サトウキビの根系を特徴付けるための多面的な表現型解析アプローチ

サマリー

根系の形質を特徴づけることは、特にサトウキビにおいて、まだ初期段階にある研究分野の1つです。サトウキビの根を正確に表現型にするための複数のアプローチを統合することで、包括的かつ全体的な結果が得られ、特定された形質とメカニズムを従来の育種および分子育種に利用することができます。

要約

根は水と栄養素の主要な伝導体であり、ストレスの多い環境下で成長と収量を維持する上で重要な役割を果たします。植物の根の研究は、 in situ 評価とサンプリングにおいて方法論的な困難を提起しますが、これは特にサトウキビ(Saccharum spp.)に当てはまります。1920年代の伝統的な方法では、サトウキビの根系の遺伝子型の多様性が実証されていましたが、その後、最近までサトウキビの根形質 自体 に関する研究はほとんど報告されていませんでした。形態学に加えて、アレロパシー効果および/または微生物共生に対する親和性を含む根圏特性が、植物の確立と生存を決定します。

最終的に、根系はサトウキビの地上生産性を定義します。気候変動に強い品種の開発が進むにつれ、サトウキビの根系形質の多様性を探求し、利用することがより重要になってきています。この論文では、トレンチサンプリングによるフィールド掘削、ルートコアサンプラーの使用、ルートサンプリング用の隆起プラットフォーム、水耕栽培での植物の飼育など、サトウキビの根表現型に関する多面的なアプローチについて説明しています。これは、インド農業研究評議会-サトウキビ育種研究所(ICAR-SBI)の科学者チームが採用しています。

トレンチサンプリングによるフィールド掘削は、自然な成長環境で植物の根を評価するために不可欠です。フィールド条件をシミュレートする隆起したプラットフォームとルートコアサンプラーの使用は、時間が大幅に短縮され、サンプルサイズが均一になり、ルート材料の損失が少なくなる代替アプローチです。水耕栽培植物培養では、有機化合物の滲出や微生物相互作用など、形態学、解剖学的特徴、根圏生物学の研究が可能です。さまざまなサンプリング方法を使用したさまざまな実験から生成されたデータは、サトウキビの根系特性に関する豊富な情報を追加します。

概要

サトウキビ(Saccharum spp.)は、重要な食料およびバイオエネルギー源であり、熱帯および亜熱帯の気候条件を持つ多くの国での栽培に適した重要な工業作物です。炭素同化のためのC₄ 光合成経路により、サトウキビは生産性が高く、水や肥料などの農場投入物を効率的に使用できます。サトウキビの収穫後処理では、砂糖やジャガリーなどの経済的に価値のある製品と、その副産物である糖蜜、エタノール、エネルギーが得られます。サトウキビは、総耕作地の約1.5%にあたる25.97Mhaの面積で、約100カ国で生産されています。インドだけで世界のサトウキビ生産量の16%(約306 Mt)を占めており、平均生産性は70 t·^{ha-1 1}です。サトウキビの生産に劇的な影響を与える主な非生物的ストレスには、水不足、水浸し、極端な温度、および栄養素の欠乏、塩分、塩分、アルカリ性などの土壌特性が含まれます。非生物的ストレス耐性作物を開発するための最大の課題は、ストレス条件下で大きな収量優位性をもたらす特定の形質を特定することです。

サトウキビの生理学のいくつかの側面は、サトウキビの生産性に劇的な影響を与える根とシュートの関係など、よく理解されていません。サトウキビの根は新芽ほど研究されていませんが、セットの根、新芽の根、成体の根などのさまざまなタイプは、さまざまな機能で発達的に異なる可能性があります。発芽中に出現するセット根の数と長さに関して、遺伝子型の違いは観察されています²。セットの根は、サトウキビの芽の発芽に関与しており、早期の作物の確立を確保し、後で、発達中のシュート³の基部から出現する丈夫なシュートの根に置き換えられます。セットの根で観察された細い枝は、若い植物を固定し、水と栄養素の吸収を助け、それらがシュートの根に置き換えられるまで。セットの根と同様に、シュートの根も、サトウキビの下部の未拡張の節間に存在する根原基から発生します。

