方法論記事

馴化細胞培養培地から細胞外小胞を分離するためのサイズ排除クロマトグラフィー(英語)

DOI：

10.3791/63614

⸱

2022年5月13日

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1Department of Biology, School of Science, Penn State Erie, The Behrend College, 2Magee Womens Research Institute—Allied Member

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでのプロトコルは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、細胞外小胞を馴化細胞培養培地から適切に分離できることを示しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞外小胞(EV)は、すべての細胞から放出され、すべての生体液に存在し、それらが由来する親細胞を反映するタンパク質、核酸、および脂質を含むナノサイズの脂質膜結合構造です。サンプル中の他の成分からEVを適切に分離することで、関連する貨物の特性評価が可能になり、多くの疾患の細胞間コミュニケーターおよび非侵襲的バイオマーカーとしての可能性についての洞察が得られます。現在の研究では、希突起膠細胞由来のEVを、限外ろ過やサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)などの最先端技術を組み合わせて細胞培養培地から単離し、EVを他の細胞外タンパク質やタンパク質複合体から分離しました。市販のSECカラムを用いて、コントロールおよび小胞体(ER)ストレス条件下の両方でヒト希突起膠腫細胞から放出された細胞外タンパク質からEVを分離しました。標準的なEVマーカーCD9、CD63、およびCD81は、画分1〜4では観察されましたが、画分5〜8では観察されませんでした。ゴルジ体のタンパク質であるGM130とERの内在性タンパク質であるカルネキシンを陰性のEVマーカーとして使用し、どの画分にも観察されませんでした。また、EV画分として画分1〜4、タンパク質画分として画分5〜8をプール濃縮した場合、EV画分におけるCD63、CD81、およびCD9の発現は認められなかった。GM130またはカルネキシンの発現は、いずれの画分タイプにおいても観察されなかった。対照およびERストレス条件の両方からのプールされた画分を透過型電子顕微鏡で視覚化し、小胞はEV画分で観察されたが、タンパク質画分では観察されなかった。両方の条件からのEVおよびタンパク質画分中の粒子も、ナノ粒子追跡分析で定量化されました。まとめると、これらのデータは、SECが馴化細胞培養培地からEVを分離するための効果的な方法であることを示しています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞外小胞(EV)の研究への関心の爆発は、これらのナノサイズの不均一な粒子を分離して研究するために使用される技術と技術の大きな進歩を伴っています。約40年前の発見以来1,2、これらの小さな膜構造は生理活性脂質、核酸、タンパク質を含み、細胞間コミュニケーションにおいて主要な役割を果たしていることがわかっています3,4。EVはすべての細胞型から放出されるため、血漿や血清、唾液、尿など、すべての体液に存在します。これらの液体中のEVは、神経炎症性疾患や神経変性疾患、癌、自己免疫疾患など、さまざまな疾患の非侵襲的バイオマーカーとして機能することが大いに期待されています5,6,7。さらに、インビトロ機構研究は、培養培地3、8、9に放出されたEVを分離することによって細胞培養技術を通じて行うことができる。

疾患の病態生理におけるEVの役割を理解するには、EVが見つかった液体から適切に分離することが最も重要です。EV分離のゴールドスタンダードは長い間示差超遠心(dUC)10でしたが、EVを他の細胞外成分からよりよく分離するために、より洗練された技術が生まれています。これらの手法には、密度勾配、非対称フローフィールドフローフラクション(A4F)、フローサイトメトリー、イムノキャプチャー、ポリエチレングリコール沈殿、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)などがあります11,12,13。各手法には、独自の長所と短所があります。しかし、特にSECは、生体液と細胞培養上清の両方からEVを非常に効果的に分離することが示されています8,14,15。SECには、比較的簡単でユーザーフレンドリーであるという追加のボーナスもあります。

SECは、サイズに基づいて流体の成分を分離する方法です。この技術では、樹脂のカラム(社内で製造されたもの、または市販品で購入されたもの)を使用してサンプルを分画します。サンプル中の小さな粒子は樹脂内のビーズの間に閉じ込められますが、大きな粒子は樹脂をより自由に通過できるため、プロセスの早い段階で溶出します。EVは多くの細胞外タンパク質やタンパク質凝集体よりもサイズが大きいため、EVは細胞外タンパク質よりも速くカラムを通過し、早い画分で溶出します14。

