標的下での超低入力切断とヌクレアーゼを用いた放出を用いたクロマチン上の単一細胞因子局在化

Summary

CUT&RUNおよびその変異体は、クロマチン上のタンパク質占有率を決定するために使用することができる。このプロトコルは、単一細胞uliCUT&RUNを使用してクロマチン上のタンパク質局在を決定する方法を説明しています。

Abstract

クロマチン上のタンパク質の結合位置を決定することは、その機能および潜在的な調節標的を理解するために不可欠である。クロマチン免疫沈降(ChIP)は、30年以上にわたりタンパク質の局在を決定するためのゴールドスタンダードであり、超音波処理または酵素消化クロマチンから目的のタンパク質を引き出すための抗体の使用によって定義されています。より最近では、抗体テザリング技術は、その感度の増加のためにクロマチン上のタンパク質局在を評価するために普及している。Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN) は、クロマチン免疫切断 (ChIC) のゲノムワイド誘導体であり、ミクロコッカスヌクレアーゼ (pA-MNase) に連結された組換えプロテイン A を利用して、目的のタンパク質を標的とする抗体の IgG 定常領域を同定し、目的のタンパク質に隣接する DNA の部位特異的切断を可能にします。CUT&RUNは、ヒストン修飾、転写因子、およびヌクレオソームリモデリング因子などの他のクロマチン結合タンパク質をプロファイリングするために使用することができる。重要なことに、CUT&RUNは、真色または異色に関連するタンパク質およびヒストン修飾のいずれかの局在化を評価するために使用することができる。これらの理由から、CUT&RUNは広範囲のタンパク質の結合プロファイルを決定するための強力な方法です。最近、CUT&RUNは低集団の細胞および単一細胞における転写因子プロファイリングに最適化されており、最適化されたプロトコルは超低入力CUT&RUN(uliCUT&RUN)と呼ばれています。ここでは、uliCUT&RUNを使用した単一細胞因子プロファイリングのための詳細なプロトコルを、手動の96ウェル形式で提示する。

Introduction

多くの核タンパク質は、クロマチンと相互作用してDNAテンプレート化された活性を促進または防止することによって機能する。これらのクロマチン相互作用タンパク質の機能を決定するためには、これらのタンパク質が結合しているゲノム位置を特定することが重要です。1985年の開発以来、クロマチン免疫沈降法(ChIP)は、タンパク質がクロマチン^1,2に結合する場所を特定するためのゴールドスタンダードとなっています。従来のChIP技術は、以下の基本的なワークフローを有する:細胞を回収し、架橋し(通常はホルムアルデヒドで)、クロマチンを剪断し(通常は架橋を必要とする過酷な超音波処理法で)、目的のタンパク質を標的とする抗体を用いて免疫沈降させ、続いて二次抗体(アガロースまたは磁気ビーズに結合)、架橋を逆転させ、 タンパク質とRNAを消化してDNAを精製し、このChIP富化DNAを分析のテンプレートとして使用します(放射性標識プローブ^1、2、qPCR³、マイクロアレイ⁵、⁶、またはシーケンシング⁴を使用)。マイクロアレイと超並列ディープシーケンシングの出現により、ChIPチップ^5,6およびChIP-seq⁴が最近開発され、クロマチン上のタンパク質局在のゲノムワイドな同定が可能になりました。ChIPの架橋は、ChIP-exo⁷およびChIP-nexus⁸による解像度の大幅な進歩により、その出現以来強力で信頼性の高い技術でした。ChIP-seqの開発と並行して、ChIP(N-ChIP)のネイティブ(非架橋)プロトコルが確立されており、従来の架橋ChIP技術⁹で行われる超音波処理とは対照的に、クロマチンを断片化するためにヌクレアーゼ消化(しばしばミクロコッカスヌクレアーゼまたはMNaseを使用する)を利用する。しかし、ChIPとN-ChIPの両方の架橋技術に対する大きな欠点の1つは、実験操作後のDNA収率が低いため、高い細胞数が必要であることです。したがって、近年では、低セル入力のためのChIP技術の最適化に向けて多くの努力が払われています。これらの努力の結果、適用性と入力要件が異なる多くの強力なChIPベースの技術が開発されました10,11,12,13,14,15,16,17,18。しかし、単一細胞ChIP-seqベースの技術は、特に非ヒストンタンパク質については欠けていた。