シュートの根は植物に長期間持続するため、セットの根よりも4倍から10倍太くなります。シュートの根はサトウキビの唯一の根系を構成し、さらなる成長と発展に重要な役割を果たしています。シュートの根の活力は、植物の全体的な栄養活力と正の関連があります。セット根とシュート根の回転に起因する根の継続的な発達は、サトウキビの「成根系」を生み出し、これは常に一般的な環境条件に適応しています。一般に、根系が深く、多産であるほど、根の分布が浅い場合よりも多くの水と栄養素が作物に利用可能になります。定期的な解剖により、土壌水分含有量が高い場合、浅い根系が観察され、地下水面が下がるとはるかに深い根系が発達することが明らかになりました²。サトウキビの根系は、作物の収穫後も活動を続け、地下の芽⁴から新しい芽の根が現れるまで、ラトゥーン作物の成長に貢献しています。根の角度と根の枝分かれのレベルは、植物の根が探索する土壌の量を決定する2つの重要な要素です。遺伝子型の形質である根の角度は、生物的および非生物的ストレスに対する耐性を改善するために、従来の育種または分子的アプローチによって変更される可能性があります。それどころか、根の枝分かれのレベルは主に環境の影響を受けるため、根の発達と局所的な土壌条件に対するその応答を定期的に監視する必要があります。

サトウキビの根の解剖学的特徴は、遺伝子型と環境に関する違いを確認するために調べられてきました。サトウキビのセト根の解剖学的構造は、トウモロコシなどの他の草の成熟した根の解剖学的構造と似ており、皮質は規則的なパターンで高分化した細胞層で構成されています。内皮は濁液化され、続いて単層の周輪車が続きます。メタキシレム元素は、主要な導体または水と栄養素イオンであり、放射状に配置され、師部のグループが散在しており、後者は2つのコンパニオンセルを持つふるい要素で構成されています。未分化細胞の大きな中央の塊が根髄を形成します。サトウキビ栽培品種の明確な解剖学的特徴は、根の水理特性に対応しており、それによって水の動きに影響を与えます。サトウキビの根の解剖学的形質の違いに関する初期の研究では、低水分ストレス条件下では、皮内皮のすぐ内側、髄と血管領域の間、および血管の周囲の層で細胞壁の顕著な肥厚が観察されることが明らか^{になった5。}このような肥厚した細胞は、樹液の後方流を防止するための適応であり、ストレス時の機械的強度のための適応であってもよい。

サトウキビの耐乾性に関与するいくつかの重要な特性には、外皮層の相対的な厚さと数、皮質と石碑の比率、皮質の細胞間空間、および肥厚した根毛の先端が含まれます。皮質細胞が占める面積とシュート根の恒星組織が占める面積の比率は、サトウキビ栽培品種間で有意に異なり、石碑⁶の面積に関して大きなばらつきがあります。サトウキビの根の透水係数は、シュートの根のメタキシレム要素のサイズと数に関連しています。根内の疎水性細胞層は、アポプラスチックの水移動のゾーンを定義する可能性があります。サブバー化されたカスパリーバンドは、内皮と皮下組織(外皮と呼ばれる)に見られ、これらは疎水性バリアとして機能します。皮質細胞の崩壊は、発達年齢に関係なく、古い根や低酸素状態にさらされた植物で溶解性気泡の形成につながります。浸水ストレス時の気道形成は、抵抗性品種⁷の成長維持と相関している。

Erianthus arundinaceus [Retzius] Jeswiet(Saccharum spp.に関連する属)の根の形態と解剖学は、環境ストレスに対する強い耐性に関与し^{ています8。}Erianthus arundinaceusの根は、急な角度で分布した節根を示し、根の毛が密集しているため、より深い土壌ゾーンからの水と栄養イオンの取り込みが容易になります。深根系は、急な成長角度で成長する多くの節根で構成されています。節根の直径は、大きな木部血管のサイズと数と相関しており、前者は0.5mmから5.0mmまで大きく異なります。これらの節根は根茎状の鞘も形成し、皮下組織では外側の皮質(外皮)に木質化した強皮症が、皮質の中央部にリシゲナ性気泡が見られ、石碑にはデンプン顆粒が見られます。構造や形態学的形質に加えて、根から滲出した有機化合物は、植物の発芽、定着、生存を決定する上で重要な役割を果たしており、もっともらしいアレロパシー効果や微生物共生に対する親和性があります。