この方法の論文では、コントロールおよび小胞体(ER)ストレス条件の両方の下で、ヒト希突起膠細胞から細胞培養培地(CCM)からEVを分離するためのSECの使用について概説しています。このプロトコルを使用すると、この手法で分離されたEVは、一緒にプールして下流の特性評価のために濃縮できる特定の画分内に見られ、分離されたEVは細胞に由来し、CCMを補完するために使用されるウシ胎児血清(FBS)などの外因性源からではないことが示されています。EV画分における標準的なEVマーカーCD63、CD81、およびCD916、17、18、19の存在、およびタンパク質画分におけるそれらの不在は、ウェスタンブロッティングで実証されています。透過型電子顕微鏡(TEM)を使用して、EVは視覚化され、期待される形態を示し、EV分画でのみ観察されます。粒子は、対照およびERストレス条件の両方のEVおよびタンパク質画分でもカウントされ、EVサンプルでは直径50〜200nmの予想されるサイズ範囲内の多数の粒子が観察されます。これらのデータを組み合わせることで、SECが細胞培養培地からEVを分離するための効率的かつ効果的な方法であるという考えが裏付けられています。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 緩衝液および試薬の調製

注:無菌性を維持するために、細胞培養フードで細胞培養試薬を作ります。

  1. 細胞培養試薬の調製
    1. 500 mLの高グルコースDMEMに50 mLのFBSと5 mLのペニシリン-連鎖球菌(Pen-Strep)を加えて通常の高グルコースDMEMを調製し、4°Cで保存します。 この培地は、細胞の培養と増殖に使用します。
    2. 500 mLの高グルコースDMEMに50 mLのエクソソーム枯渇FBSと5 mLのPen-Strepを加えて、エクソソーム枯渇高グルコースDMEMを調製し、4°Cで保存します。 この培地は、EV分離前の細胞治療に使用します。
    3. 10 mgのツニカマイシンを1 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に加えて、ツニカマイシンを調製します。0.2 mLチューブに50 μLのアリコートを入れ、-20°Cで保存します。
  2. EV分離試薬の調製
    1. 1 Lメスシリンダー内の1 Lの脱イオン(DI)水に9.89 gのPBS粉末を加えて、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製します。PBSが溶解するまで攪拌プレート上で溶液を攪拌する。
    2. PBSを添加する前に、オートクレーブを使用してガラス製品を滅菌してください。ガラス製品をビンに入れ、ドアを閉め、121°Cで30分間殺菌します。
    3. 層流キャビネット内で、真空を0.22 μmフィルターに接続し、オートクレーブ滅菌したボトルの上にフィルターを置きます。PBSをフィルターにゆっくりと注ぎ、ろ過したPBSをオートクレーブ滅菌したボトルに回収します。
    4. 500 mLメスシリンダー内の500 mLの1x PBSに9.99 gの水酸化ナトリウムを加えて、0.5 M水酸化ナトリウムを調製します。水酸化ナトリウムがPBSに溶解するまで攪拌プレート上で溶液を攪拌し、0.22 μmフィルターを使用してオートクレーブ処理された500 mLボトルにろ過します。
    5. 500 mLメスシリンダー内の500 mLの1x PBSに0.25 gのアジ化ナトリウムを加えて、0.05%アジ化ナトリウムを調製します。アジ化ナトリウムがPBSに溶解するまで攪拌プレート上で溶液を攪拌し、0.22 μmフィルターを使用してオートクレーブ処理された500 mLボトルにろ過します。
  3. タンパク質の単離、定量、同定試薬の調製
    1. 1 mLの1 M Tris(pH 7.4)、1 mLの10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1 gのデオキシコール酸、1 mLのNP-40、および0.89 gの塩化ナトリウム(NaCl)を組み合わせて、100 mLのRIPA溶解バッファーを調製します。容量を蒸留H2Oで100mLにし、4°Cで保存する。 RIPAにホスファターゼとプロテアーゼ阻害剤を加えた溶液を作るには、15 mLチューブにRIPAバッファー1 mLごとに10 μLのホスファターゼとプロテアーゼ阻害剤を加え、溶液を4°Cで保存します。
    2. 使用直前に、BCAアッセイキットから提供された試薬A試薬10 mLと試薬B試薬200 μLを15 mLチューブに入れて、BCAアッセイ作業試薬を調製します。使用直前に、15mLチューブにA試薬25部、B試薬24部、C試薬1部を加えてmicroBCAアッセイ用試薬を調製した。
    3. 1 LのDI水に30.3 gのトリス塩基、144 gのグリシン、および10 gのSDSを加えて、10xゲル電気泳動ランニングバッファーを調製します。ランニングバッファーは4°Cで保存します。 トリス塩基3.03 g、グリシン14.4 g、メタノール200 mLを加えて1xトランスファーバッファーを調製し、DI水で容量を1 Lに調整します。転写バッファーは4°Cで保存してください。
    4. 1 LのDI水に2.4 gのトリス塩基、8 gのNaCl、および1 mLのTween-20を加えて、Tween-20(TBS-Tween)を含むトリス緩衝生理食塩水を調製します。TBSトゥイーンは4°Cで保管してください。
    5. TBS-Tween100 mLに5 gの粉末無脂肪乳を加えて、5%ブロッキング溶液を調製します。ブロッキングバッファーを4°Cで保存します。
    6. 使用直前に、15 mLチューブに4 mLの過酸化物溶液と4 mLのルミノール/エンハンサー溶液を加えて化学発光基質を調製し、穏やかに転倒させて混合します。