2004年、クロマチン内因性切断(ChEC)およびクロマチン免疫切断(ChIC)¹⁹と呼ばれるクロマチンのタンパク質占有率を決定するための代替技術が開発されました。これらの単一遺伝子座技術は、目的のタンパク質(ChEC)またはプロテインA(ChIC)のいずれかへのMNaseの融合を利用して、目的のタンパク質に隣接するDNAを直接切断します。近年、ChECとChICの両方がクロマチン(それぞれChEC-seqとCUT&RUN)上のゲノムワイドタンパク質プロファイリングに最適化されています^20,21。ChEC-seqは因子の局在を決定するための強力な技術ですが、各標的に対してMNase融合タンパク質を開発する必要がありますが、ChICとそのゲノムワイドバリエーションであるCUT&RUNは、目的のタンパク質に向けられた抗体(ChIPと同様に)と組換えプロテインA-MNaseに依存しており、プロテインAは抗体のIgG定常領域を認識できます。代替として、より広い範囲の抗体定常領域を認識できる融合プロテインA/プロテインG-MNase(pA/G-MNase)が開発されている²²。CUT&RUNは、クロマチンゲノムワイドでのタンパク質局在を決定するためのChIP-seqの代替手段として急速に普及しています。

超低入力CUT&RUN(uliCUT&RUN)は、低セル入力とシングルセル入力の使用を可能にするCUT&RUNのバリエーションであり、2019²³で説明されました。ここでは、手動の96ウェルフォーマット単一セルアプリケーションのための方法論が説明される。uliCUT&RUNの開発以来、ヒストンプロファイリングのための2つの選択肢であるCUT&TagとiACT-seqが開発され、ヒストンタンパク質の堅牢で高度に並列なプロファイリングが提供されていることに注意することが重要です^24,25。さらに、scCUT&Tagは、単一細胞内の複数の因子のプロファイリング(multiCUT&Tag)および非ヒストンタンパク質への適用のために最適化されている²⁶。CUT&RUNは、細胞ソーターと標準機器にアクセスできる分子生物学ラボでuliCUT&RUNを実行できる低入力ChIP-seqの魅力的な代替手段を提供します。

Protocol

倫理的声明:すべての研究は、ピッツバーグ大学のInstitutional Biosafety Office of Research Protectionsによって承認されました。

1. 磁気ビーズの調製

メモ:細胞選別の前に行い、使用するまで氷の上に保持してください。

1. 反応ごとに30 μLのConA結合常磁性微小球ビーズスラリーを新鮮な1.5 mLマイクロフュージチューブに混合し、850 μLの結合バッファーを加え、穏やかにピペッティングして混合します。
   注:ConA結合型常磁性微小球は、脂質膜結合を可能にするレクチンコーティングされた磁気ビーズである。
2. チューブを磁気ラックの上に置き、ビーズが1〜2分間磁化するようにします。上澄み液がきれいになったら、ビーズを乱すことなく上澄み液を取り出して捨てます。
3. 磁気ラックからチューブを取り出し、1 mL の結合バッファーに再懸濁してビーズを洗浄します。
4. 手順 1.2 と 1.3 を繰り返します。
5. ビーズを2分間磁化し、上清を除去して廃棄する。
6. 磁気ラックからチューブを取り出し、反応ごとにビーズを30 μLの結合バッファーに再懸濁します。
7. 細胞が選別されるまで、洗浄したビーズミックスを氷の上に保持する。

2. 細胞の採取

注:このステップは、接着細胞用に書かれており、マウスE14胚性幹細胞用に最適化されています。細胞の培養および回収は、細胞種に依存する。

1. 細胞を37°Cのインキュベーターから取り出し、顕微鏡下で検査して品質を保証します。
2. 細胞プレートから培地を吸引し、5mLの1x PBSですすいでください。
3. プレートからPBSを吸引し、細胞を回収する(細胞タイプによって異なる従来の細胞採取方法を使用する)。必要に応じて培養皿に対して血清学的ピペットで上下に穏やかにピペッティングすることにより単一細胞懸濁液を得る。
4. 細胞懸濁液を15mL円錐管に移し、200 x g で5分間スピンダウンする。
5. 培地を吸引して細胞ペレットを廃棄し、5mLのPBS+1%FBSで洗浄する。
6. 細胞を200 x g で5分間スピンダウンし、上清を捨て、細胞ペレットを5mLのPBS+1%FBSに再懸濁する。
7. 細胞を数え、1 mLの1 x¹⁰⁶ 細胞を新鮮な1.5 mLマイクロフュージチューブに移す。
8. 5 μL の 7-アミノアクチノマイシン D (7-AAD) を加え、チューブウェルを反転させて混合し、サンプルをセルソーターに塗布して、生単一細胞を 96 ウェルプレートの個々のウェルに選別します。
   注:7-AAD色素は生細胞から除外されているため、生細胞選別に使用できます。