根の酵素活性と、根蓋の色素沈着や損傷時の若返りの可能性など、形態の細部は、水耕栽培で栽培されたサトウキビ品種で文書化されました⁹。根の成長は、根系の形態とサイズの両方において、土壌環境の変化に対して非常に可塑性な反応を示します。最も効率的なサトウキビの品種は、芽の数が少ないか最適な品種であり、それに応じて根の数が少なく、ストレスの多い条件下での生存に役立ちます。したがって、根系の体系的な研究は、あらゆる作物改良プログラムの重要な要素を形成するべきである¹⁰。根に焦点を当てた実験の大部分は主に発生的側面に依存しており、機能的な可塑性に焦点を当てることはしばしば欠けています¹¹。 構造分布とは別に、機能的な根の可塑性はストレス下での生存に重要な役割を果たしているため、非生物的ストレス耐性の選択パイプラインに根系形質を含め、サトウキビの堅牢性を向上させるためのブリーダーの努力をサポートします。

ストレスの多い環境下で成長と収量を維持する上でのその重要性を考慮すると、サトウキビの根系形質に固有の変動性を調査し、利用することが不可欠です。優れた根系を与える成分形質とメカニズムの選択に重点を置くことは、変化する気候条件下でより良い作物の生産性を得るための前進方法です。表現型の評価は、長くて費用のかかるプロセスです。しかし、多面的なアプローチの統合は、作物改良におけるその有用性に多大な価値を付加するでしょう。この原稿では、サトウキビの根表現型解析に関する4つの異なるアプローチが説明されており、それぞれに独自の長所と短所があり、包括的で全体的な結果を得るためには協調的な努力が必要であることを示唆しています。

プロトコル

1. トレンチサンプリングによる現場掘削

1. 商業用サトウキビ雑種(以下「品種」と呼びます)を、120 cmの列間隔で植えられた2つの芽のセットから畑で育て、90 cmの列に植えます。これは、推奨される実践パッケージ(POP)に従って、良好な作物の確立と成長を確保します。
2. 作物の成熟期の終わりに、掘削機を使用して畑に溝(深さ1.5m、幅1.0m)を掘ります。連続的なウォータージェットを通じて、根に損傷を与えることなく根域からの土壌がきれいになることを確認します(図1)。
3. 付着した土壌が緩んだら、根系と一緒にサトウキビを根こそぎにし、実験室に持って行き、根の数、根の長さ、体積、重量を手動で測定します。

図1:根の野外掘削のためのトレンチサンプリング方法((A)フィールドに沿って掘られた横向きのトレンチ、(B)ウォータージェット、(C)トレンチの深さを示す内部図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2.サンプリングエラーを低減するルートコアサンプラー

1. サトウキビの根のサンプリングには、高さ61cm、直径16cm、重さ8kgの円筒形の根芯サンプラーを使用し、軟鋼(MS)材料を使用して現場でのサンプリングを行います。サンプラーの下端に鋭いエッジを設けて、土壌に挿入しながら簡単に浸透できるようにします。サンプラーを持ち上げるために、上部に直径3cmのカラーを用意します(図2)。
2. サトウキビの品種は、120 cmの列間隔で植えられ、列内に90 cmの2つの芽のセトから畑で育てられ、推奨されるPOPに従って、良好な作物の確立と成長を確保します。
3. 作物の成熟段階で、サンプラーの上端を一次シュート/サトウキビに固定し、希望の土壌深さ(45 cm)に達するまで連続してハンマーで打ちます。全体の土壌塊をサンプラーに持ち上げ、流水で慎重に洗浄して付着した根を分離します。
4. 根を徹底的に洗浄した後、手動測定で体積、表面積、長さ、重量を記録するとともに、透明なトレイに根を広げて、参照されたソフトウェアを使用して対応するデジタル化された画像をスキャンして分析します( 資料の表を参照)。

図2:ルートコアサンプラー。(A)寸法、(B)上面図、(C)サンプリングサイト。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. 異なる表現期でのサンプリングを容易にするルート表現型構造