2. 細胞の培養・処理

  1. 2つのT175細胞培養フラスコに、それぞれ2.3 x 106 個のヒトオリゴデンドログリオーマ(HOG)細胞を播種します。通常の高グルコースDMEMの最終容量を25 mLにし、細胞培養インキュベーター内で5%CO2 と共に37°Cで48時間インキュベートします。
  2. 48時間の終わりに、エキソソーム枯渇した高グルコースDMEMを37°Cの水浴中で温めた。治療のために、25 μLの10 mg / mLのツニカマイシンを25 mLのエキソソーム枯渇培地に加え、最終濃度10 μg / mLのツニカマイシンを加えてERストレスを誘発します。コントロールのために、25 μLのDMSOを25 mLのエキソソーム枯渇培地に加えます。
  3. 細胞から通常の高グルコースDMEMを除去して廃棄し、細胞とフラスコを10 mLの1x PBSで穏やかにすすぎます。PBSを吸引して廃棄します。
  4. 25 mLのコントロール培地をフラスコで標識したコントロールに加え、培地中の10 μg/mLのツニカマイシン25 mLをフラスコのラベル付き処理に加えます。フラスコを細胞培養インキュベーターに24時間戻します。

3.コンディショニングCCMの収集と濃縮(図1)

  1. PBSを37°Cの水浴に入れます。フラスコを10倍および100倍の対物レンズを備えた複合顕微鏡で観察します。フラスコ間の違いをメモします。コントロールフラスコと処理フラスコの両方に対して次の手順を実行します。
  2. フラスコから培地を取り出し、50 mLチューブに入れます。チューブを500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を新しい50 mLチューブに移します。
  3. チューブを2,000 x g で4°Cで20分間遠心分離します。 上清を新しい50 mLチューブに移し、氷の上に置きます。
  4. 4つの15 mL 3 kDaカットオフ限外ろ過ユニットを入手し、各チューブに5 mLのPBSを追加します。限外ろ過ユニットを4,000 x g で4°Cで10分間遠心分離して、フィルターをプライミングします。
    注:現在のプロトコルでは、細胞から放出されるすべての細胞外タンパク質を保持するために、3 kDaの分子量カットオフ限外ろ過ユニットが使用されました。より大きな分子量カットオフ限外濾過ユニット(例えば、30kDa)もこのプロトコルで機能するであろうが、30kDaより小さい細胞外タンパク質は濾過され、サンプルから除去されるであろう20、21。
  5. 限外ろ過ユニットからPBSを取り外します。各条件(コントロールおよびツニカマイシン処理)の上清をそれぞれ2つの限外ろ過ユニットに分割し、それぞれに約12.5mLの培地を入れます。
  6. チューブを4,000 x g で4°Cで1時間45分間、または各限外ろ過ユニットの濃縮媒体(保持液と呼ばれる)が250 μL以下に濃縮されるまで遠心分離します。
  7. 両方のコントロール限外ろ過ユニットから保持液を1つのラベル付き1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。両方の処理された限外ろ過ユニットから保持液を別のラベル付き1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。
  8. 各マイクロ遠心チューブ内の保持液の総容量を500μLになるように測定します。サンプルが500 μL未満の場合は、最終容量が500 μLになるまで、0.22 μmのろ過1x PBSを追加します。 チューブを-80°Cの冷凍庫に入れます。