3. 細胞の選別と溶解

1. 細胞ソーティングの前に、各ウェルに 100 μL の核抽出 (NE) バッファーを含むセルソーター対応の 96 ウェルプレートを用意します。
2. 製造元の指示に従って細胞を96ウェルプレートに分類します。
3. プレートを素早く回転させ(600 x g (30 秒間)、細胞がウェル内のバッファー内にあることを確認します。
   注:予備実験では、使用されている細胞が確実にウェルの底に持ち込まれているかどうかをテストする価値があります。
4. サンプルを氷の上に15分間保持します。
5. サンプルを 600 x g で 4 °C で 5 分間スピンダウンし、慎重にピペットで上清を除去しました (5 μL を残します)。
6. 各サンプルを 55 μL の NE バッファーに再懸濁し、30 μL の予備洗浄した ConA 結合常磁性ミクロスフェア (ステップ 1.7 から、結合バッファー内) を各反応に加えます。
7. 室温で10分間インキュベートする。

4. MNaseによる早期消化を防ぐためのサンプルのプレブロック

1. プレートを96ウェルの磁気ラックに置き、ビーズが最低5分間結合するのを許してから、上清を取り出して廃棄します。
2. 核結合ビーズに100 μLのブロッキングバッファーを加え、穏やかなピペッティングで混合します。
3. 室温で5分間インキュベートする。

5. 一次抗体の添加

1. プレートを96ウェル磁気ラックに置き、上清を最低5分間透明にしてから、ビーズを乱すことなく上清を取り除いて廃棄します。
2. 磁気ラックからプレートを取り出し、穏やかなピペッティングで反応ごとにビーズを100 μLのウォッシュバッファーに再懸濁します。
3. プレートを 96 ウェル磁気ラックに戻し、上清が除去されるのを待ってから、上清を取り出して廃棄します。
4. 穏やかなピペッティングで反応ごとにビーズを25 μLのウォッシュバッファーに再懸濁します。
5. 一次抗体マスターミックスを作成します:1反応あたり25 μLのウォッシュバッファー+ 0.5 μLの抗体。
6. 核結合ビーズを穏やかにボルテックスしながら、目的のタンパク質を標的とする抗体で処理する各サンプルに25 μLの一次抗体マスターミックスを追加します(通常、最終希釈は1:100)。コントロールを行う場合は、抗体を含まない洗浄バッファーを25 μL加える。
7. 室温で1時間インキュベートする。
8. サンプルを96ウェルの磁気ラックに置き、上澄み液を最低5分間透明にしてから、ビーズを乱すことなく上澄み液を取り出して廃棄します。
9. 磁気ラックからプレートを取り出し、ビーズを100μLの洗浄バッファーで洗浄し、ピペッティングで再懸濁します。

6. pA-MNaseまたはpA/G-MNaseの添加

注: プロテイン A は、ウサギなどの特定の種の IgG 分子に対して高い親和性を持ちますが、マウスやラットなどの他の種の IgG には適していません。あるいは、プロテインA/G-MNaseを使用することができる。このハイブリッドは、ウサギ、マウス、およびラットのIgGsに結合し、マウスまたはラットの一次抗体が使用される場合の二次抗体の必要性を回避する。