1. サトウキビの根をサンプリングするための寸法4.5 m x 10.1 mの3つの隣接するコンパートメントを含む根表現型構造を構築し、側壁を手動で解体して地下の根系(深さ80〜100 cmまで)を明らかにするための準備をします(図3)。側壁は、長さ1.8 m、幅30 cm、厚さ4 cmのプレキャストスラブで構築します。
2. 構造物を畑の土で埋めて圧縮し、~20 cmのヘッドスペースを残し、土壌の通気を容易にするための適切な排水穴を設けます。
3. Saccharum officinarum L.、Saccharum spontaneum L.、Saccharum barberi Jesw.、Saccharum sinense Roxb.、Saccharum robustum Brandes、Jeswiet ex Grasslを含む生殖細胞クローンの芽チップを播種します。(以下、「Saccharum spp.クローン」と呼びます)そして、発根培地(赤土:農場の庭の肥料:砂= 2:2:1)を含むプロトレイで30日間発芽させます。良好な作物の確立と成長を確保するために推奨されるPOPに従って、90 cmの列間隔で、列内に60 cmの列間隔で、均一で健康な沈殿物を構造に移植します。
4. 形成期(植え付け後60〜120日[DAP])および大成長期(120〜150 DAP)の間に、プレキャストスラブで作られた側壁を手動で取り外し、続いてウォータージェットを連続的に噴霧して根を露出させます。
5. 根系全体を根こそぎにして実験室に持ち込み、長さ、体積、重量を手動で測定し、根を透明なトレイに広げて、参照されたソフトウェアで対応するデジタル化された画像をスキャンして分析します( 材料の表を参照)。
6. コンパートメントの 1 つで灌漑を差し控えて干ばつストレスを課し、2 番目のコンパートメントの排水穴を塞いで土壌の飽和を維持し、浸水ストレスをシミュレートします。推奨されるPOPに従って3番目のコンパートメントを灌漑し、フィールド容量を維持し、制御として機能します。

図3:ルート表現型の構造。 (A)寸法、(B)3つのコンパートメントの概要、(C)1つのコンパートメントの図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. 根圏生物学を研究するための植物の水耕栽培

1. サトウキビの栽培に適した環境制御された温室で、自社製の水耕栽培システムを製作し、根の生物学の細部を研究します。~15 Lの改質ホーグランド養液(表1)を、水槽用ポンプ(図4)による曝気を行いながら、20 cm x 20 cm x 50 cmのガラスタンクに加えます。
2. サトウキビ品種と Saccharum spp.クローンのつぼみチップを播種し、堆肥化されたコイアピスを含むプロトレイで30日間発芽させます。均一で健康な沈殿物を水耕栽培タンクに移植し、タンクごとに3回の沈殿の頻度で、根全体を栄養溶液に配置するように注意します。根が光にさらされないように、タンクを黒い布で覆います。ガラスタンクの縁にプラスチックメッシュ(20 cm x 20 cm)を使用して、植物を直立させます。
3. 発芽期(60日)の終わりに、光合成活動のピーク時に、無傷の植物の根を50 mLのトラップ溶液(滅菌二重蒸留水)に4時間(0800時間から1200時間)浸して、根の滲出液を収集します。収集した溶液をWhatman濾紙でろ過し、次に陰イオン交換で満たされたガラスカラムに通し、続いて陽イオン交換樹脂¹²を充填します。溶出した画分を蒸発させて乾燥させ、さらなる処理まで-20°Cで保存します。
4. 処理した根滲出液サンプルをHPLCで分析して有機酸¹² を測定し、分光光度法で総フェノール類¹³、タンパク質¹⁴、糖¹⁵、およびアミノ酸¹⁶ を標準プロトコルに従って推定します。
5. 週間隔で根の成長を監視して、根の先端の色素沈着と根毛の密度を記録します。酵素、ペルオキシダーゼ¹⁷ およびスーパーオキシドジスムターゼ¹⁸、および総フェノール含有量¹⁹ の活性を、標準プロトコルに従って 3 か月目に評価します。
6. 滅菌外科用ブレードを使用して、一次根から根の先端までの縦方向のスライスを与えることにより、根の損傷に対する反応を評価し、変化を定期的に監視します。

ケミカル	最終濃度
硝酸カリウム	0.608 グラムL-1
硝酸カルシウム	1.415 グラムL-1
リン酸二水素カリウム	0.164 グラムL-1
硫酸マグネシウム	0.560 グラムL-1
EDTA-鉄一ナトリウム塩	6.00g・250L-1
ホウ酸	1.43g・250L-1
塩化マンガン四水和物	0.91g・250L-1
硫酸亜鉛	0.11g・250L-1
硫酸キュプリン酸	0.04g・250L-1
モリブデン酸	0.01グラム250L-1

表1:サトウキビの水耕栽培のための改変栄養液の組成。

図4:水耕栽培のセットアップ。 セットアップは、(A)サトウキビの栽培用にカスタマイズされ、(B)生後5か月の作物(写真撮影のみのために黒い布を取り外しています)。この図はHari et ^al.9から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