4.細胞採取

  1. トリプシン、PBS、およびエキソソーム枯渇DMEMを37°Cの水浴に入れます。7 mLのトリプシンを対照フラスコと処理フラスコの両方に加え、インキュベーターに5分間入れます。
  2. 顕微鏡で観察して、細胞が持ち上げられているかどうかを確認します。細胞が持ち上げられていない場合は、フラスコを手のひらにしっかりとたたいて細胞を取り除きます。
  3. フラスコを7 mLのエキソソーム枯渇DMEMで洗浄します。フラスコから細胞懸濁液を収集し、15 mLチューブに入れます。
  4. チューブを4°Cで500 x g で10分間遠心分離します。 上清を除去し、5 mLの1x PBSを細胞ペレットに加えます。穏やかにピペットミックスしてペレットを分解します。
  5. チューブを500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を除去し、200 μLのRIPAとホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤溶液を細胞ペレットに加え、ピペットで混合します。
  6. RIPA溶液中の細胞を1.5 mLチューブに移します。チューブを氷の上に5分間置きます。チューブを14,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
  7. 上清を新しい1.5 mLチューブに移します。チューブに治療条件と日付のラベルを付けます。チューブを-80°Cの冷凍庫に入れます。
    注: プロトコルはここで一時停止できます。

5. サイズ排除クロマトグラフィーを用いたEV分離(図2)

注意: 次の手順を2回実行し、1回はコントロール保持液、1回はツニカマイシン処理保持液に1回実行します。
注:このセクションで使用されるPBSは、0.22μmのフィルター付き1xPBSです。

  1. 自動フラクションコレクター(AFC)をオンにし、設定を調整して8つのフラクションを収集し、フラクションあたり0.5 mL、およびバッファー(ボイド)容量をデフォルトにします。
    注:AFCの動作条件は次のとおりです:カラム/ベッド容量= 10mL;ボイド容量= 2.70mL;フラッシュ容量= 15mL;最適なフラクションサイズ= 500 μL;ランごとに必要なバッファー= 65 mL;20 °Cでの流量 = 1.0 mL/分;列の再利用性 = 5 つの用途。
  2. カラム(材料表を参照)を4°Cから取り外し、カラムを室温まで温めてから開始します(通常は~30分)。
  3. 保持液サンプルを-80°Cの冷凍庫から取り出し、氷の上に置いて解凍します。待っている間、蓋を内側に向けてAFCカルーセルにラベルの付いた1.5mLチューブを8本セットします。
  4. バーコードをリーダーに向けてAFCに列を挿入します。画面の指示に従って収集を開始し、カルーセルにチューブがあり、廃棄物収集機が正しく機能していることを確認します。
  5. 保存バッファーがカラムマトリックスの上部に完全に吸収されたら、15 mLの1x PBSをカラムに追加して、カラムのフラッシュを開始します。PBSを追加するのが早すぎると、ストレージバッファが希釈され、適切なフラッシュが妨げられるため、早すぎないでください。
  6. 15 mLのPBSがすべてマトリックスに吸収される直前に、[ OK ]をクリックしてフラッシングを停止し、マイクロピペットでカラムマトリックスの上部から残留PBSを取り除きます。マトリックスには触れないでください。
  7. カラムの中央に500 μLのサンプルを追加します。[ OK ] をクリックして実行を開始します。サンプルがマトリックスに吸収されるのを観察し、サンプルが完全に吸収された直後に8 mLのPBSをカラムにすばやく加えます。
  8. AFCは自動的にボイドボリュームをカルーセルの中心に払いのけ、それぞれ500μLの8つの画分すべてを回収します。実行が終了したら、カルーセルからフラクションを取り除き、氷の上に置きます。画分1〜4はEVを含み、画分5〜8は細胞外タンパク質を含む。カルーセルの中心からボイドボリュームを削除します。
  9. 8 つのフラクションを回収した後、10 mL の PBS をカラムに追加し、カラムから残留サンプルを洗い流します。リテンテートサンプルをカラムから完全に洗い流した後、15 mLの1x PBSをカラムに加えます。
  10. 最終的なPBSがマトリックスに吸収されるので、カラムのマトリックスの中心に500 μLの0.5 M水酸化ナトリウムを加えます。水酸化ナトリウムが吸収されたら、1x PBSを30 mLカラムに加え、洗い流します。
  11. 別のサンプルを実行する場合は、8本のラベル付き1.5 mLマイクロ遠心チューブをカルーセルに追加し、手順5.7〜5.10を繰り返します。
  12. すべてのサンプルが完成したら、次の手順を実行して、後で使用するためにカラムを保存します。手順 5.10 で概説されているように、30 mL の PBS をカラムに流した後、15 mL の 0.05% アジ化ナトリウムをカラムに加えます。
  13. カラムマトリックスの上部に約5 mLのアジ化ナトリウムを残します。AFCからカラムを取り外し、上部と下部のキャップを取り付けます。カラムを4°Cに戻して保存します(カラムは最大5回まで使用できます)。