1. プレートを96ウェル磁気ラックに戻し、上澄み液を最低5分間透明にしてから、ビーズを乱すことなく上澄み液を取り出して廃棄します。
2. 磁気ラックからプレートを取り出し、各サンプルを25 μLのウォッシュバッファーに再懸濁します。
3. pA-MNase マスターミックス (25 μL のウォッシュバッファー + 1 反応あたりの最適化された量の pA-MNase )を作成します。
4. 穏やかにボルテックスしながら、対照サンプルを含む各サンプルに25 μLのpA-MNaseマスターミックスを加える。
   注:pA-MNaseの濃度は、自家製であれば調製時に変化し、各独立した精製時に使用前に試験する必要があります。pA/G-MNaseの場合、20倍のストックを2.5 μL使用する必要があります。
5. サンプルを室温で30分間インキュベートする。
6. プレートを96ウェル磁気ラックに置き、上清を最低5分間透明にしてから、ビーズを乱すことなく上清を取り除いて廃棄します。
7. 磁気ラックからプレートを取り出し、ビーズを100 μLのウォッシュバッファーで洗浄し、穏やかなピペッティングで再懸濁します。

7. 指向性DNA消化

1. プレートを 96 ウェルの磁気ラックに置き、上清を最低 5 分間クリアしてから、上清を除去して廃棄します。
2. 磁気ラックからサンプルを取り出し、穏やかなピペッティングによってビーズを50μLのウォッシュバッファーに再懸濁します。
3. サンプルを氷/水混合液中で5分間0°Cに平衡化します。
4. サンプルを0°Cの氷/水浴から取り出し、マルチチャンネルピペットを使用して100mM_CaCl2 を1 μL加えます。大容量のマルチチャンネルピペットを使用して穏やかなピペッティングでよく混合(3〜5回)し、サンプルを0°Cに戻します。
   注:ここでうまくミキシングすることは不可欠です。_CaCl2 は、目的のタンパク質に隣接するDNAのMNase消化を活性化するために添加される。
5. プレートが氷/水浴に戻ったらすぐに10分のタイマーを開始します。
6. 50 μLの2XRSTOP+バッファーを各ウェルにピペッティングして反応を停止し、_CaCl2 と同じ順序で添加した。
   注:過誤を防ぐために、10分の消化が終わる前に2XRSTOP+バッファを作成してください。

8. サンプル分別

1. サンプルを37°Cで20分間インキュベートする。
2. プレートを 16,000 x g で 4 °C で 5 分間回転させます。
3. プレートを96ウェル磁気ラックに置き、上清を最低5分間透明にし、上清を新鮮な96ウェルプレートに移します。ビーズを捨てます。

9. DNA抽出

1. 各サンプルに10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)1 μLおよび20 mg/mLプロテイナーゼK0.83 μLを加えます。
   警告: SDS 粉末は吸入すると有害です。換気の良い場所では、ゴーグル、手袋、N95グレードの呼吸用保護具を着用し、取り扱いには注意が必要です。
2. 穏やかなピペッティングでサンプルを混ぜる。
3. サンプルを70°Cで10分間インキュベートする。
4. プレートを室温に戻し、46.6 μLの5 M NaClおよび90 μLの50%PEG 4000を添加する。穏やかなピペッティングで混ぜる。
5. 各サンプルに33 μLのポリスチレン - マグネタイトビーズを加え、室温で10分間インキュベートする。
   注:ポリスチレン - マグネタイトビーズを室温(〜30分)に持ち込み、使用する前によく混ぜてください。
6. プレートを磁気ラックの上に置き、上澄み液を約5分間透明にしてから、ビーズを乱すことなく上澄み液を慎重に捨てます。
7. ビーズを乱すことなく、150μLの80%エタノールで2xをすすいでください。
   警告:エタノールは非常に可燃性であり、皮膚、目、および肺の刺激を引き起こします。この手順は、適切な実験用衣服と通気フードに入れて実行します。
8. プレートを1000 x g で30秒間短時間回転させます。プレートを96ウェル磁気ラックに戻し、ビーズを乱すことなく残りのEtOHをすべて取り除きます。
9. サンプルを約2〜5分間空気乾燥させます。
   メモ:ビーズを5分以上乾燥させないでください。EtOHの除去に勤勉であれば、2〜3分間の乾燥で十分である。
10. ビーズを37.5 μLの10 mM Tris-HCl(pH 8)で再懸濁し、室温で5分間インキュベートします。
11. プレートを磁気ラックの上に置き、ビーズが 5 分間結合するのを待ちます。
12. 36.5 μLの上清を新鮮なサーモサイクラー互換96ウェルプレートに移す。ビーズを捨てます。
    注: 実験は、サンプルを -20 °C で保存することでここで停止することも、ライブラリのビルドを続行することもできます (手順 10 ~ 15)。