結果

サトウキビ品種の根の形態学的形質の多様性
トレンチサンプリングによってフィールドから発掘され、水耕栽培のセットアップで成長したCo 62175の根系の代表的な画像を、図5A、Bに示します。Co 62175 と Co 99006 の品種では長い根 (~100 cm) が観察され、Co 99006 は最も高い根の重さ (127 g・^clump-1) を記録しました。根形質は根芯サンプラーを使用して記録され、Co 62175 は累積根長、根表面積、および根の量に関して Co 99006 と比較して優れた根系を持っていることが明らかになりました (図 5C-E)。ただし、平均根の直径は、Co 99006 の方が Co 62175 よりも高かった (図 5F)。

ディスカッション

根系はサトウキビの地上生産性を定義するため、気候変動に強い品種の開発には、そのすべての側面を徹底的に調査し、理解する必要があります。ICAR-SBIの科学者チームは、植物生理学者、微生物学者、農業エンジニア、生化学者、植物育種家で構成され、トレンチサンプリングによるフィールド掘削、ルートコアサンプラーの使用、ルートサンプリング用の隆起プラットフォーム、水耕栽培下での植物の飼育など、サトウキビの根表現型解析に多面的なアプローチを採用しました。個々の方法論が網羅的および/または排他的ではない可能性があることを考えると、理想的な根の表現型の構成要素形質とメカニズムを明らかにするためには、情報の統合が必要です。ルートサンプリングの以前の方法は、彼らの努力の中で分離されましたが、本明細書に記載されている戦略を開発するのに役立ちました。

VenkatramanとThomas⁵ は、調査に適した3つの方法を説明することにより、サトウキビの根の研究を開拓しました。最初の方法では、植物...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
パイプラインアクセサリー付き曝気ポンプ	地元の供給元から購入	NA	サトウキビの水耕栽培に使用
ホウ酸	Sisco Research Laboratories、インド	80266	改変ホーグランド溶液の調製
硝酸カルシウム	セントラル・ドラッグ・ハウス、インド	27606	改変ホーグランド溶液の調製
堆肥化されたコイアの髄	地元の供給元から購入	NA	サトウキビセットの発芽に使用されます
硫酸第二銅	Sisco Research Laboratories、インド	38869	改変ホーグランド溶液の調製
DEAE-セルロース	Sisco Research Laboratories、インド	10529	根滲出液処理用陰イオン交換樹脂
EDTA-第二鉄ナトリウム塩	Sisco Research Laboratories、インド	59389	改変ホーグランド溶液の調製
農場の庭の肥料	地元の供給元から購入	NA	サトウキビセットの発芽に使用されます
ガラスタンク	社内で製造	NA	サトウキビの水耕栽培に使用
HPLC用	アジレントテクノロジーズ	1200 インフィニティ	根滲出液中の有機酸の定量化
硫酸マグネシウム	Sisco Research Laboratories、インド	29117	改変ホーグランド溶液の調製
塩化マンガン	Sisco Research Laboratories、インド	75113	改変ホーグランド溶液の調製
モリブ酸	Sisco Research Laboratories、インド	49664	改変ホーグランド溶液の調製
リン酸二水素カリウム	セントラル・ドラッグ・ハウス、インド	29608	改変ホーグランド溶液の調製
硝酸カリウム	セントラル・ドラッグ・ハウス、インド	29638	改変ホーグランド溶液の調製
プロトレイ	社内で製造	NA	サトウキビセットの発芽に使用されます
赤土	地元の供給元から購入	NA	サトウキビセットの発芽に使用されます
ルートコアサンプラー	社内で製造	NA	in situ ルートサンプリングに使用
砂	地元の供給元から購入	NA	サトウキビセットの発芽に使用されます
セラライト-120	Sisco Research Laboratories、インド	14891	根滲出液処理用陽イオン交換樹脂
支持フレーム	地元の供給元から購入	NA	サトウキビの水耕栽培に使用
ウォーターモーターポンプ	地元の供給元から購入	NA	サトウキビの水耕栽培に使用
Whatman濾紙グレード1	ユニバーサルサイエンティフィック	1001090	根の滲出液の処理
WinRhizo PRO(ソフトウェア)	Regent Instruments Inc.、カナダ	STD4800	ルート解析用ソフトウェア付き2次元ルートスキャナー
硫酸亜鉛	Sisco Research Laboratories、インド	76455	改変ホーグランド溶液の調製