6. EVおよびタンパク質画分の限外ろ過

  1. サンプルあたり2つの2 mL、3 kDaカットオフ限外ろ過ユニットを取得します。一方のユニットを使用してEV画分(画分1〜4)を濃縮し、もう一方のユニットを使用してタンパク質画分(画分5〜8)を濃縮します。各ユニットは、コーン、フィルター、フロースルーシリンダーの3つの部分で構成されています。各部品に適切なラベルを付けます。
  2. 限外ろ過ユニットを構築し、0.22 μmのろ過された1x PBSの1 mLをフィルター部分に追加し、コーンピースでキャップします。限外ろ過ユニットを遠心分離し、コーン側を上にして3,500 x g で4°Cで10分間加熱します。
  3. ろ過されたPBSをフロースルーシリンダーから取り外します。限外ろ過ユニットを逆さま(コーン側を下にして)裏返し、4°Cで1,000 x g で2分間遠心分離します。 コーンから残りのPBSをすべて取り外します。
  4. 適切な画分(500μL容量全体)を各限外ろ過ユニットに追加します(総容量は2 mLになります)。遠心分離機カラムは、4°Cで3,500 x g で1時間45分、または保持液レベルが100 μLになるまでコーン側を上にします。
  5. フロースルーシリンダーを取り外し、フロースルーを破棄します。限外ろ過ユニットを逆さま(コーン側を下にして)裏返し、4°Cで1,000 x g で2分間遠心分離します。
  6. コーン内のリテンテートを標識された1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、0.22 μmのろ過された1x PBSで各サンプル容量を150 μLにします。チューブを-80°Cの冷凍庫に入れます。
    注: プロトコルはここで一時停止できます。

7.メディアコントロール

  1. 2つのT175細胞培養フラスコを得る。一方のフラスココントロールともう一方の処理にラベルを付けます。エキソソームが枯渇した高グルコースDMEMを37°Cの水浴中で温める。
  2. 25 μLのツニカマイシンストック溶液(10 mg / mL)を25 mLの培地に加え、標識処理したフラスコに入れます。25 μLのDMSOを25 mLの培地に加え、ラベルの付いたコントロールのフラスコに入れます。フラスコを細胞培養インキュベーターに24時間保管します。
  3. メディアを収集し、手順3.2〜3.8で概説されているようにEVを分離するように処理します。その後、セクション 5 と 6 で説明されているすべての手順を実行します。