10. 末端修復、リン酸化、アデニル化

注:試薬は、 材料表で参照されているように供給されています。以下のプロトコールは、NEBNext Ultra DNA IIキットなどの市販キットと同様の方法に従う。

1. 5 U/μL の T4 DNA ポリメラーゼを 1 x T4 DNA リガーゼバッファーで 1:20 に希釈します。
2. エンドリペア/3'A マスターミックスを調製します: 2 μL の 10x T4 DNA リガーゼバッファー、2.5 μL の 10 mM dNTP、1.25 μL の 10 mM ATP、3.13 μL の 40% PEG 4000、0.63 μL の 10 U/μL T4 PNK、0.5 μL の希釈 T4 DNA ポリメラーゼ、0.5 μL の 5U/μL Taq DNA ポリメラーゼ、1 反応あたりの総容量 13.5 μL です。
   注:ピペッティングする前に、必ず40% PEG 4000を室温に持っていきましょう。
3. 13.5 μL のエンドリペア/3'A マスターミックスを 36.5 μL の DNA に加えます。
4. 反応をクイックボルテックスで混合し、次にクイックスピン(500 x g で10秒間)を混合します。
5. 温度>20°Cの加熱蓋を備えた予め冷却されたサーモサイクラー中で以下の反応条件を用いてインキュベートする。 使用反応条件:12°Cで15分間、37°Cで15分間、72°Cで20分間、4°Cで保持する。

11. アダプターライゲーション

メモ: 次の反応を設定している間、サンプルを氷の上に保管してください。ピペッティングする前に、リガーゼ緩衝液を室温にします。アダプター( 材料表を参照)を、10 mM NaCl (pH 7.5) を含む 10 mM Tris-HCl の溶液で希釈します。収量が低いため、CUT&RUN濃縮DNAを事前に定量しないでください。むしろ、0.6 μMの最終作業アダプター濃度を使用して、アダプターの 25 倍希釈を生成します。

1. ライゲーションマスターミックスを作成します:55 μLのリガーゼバッファー(2x)、5 μLのT4 DNAリガーゼ、および5 μLの希釈アダプター(1反応あたりの総容量65 μL)。
2. ステップ10.5のマスターライゲーションミックスを50 μLのDNAに加えます。
3. クイックボルテックスで混合し、続いてクイックスピニング(10秒間500 x g )を行います。
4. サーモサイクラー(加熱蓋なし)中で20°Cで15分間インキュベートする。
   メモ: すぐに次の手順に進みます。

12. ユーザーダイジェスト

1. 各サンプル、ボルテックス、およびスピンに3 μLのUSER酵素を加えます(500 x g で10秒間)。
2. サーマルサイクラー中で37°Cで15分間インキュベートする(加熱蓋を50°Cに設定した)。

13. ライゲーション反応後のポリスチレン-マグネタイトビーズクリーンアップ

注:ポリスチレン - マグネタイトビーズが室温(〜30分)で平衡化するようにします。ボルテックスは、使用前にビーズ溶液を均質化する。室温で以下の手順を実行します。

1. アダプターライゲーションDNAを含むポリスチレン - マグネタイトビーズ溶液39 μL(0.33x)を各ウェルに加えます。
2. ピペッティングで十分に混合し、サンプルを室温で15分間インキュベートして、DNAをビーズに結合させます。
3. サンプルを96ウェル磁気ラックに置き、上清が透明になるまで5分間インキュベートします。
4. プレートを磁気ラックに保管し、ビーズを乱すことなく上澄み液を慎重に取り出して捨てます。
5. ビーズを邪魔することなく、200 μLの80%EtOHでビーズをすすいでください。
6. 96ウェルの磁気ラックで30秒間インキュベートして、溶液をクリアできるようにします。
7. ビーズを乱すことなく上清を取り出して捨てる。
8. 手順 13.5 ~ 13.7 を繰り返して、合計 2 回の洗浄を行います。
9. プレートを 500 x g で 10 秒間短時間回転させ、プレートを 96 ウェルの磁気ラックに戻して、ビーズを乱すことなく残留 EtOH を除去します。
10. プレートを磁気ラックに保管し、サンプルを2分間空気乾燥させます。
    メモ: ビーズを乾かしすぎないでください。
11. 磁気ラックからプレートを取り出し、ビーズを28.5 μLの10 mM Tris-HCl(pH 8)に再懸濁します。
    警告: 塩酸は非常に腐食性があります。ユーザーは、ゴーグル、手袋、および白衣を着用した化学ヒュームフードで慎重に取り扱う必要があります。
12. 泡を出さないように注意しながら、ピペッティングでビーズを徹底的に再懸濁してください。
13. 室温で5分間インキュベートする。
14. プレートを96ウェル磁気ラックに置き、溶液を5分間透明にします。
15. 上清27.5 μLを新しいPCRプレートに移し、ビーズを捨てる。

