Method Article

ラマン色素による高多重化組織イメージング

DOI:

10.3791/63547

⸱

April 21st, 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, Columbia University, 2Kavli Institute for Brain Science, Columbia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

虹のようなラマン色素の電子事前共鳴刺激ラマン散乱(epr-SRS)イメージングは、高度に多重化されたエピトープベースのタンパク質イメージングのための新しいプラットフォームです。ここでは、抗体調製、組織サンプル染色、SRS顕微鏡アセンブリ、およびepr-SRS組織イメージングを含む実用的なガイドを紹介します。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

組織内の膨大な範囲の特定のバイオマーカーを視覚化することは、複雑な生物学的システムの複雑な組織を探索する上で重要な役割を果たします。したがって、高度に多重化されたイメージング技術はますます高く評価されています。ここでは、虹のようなラマン色素の電子事前共鳴刺激ラマン散乱(epr-SRS)イメージングによる標準的な免疫蛍光に匹敵する感度を持つ特定のタンパク質の高度に多重化された振動イメージングの新たなプラットフォームについて説明します。この方法は、従来の免疫蛍光におけるスペクトル的に解決可能なチャネルの限界を回避し、細胞内分解能を有する組織中の複数のマーカーを調査するためのワンショット光学的アプローチを提供する。一般に、パラホルムアルデヒド固定組織、凍結組織、およびホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)ヒト組織を含む標準的な組織調製物と適合性があります。このプラットフォームは、特に厚い無傷の組織について、生物学的標本のタンパク質相互作用のより包括的な全体像を提供すると想定しています。このプロトコルは、抗体調製から組織サンプル染色、SRS顕微鏡アセンブリ、epr-SRS組織イメージングまでのワークフローを提供します。

Introduction

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複雑な組織系は、空間的位置および相互作用ネットワークがそれらの機能および機能不全と深く絡み合っている別個の細胞亜集団から構成される1,2。組織構造を明らかにし、その複雑さを調べるためには、単一細胞分解能でのタンパク質の空間的位置の知識が不可欠です。したがって、高度に多重化されたタンパク質イメージング技術はますます高く評価されており、組織生物学を研究するための礎石になる可能性があります3,4,5。現在の一般的な多重化タンパク質イメージング方法は、2つの主要なカテゴリに分類することができる。1つは、組織染色およびイメージングの複数回のラウンドに依存する連続免疫蛍光イメージングであり、もう1つは、重金属タグ付き抗体6、7、8、9、10、11

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Protocol

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このプロトコルは、コロンビア大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認された動物実験プロトコル(AC-AABD1552)に従って実施された。

1. ラマン色素結合抗体の作製

  1. PBS緩衝液中に〜0.1 M NaHCO3としてコンジュゲーション緩衝液を調製し、pH=8.3、4°Cで保存する。
  2. N-ヒドロキシスクシンイミジ(NHS)エステル官能MARSプローブ(補足材料)溶液を無水DMSO中に3mMとして調製する。MARSプローブの合成は、先行報告13、17、18を参照することができる。
    注:保存目的のために、染料NHSエステル溶液は光から保護され、-20°Cに保たれなければならない。
  3. 抗体固体をコンジュゲーションバッファーに2mg/mLの濃度まで溶解する。他のバッファーに溶解した抗体の場合は、遠心フィルターで 1 ~ 2 mg/mL の濃度に結合バッファーに交換します。
    注:高度に交差吸着された二次抗体は、種間の反応性を最小限に抑えるためにマルチプレックス染色に好ましい。使用した二次抗体を表 1 お....

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Results

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図3は、固定細胞(図3A)、パラホルムアルデヒド(PFA)固定マウス組織(図3B)、およびホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)ヒト試料(図3C)を含む異なる試料におけるepr-SRSの例の画像を示す。SRS顕微鏡の空間分解能は回折制限があり、典型的な横方向分解能は〜300nmであり、軸方向分解能は励起に近赤外光を使用して1〜2μmである。その結果、HeLa細胞における微小管などの微細な細胞下構造が、α-チューブリンの免疫-eprSRSイメージングにより忠実に明らかになった(図3A)。さらに、epr-SRSは一般にFFPE組織と適合性があり(図3C)、これは臨床診断および病理学研究のための生検標本の一般的な形態である。2光子蛍光顕微鏡と同様に、非線形プロセスとして、epr-SRSは.......

