには、シロイヌナズナ野生型の種子と目的の変異株を滅菌します。
    注:このプロトコルでは、以下を使用しました:ttl1:T-DNA挿入ラインSalk_063943(TTL1の場合;AT1G53300) - コロンビア-0(Col-0)野生型;Procuste1(prc1-1)変異体は、10,11で前述したように、CESA6遺伝子(AT5G64740)のノックアウト変異(Q720stop)からなる。およびTTL1 x PRC1-1二重変異体。
    1. 約50μLの種子をマイクロチューブに入れます。室温で500 μLの70%エタノール+ 0.01%トゥイーン溶液を加えます。混合して7分間インキュベートします。
    2. エタノール溶液を注ぎ、500μLの20%次亜塩素酸ナトリウムを加える。混合して7分間インキュベートします。
    3. 次亜塩素酸ナトリウム溶液を注ぎ、滅菌水で種子を3〜4回洗います。
  2. 鍍金
    1. 基礎ムラシゲおよびスクーグ(MS)培地12 +1.5%スクロース+....

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Results

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フォースインデンテーション実験
次のテキストは、プロトコルが適切に実行されたときに予想される典型的な出力を示すために、フォースインデント実験を実施したときに予想されるいくつかの結果を示しています。

力-変位曲線
根伸長ゾーンの細胞の中心に配置された位置で生きたサンプルをインデントして得られた代表的な力押し込みプロットを 図2に示します。AFMチップが細胞壁の表面をくぼみ始めると、変形に対する細胞壁の反対のために力が増加し始めます( 図2Aの1で示されています)。力(荷重)の増加は、最大力値に達するまで続きます( 図2Aの2で示されています)。この時点以降、インデントのアンロード部分が始まります。

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Discussion

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細胞および細胞壁の力学は、力学が成長プロセスにどのように影響するかについての洞察を得るためにますます関連性が高まっています。物理的な力が固体組織内でかなりの距離にわたって伝播するにつれて、細胞壁の物理的特性の変化と、それらがどのように感知され、制御され、調整され、植物の成長に影響を与えるかの研究は、重要な研究分野になりつつあります2,3,8。

ここでは、シロイヌナズナの根の伸長帯における細胞の細胞壁物性を調べる方法を紹介します。AFM技術は、根の成長における細胞壁の物理的特性の影響を理解するために、成長率研究などの他の技術と容易に組み合わせることができる。

最も重要な実験ステップの1つは、サンプルの機械的固定化です。サンプルは、インデント中のサンプルの移動を避けるためにしっかりと取り付けられている必要があります。シリコーン接着剤の層は、すばや.......

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Disclosures

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著者には利益相反はありません。データのフィッティングに使用されるMATLABスクリプトは、個人的な要求に応じてJ.C.Bに書面で入手できます。

Acknowledgements

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この研究は、CSIC I + D 2018、助成金番号95(マリアナソテロシルベイラ)によって資金提供されました。CSICグルポス(オマールボルサニ)とペデシバ。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 x リン酸緩衝生理食塩水(PBS)塩化ナトリウムとリン酸緩衝液を含み、浸透圧ショックを防ぎ、生細胞の水分バランスを維持するために配合されています。
AFMソフトウェアBruker, Billerica, MA, USA
原子間力顕微鏡(AFM)BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA
Catalyst プローブホルダー-流体Bruker, Billerica, MA, USACAT-FCHBioscope Catalyst用のプローブホルダーで、接触モードまたはタッピングモードでの流体操作用に設計されています。 エアー操作にも対応。
極低温浸透圧計; model OSMOMAT 030Gonotech, Berlin, Germany
Murashige &Skoog MediumDuchess BiochemieM0221Original concentration, (1962)
Optical inverted microscope coupled to the AFMOlympus IX81, Miami, FL, USA
PEGAMILANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina100429中性、非酸性シリコーン接着剤
ペトリ皿Deltalab200201.Bポリスチレン、55 x 14 mm、放射線滅菌。
ヨウ化プロピジウムSigmaP4170根の生存率試験用。
窒化ケイ素プローブ、DNP-10、カンチレバーABruker、Billerica、MA、USADNP-10/A液体運転における力変調顕微鏡用。プローブ先端半径は20-60nmです。175-μm-long三角カンチレバー、 ばね定数は0.35N/mです。
ピンセットΣT4537

References

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  1. Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
  2. Roeder, A. H. K., et al. Fifteen compelling open questions in plant cell biology. The Plant Cell.....

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