14. 図書館の充実

注:プライマーはアダプターと同じ溶液で希釈します。このライブラリー構築には、0.6 μM の最終作業プライマー濃度を使用します。

1. 希釈されたインデックス付きプライマー( 材料表を参照)を各サンプルに5 μL加える。
   注:各サンプルは、シーケンシング後に識別するために異なるインデックスを必要とします。
2. PCR マスターミックスを調製します: 10 μL の 5x ハイフィデリティ PCR バッファー、1.5 μL の 10 mM dNTP、5 μL の希釈ユニバーサルプライマー、1 μL の 1 U ホットスタートハイフィデリティポリメラーゼ、1 サンプルあたり 17.5 μL のマスターミックス総量。
3. 精製アダプターライゲーション DNA 32.5 μL に 17.5 μL pf PCR ミックスを追加します (このボリュームには 5 μL のインデックス付きプライマーが含まれています)。
4. 溶液をピペッティングで混合する。
5. 最大ランプ速度が3°C/sの以下の反応条件を用いてサーモサイクラー内でインキュベートする:98°Cで45秒、98°Cで45秒、60°Cで10秒、第2および第3のステップを21回繰り返し、72°Cで1分間、4°Cで保持する。
   注:サンプルは、短期保存の場合は4°C、長期保存の場合は-20°Cに保持できます。

15. ポリスチレン - マグネタイトビーズのクリーンアップ

1. 各サンプルに60 μL(1.2倍)のポリスチレン - マグネタイトビーズを加える。
2. ビーズをピペッティングにより再懸濁し、室温で15分間インキュベートした。
3. 溶液が透明になるまで、プレートを磁気ラックに5分間置きます。
4. 上清を捨て、ビーズを乱すことなく200 μLの80%EtOHでビーズをすすいでください。
5. 洗浄ステップを繰り返して、合計2回の80%EtOH洗浄を行います。
6. プレートを 500 x g で 10 秒間回転させ、プレートを 96 ウェルの磁気ラックに置き、ビーズが 5 分間結合するのを許します。
7. ピペットは、ビーズを乱すことなく余分なEtOHを除去し、ビーズを2分間風乾させる。
   メモ: ビーズを乾かしすぎないでください。
8. ビーズをヌクレアーゼフリー水21 μLに再懸濁し、室温で5分間インキュベートする。
9. プレートを磁気ラックの上に置き、溶液を5分間透明にします。
10. 上清20 μLを新しいプレートに移す。
    注:実験は、サンプルを-20°Cで保管することでここで停止することができます。
11. 1x HS試薬を使用して、蛍光光度計( 材料表を参照)でライブラリー濃度を定量します。
12. 濃度が許せば、1.5%アガロースゲル上に30ngのサンプルを低分子量はしごで実行して可視化します。または、フラグメントアナライザーまたは関連する機器で視覚化します。
13. Illuminaプラットフォーム上のシーケンスライブラリは、〜50,000〜100,000個の一意にマッピングされた読み取りを取得します。

Results

ここでは、96ウェルの手動フォーマットuliCUT&RUNを使用してクロマチン上の単一細胞タンパク質プロファイリングのための詳細なプロトコルを提示する。結果は、プロファイリングされるタンパク質(タンパク質の存在量および抗体品質による)、細胞型、およびその他の寄与因子によって異なるが、この技術の予想される結果については、ここで説明する。細胞品質(細胞の外観および生細胞の割合)および単一細胞選別は、NE緩衝液への生細胞選別の前または時に評価されるべきである。ES細胞コロニーおよび細胞選別の一例を図2A、Bに示す。具体的には、低品質の細胞は使用すべきではなく、品質が問題となる場合は、特定の細胞種のガイドラインに従うように注意する必要があります。さらに、細胞選別装置による正確な細胞選別は、実験に先立って評価されるべきである。例えば、試験細胞をHoechst 33342染色を用いて選別および染色し、各ウェルに0または1細胞が見出されることを保証するために計数することができる。単一のセルが見つからない場合は、ソート条件を最適化する必要があります。ラ...