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Discussion

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ここでは、新しく保存されたマウス組織、FFPEヒト組織、および凍結マウス組織を含む一般的な組織タイプに広く適用可能な免疫eprSRSプロトコルを提示する。免疫-eprSRSは、表1に列挙されているように、細胞および組織におけるエピトープのパネルについて検証されている。このワンショットプラットフォームは、サイクリック戦略がうまく機能しないアプリケーションに特に適しています。例えば、環状蛍光は、3D免疫標識の複数回のラウンドが実用的で長いため、厚い組織に対して要求されています17。また、非線形3D組織学的変化による登録誤差が生じる可能性が非常に高い11,17。Immuno-eprSRSは、このようなシナリオにおける環状蛍光の実際的な障壁を克服し、大量のタンパク質相互作用ネットワークを明らかにする機会をもたらします17。

現在の多重性は、主に二.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もありません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マウスの膵臓組織を提供してくれたルース・A・シンガーとリチャード・K・P・ベニンガーに感謝します。W.M.は、NIH R01(GM128214)、R01(GM132860)、R01(EB029523)、および米軍(W911NF-19-1-0214)からのサポートを認めています。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16% パラホルムアルデヒド、EM グレード電子顕微鏡科学15710
&-tubulinAbcamab18251一次抗体
&-tubulinBioLegend625902一次抗体
&β;-III-tubulinBioLegend657402一次抗体
β-III-tubulinAbcamab41489一次抗体
&β;-tubulinAbcamab131205一次抗体
アガロース、低ゲリング温度Sigma AldrichA9414脳埋め込み用
ウサギで産生される抗a-tubulin抗体 (&α;-tubulin)Abcamab528661次抗体
マウスで産生される抗カルビンジン抗体 (Calbindin)Abcamab82812一次抗体
抗GABA B受容体 R2  モルモットで産生される抗体 (GABA B receptor R2)ミリポアシグマAB2255一次抗体
ヤギで産生される抗GFAP抗体 (GFAP)Thermo ScientificPA5-18598一次抗体
抗グルカゴン  マウスで産生される抗体 (Glucagon)Santa Cruz Biotechnologysc-514592一次抗体
モルモット産生抗インスリン抗体(インスリン)DAKOIR00261-2一次抗体
ラット産生抗MBP抗体(MBP)アブカムab7349一次抗体
ウサギ産生抗NeuN抗体(NeuN)Thermo ScientificPA5-78639一次抗体
ヤギで産生される抗膵臓ポリペプチド(PP)抗体-膵臓ポリペプチド(PP)シグマ・アルドリッチSAB2500747一次抗体
ウサギで産生される抗Pdx1抗体 (Pdx1)Milipore06-1379一次抗体
ラットで産生される抗ソマトスタチン抗体 (ソマトスタチン)アブカムab30788一次抗体
ニワトリで産生される抗ビメンチン抗体 (Vimentin)Abcamab24525一次抗体
バンドパスフィルターKRエレクトロニクス KR27248 MHz
BNC 50 Ω ターミネーターミニ回路STRM-50
BNCケーブルThorlabs2249-C同軸ケーブル、BNC オス/オス
広帯域誘電体ミラーThorlabsBB1-E03750 - 1100 nm
C57BL/6J マウスジャクソン研究所000664
遠心分離
機コンデンサーオリンパスオイル浸漬、1.4 N.A.
サイトケラチン 18Abcamab7797一次抗体
サイトケラチン 18Abcamab24561一次抗体
DC電源TopWard6302Dバイアス電圧は64V
ダイクロイックマウントThorlabsKM100CLキネマティックマウント 最大1.3インチ(33mm) 高さ 長方形光学系、左利きロ
バ アンチチキン IgY (H+L)ジャクソンImmunoResearch703-005-155Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Goat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch705-005-147Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch706-005-148Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-005-151MARS標識用二次抗体
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch711-005-152MARS標識用二次抗体
Donkey anti-Rat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch712-005-153MARS標識用二次抗体
Donkey anti-Sheep IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch713-005-147二次抗体MARS標識用抗体
DPBSフィッシャーサイエンティフィック14-190-250