Discussion

CUT&RUNは、クロマチン上のタンパク質の局在を決定するための効果的なプロトコルです。他のプロトコルと比較して、1)高い信号対雑音比、2)高速プロトコル、3)必要なシーケンシング読み取りカバレッジが低いため、コスト削減につながるなど、多くの利点があります。プロテインA-またはプロテインA/G-MNaseを使用することで、CUT&RUNを利用可能な任意の抗体で適用することができます。したがって、多くのタンパク質を迅速かつ容易にプロファイリングする可能性を秘めています。しかし、クロマチン上のタンパク質プロファイリングに対する単一細胞への適応は、特に単一細胞トランスクリプトミクス(すなわち、scRNA-seq)と比較すると、RNAに対するDNAのコピー数が少ないため(DNAのコピーが2〜4コピーであるのに対し、数千のRNAコピーが可能である)ため、困難であった。

上記で詳述したプロトコルでは、いくつかの重要なステップを考慮する必要があります。まず、細胞の適切な選別は細胞(または組織)の種類に依存しており、正確な選別には注意が必要です。実験の前に、単一細胞選別が装置でどの程度効果的である...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 透明マイクロチューブ	ThermoFisher Scientific	90410
1.5 mL チューブ マグネットラック	ThermoFisher Scientific	12321D
1.5 mL チューブ対応冷遠心分離機	Eppendorf	5404000537
10 cm 滅菌組織培養プレート	ThermoFisher Scientific	150464
10X T4 DNA Ligase buffer	新製品England Biolabs	B0202S
15 mLコニカルチューブVWR		89039-656
1X TE	バッファーThermoFisher Scientific	12090015
200 & micro;L PCR チューブ	Eppendorf	951010022
2X quick ligase buffer	New England Biolabs	M2200	Ligase Buffer
5X KAPA HiFi buffer	Roche	7958889001	5X high fidelity PCR buffer
7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)	Fisher Scientific	BDB559925
96-well magnetic rack	ThermoFisher Scientific	12027 or 12331D
96ウェルプレート	VWR	82006-636
AMPure XP ビーズ	ベックマン・コールター	A63881	ポリスチレンマグネタイトビーズ;AMPure XPビーズのロット間にばらつきが生じる可能性があるため、AMPureビーズ溶液をキャリブレーションすることをお勧めします。メーカーを参照してください。S instructions
Antibody to Interest	vary
ATP	ThermoFisher Scientific	R0441
BioMag Plus Concanavalin A beads	Polysciences	86057-10	ConA-conjugated 常磁性マイクロスフェア
BSA
塩化カルシウム (CaCl2)	Fisher Scientific	AAJ62905AP
セルソーター	BD FACSAria II セルソーター		トレーニングが必要
細胞培養用の細胞特異的培地	クロ
ロホルム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	C298-500	クロロホルムは、飲み込むと皮膚を刺激し、有害です。手袋、白衣、ゴーグルを使用して、化学薬品のヒュームフードで取り扱ってください
64ビットプロセッサを搭載したコンピュータとスーパーコンピューティングクラスタ			結果として得られるシーケンシングデータセットの計算解析
DNAスピンカラム	エポックライフサイエンス	1920-250
dNTPセット	ニューイングランドバイオラボ	N0446S
EGTA	シグマ アルドリッチ	E3889
電気泳動装置	は異なります
エタノール	フィッシャーサイエンティフィ	22032601	100%vol / volエタノールは非常に可燃性です;手袋、白衣を使用して化学ヒュームフードで取り扱ってください。ゴーグル
エチレンジアミン四酢酸 (EDTAの)	フィッシャーサイエンティフィック	BP2482100
FBS	シグマアルドリッチ	F2442
セロール	フィッシャーサイエンティフィック	BP229-1
コーゲン	VWR	97063-256
HEPES	フィッシャーサイエンティフィック	BP310-500
テロロスS.セレビシエDNAスパイクイン	自家製		架橋され、MNase消化され、アガロースゲルで抽出されたゲノムDNAをタンパク質/RNAから精製し、10 ng/mLに希釈して調製しました。酵母ゲノムDNAを推奨していますが、必要に応じて他の生物も使用できます。
塩酸 (HCl)	Fisher Scientific	A144-212	塩酸は非常に腐食性が高い。手袋、白衣、ゴーグルを使用して化学ドラフトで取り扱
アイスバケツは	さまざま
Illumina シーケンシングプラットフォーム (例: NextSeq500)	Illumina
インキュベーター	ThermoFisher Scientific	51030284
KAPA HotStart HiFi DNAポリメラーゼ、5X KAPA HiFiバッファー付き	ロシュ	7958889001	ホットスタート高忠実度ポリメラーゼ
層流フード	ベーカリーカンパニー	SG404
マンガン(MnCl2)	シグマアルドリッチ	244589
マイクロピペットセット	レイニン	30386597
ミニフュージ	ベンチマーク	C1012
NEBアダプター	イングランドバイオラボ	E6612AVIAL	アダプターNEB
ユニバーサルプライマー	ニューイングランドバイオラボ	E6611AVIAL	ユニバーサルプライ
マーNEBイルミナキットニュー	イングランドバイオラボ	E7335S / L、E7500S / L、E7710S / L、E7730S / Lインデックス	プライマー
ネガティブコントロール抗体	抗体-オンライン	ABIN101961
Nuclease Free water	New England Biolabs	B1500S
PCR thermocycler	Eppendorf	2231000666
Phase lock tubes	Qiagen	129046
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)	ThermoFisher Scientific	15593049	フェノールは、飲み込んだり、皮膚に接触したりすると有害です。手袋、白衣、ゴーグル
を使用して、化学ヒュームフードで取り扱ってください液状緩衝生理食塩水(PBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10814010
ピペットエイド	ドラモンドサイエンティフィック	#4-000-100
ポリエチレングリコール(PEG)4000	VWR	A16151
カリウム(KCl)	シグマアルドリッチ	P3911
酸化カリウム(KOH)	フィッシャーサイエンティフィック	P250-1	注意 KOHは、溶液中で固体で腐食性であるため、目/皮膚を刺激します。手袋、白衣、ゴーグルを使用して化学薬品のヒュームフードで取り扱える
プロテアーゼ阻害剤	サーモフィッシャーサイエンティフィック	78430
プロテインA/G-MNase	エピサイファー	15-1016	pA/G-MNase
プロテインA-MNase、pK19pA-MNから精製	Addgene	86973
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q33230
Qubit Assay tubes	ThermoFisher Scientific	Q32856
Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33238
Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer	New England Biolabs	M2200S
RNase A	New England Biolabs	T3010
酢酸ナトリウム (NaOAc)	サーモフィッシャー・サイエンティフィ	BP333-500
塩化ナトリウム (NaCl)	Sigma Aldrich	S5150-1L
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)	モフィッシャー・サイエンティフィ	BP166-500	SDS は吸入すると有毒です。水酸化ナトリウム (NaOH) を取り扱う際は、手袋、目の保護具、N95 グレードの呼吸器を使用して、換気の良い場所では慎重に取り扱っ
フィ	ッシャー・サイエンティフィ	S318-1	NaOHは、溶液中で固体および腐食性として目/皮膚刺激性です。手袋、白衣、ゴーグルを使用して化学薬品のヒュームフードで取り扱える
スペルミジン	Sigma Aldrich	S2626
標準倒立光学顕微鏡	ライカ	11526213
標準的なラボ用アガロースゲル材料
異なる 血清学的ピペットやピペットチップなどの標準的なラボ材料	T4
DNAリガーゼ	新製品England Biolabs	M0202S
T4 DNAポリメラーゼ	New England Biolabs	M0203S
T4 PNK	New England Biolabs	M0201S
卓上ボルテクサー	Fisher Scientific	2215414
Taq DNAポリメラーゼ	New England Biolabs	M0273S
Thermomixer	Eppendorf	5384000020	、ウォーターバス
スベース	を使用できます フィッシャーサイエンティフィック	BP152-5
トリトンX-100	シグマ アルドリッチ	9002-93-1	トリトンX-100は危険です;トリプシンを取り扱うときは、白衣、手袋、ゴーグルを使用してください
プシン	フィッシャーサイエンティフィ	MT25052
チューブローテーター	VWR	10136084
USER酵素	ニューイングランドバイオラボ	M5505S