EpCAMAbcamab71916一次抗体
エタノールSigma Aldrich443611
高速ルックインアンプチューリッヒ・インスツルメンツHF2LIDC - 50 MHz
FFPE 腎臓サンプルUSBiomaxHuFPT072
FibrillarinAbcamab5821一次抗体
GiantinAbcamab24586一次抗体
GlucagonSanta Cruz Biotechnologysc-514592一次抗体
H2BAbcamab1790一次抗体
HeLaATCCATCC CCL-2
高O.D.バンドパスフィルタークロマテクノロジーET890/220mストークスビームをフィルタリングし、ポンプビームを透過させる
疎水性ペンフィッシャー・サイエンティフィック・NC1384846
インスリン・サーモフィッシャー701265 一次抗体
統合型SRSレーザーシステム応用物理学 &エレクトロニクス株式会社picoEMERALDpicoEMERALDは、1,064nmのパルス幅6ps、繰り返し周波数80MHzの出力パルス列を提供し、これがストークスビームとして機能します。532nmの周波数倍増ビームは、ピコ秒光パラメトリック発振器(OPO)を同期してシードし、パルス幅が5~6psのモードロックパルス列を生成するために使用されます(OPOのアイドラービームは干渉フィルターでブロックされます)。OPOの出力波長は720°dashから調整可能です。950nm、これはポンプビームとして機能します。1,064nmのストークスビームの強度は、8MHzの内蔵EOMによって正弦波に変調され、変調深度は90%を超えます。ポンプビームは、ピコエメラルド内部のダイクロイックミラーを使用して、ストークスビームと空間的に重なっています。ポンプパルス列とストークスパルス列の時間的オーバーラップは、内蔵の遅延ステージで達成され、顕微鏡での純粋なD2OのSRS信号によって最適化されます。
倒立レーザー走査型顕微鏡オリンパスFV1200MPE
キネマティック ミラー マウントThorlabsPOLARIS-K1-2AH2 ロープロファイル ヘックス アジャスター
レクチン Triticum vulgaris (小麦) SigmaAldrichL0636-5 mg
ロングパス ダイクロイック ビーム スプリッターSemrockDi02-R980-25x36980 nm レーザー BrightLine シングルエッジレーザーフラットダイクロイックビームスプリッター
MAP2BioLegend801810一次抗体
顕微鏡イメージングソフトウェアOlympusFluoView
NanoQuant PlateTecanプレートリーダーでの吸光度ベースの小容量分析用。
正常なロバ血清Jackson ImmunoResearch017-000-121
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)Thermo ScientificR37606
Nunc 4-Well DishesFisher Scientific12-566-300
対物レンズOlympusXLPlan Nx25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm
ペイントブラシ
ペリスコープアセンブリThorlabsRS99には、上部と下部のユニットが含まれています。1インチのポスト、およびクランプフォーク。
pHメーター
プレートリーダーTecanInfinite 200 PRO使いやすいマルチモードプレートリーダーです。230&ndashのスペクトル範囲にわたる吸光度測定機能。1000nm。
ProLong Gold 退色防止試薬Thermo ScientificP36930
PSD95Invitrogen51-6900一次抗体
Sephadex G-25 MediumGE Life Sciences17-0033-01脱塩およびバッファー交換用ゲルろ過樹脂
BNCコネクタ付きシールドボックスPomona Electronics2902アルミニウムボックス カバー付き、BNC メス/メス
SiフォトダイオードThorlabsFDS1010350–1100 nm、10 mm x 10 mm アクティブエリア
Synapsin 2ThermoFisherOSS00073G一次抗体
Tissue Path Superfrost Plus Gold SlidesFisher Scientific22-035813新鮮な組織切片またはホルマリン固定組織切片をスライド表面にしっかりと引き付け、化学的に結合する接着スライド (tiisue bindling glass slides)
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
ビブレータライカVT1000
ビメンチンAbcamab8069一次抗体
キシレンシグマ アルドリッチ214736

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  2. Taube, J. M., et al.

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Multiplexed Tissue ImagingRaman DyesStimulated Raman ScatteringProtein Marker ImagingImmunofluorescence AlternativeTissue ClearingSubcellular ResolutionAntibody ConjugationSize Exclusion ChromatographyBrain Tissue Imaging

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