8. ウェスタンブロッティング

  1. BCAアッセイによる細胞ライセートおよびタンパク質画分からのタンパク質定量
    注:対照サンプルとツニカマイシン処理サンプルの両方からのタンパク質定量は、次の手順で実行されます。
    1. 溶解した細胞とタンパク質画分を氷上で解凍します。サンプルごとに3つの希釈チューブを作成します。1:2、1:10、および1:100。
    2. 96ウェル透明底アッセイプレートに3回、ウシ血清アルブミン(BSA)タンパク質標準物質25 μL、および各サンプル希釈液25 μLをロードします。マルチチャンネルピペットを使用して、標準物質またはサンプルを含む各ウェルに200 μLの作業試薬を追加します。
    3. プレートを37°Cで30分間インキュベートし、プレートリーダーで562 nmの吸光度でプレートを読み取ります。各サンプルのタンパク質濃度を計算し、細胞ライセート用に20 μgのタンパク質、タンパク質画分用に15 μgのタンパク質を得るために必要なサンプルの量を決定します。
  2. マイクロBCAアッセイによるEV画分からのタンパク質定量
    1. EVサンプルを氷上で解凍します。サンプルごとに1:50と1:100の2つの希釈を行います。
    2. 96ウェルクリアボトムアッセイプレートに3回ロードし、BSAタンパク質スタンダード100 μL、および各サンプル希釈液100 μLをロードします。マルチチャンネルピペットを使用して、標準物質またはサンプルを含む各ウェルに100 μLのmicroBCA作動試薬を追加します。
    3. プレートを37°Cで2時間インキュベートし、プレートリーダーで562 nmの吸光度でプレートを読み取ります。各サンプルのタンパク質濃度を計算し、EV画分用に15 μgのタンパク質を得るために必要なサンプルの量を決定します。
  3. ウェスタンブロッティング
    注:ウエスタンブロッティングプロトコルは、22に記載のように行い、以下に概説するように修正した。
    1. 製造元の指示に従って、ゲル作成キットで10%ポリアクリルアミドゲルを作成します。
    2. ゲル電気泳動の場合は、1.5 mLチューブで、タンパク質20 μgに必要な細胞ライセートの容量、4x Laemmliバッファー5 μL、および総容量を20 μLにするために必要なRIPAバッファーの容量を組み合わせて、細胞ライセートサンプルを調製します。
    3. 1.5 mLチューブで、15 μgのタンパク質に必要な量のサンプル、5 μLの4x Laemliバッファー、およびRIPAバッファーを20 μLの容量に組み合わせて、EVおよびタンパク質画分サンプルを調製します。
    4. 1.5 mLチューブで15 μLのサンプルと5 μLの4x Laemmliバッファーを組み合わせて、培地コントロールサンプルを調製します。
      注:使用する抗体に応じて、Laemmliバッファーには50 mMジチオスレイトール(DTT)などの還元剤が含まれている場合と含まれない場合があります。
    5. すべてのサンプルを95°Cで5分間煮沸し、サンプルを氷に移して冷却し、10,000 x gで30秒間短時間遠心分離してから、サンプルを氷に戻します。
    6. 電気泳動タンクにゲルを追加し、1xゲル電気泳動ランニングバッファーを追加します。15 μLのタンパク質ラダーと20 μLのサンプルをロードします。ゲルを200 Vで30〜50分間、またはサンプルがゲルの底に達するまで、流れ落ちる直前に実行します。
    7. タンパク質をPVDFメンブレンに1xトランスファーバッファーで4°C、100 Vで30分間、または転写が完了するまで移します。補足図1、補足図2、および補足図3は、転写完了後の各ブロットの無染色画像を示す。
    8. メンブレンを5%ミルク/TBS-トゥイーンでシェーカーで室温で1時間ブロックします。一次抗体溶液中のメンブレンを4°Cの振とう機で一晩インキュベートします。 抗体希釈情報については 表1 を参照してください。
    9. 翌日、一次抗体を除去し、メンブレンをTBS-Tweenで3回、振とう機で室温で5分間洗浄した。
    10. 5%ミルク/TBS-トゥイーンで適切な二次抗体を調製します。希釈情報については 、表1 を参照してください。二次抗体をメンブレンに加え、シェーカーで室温で1時間インキュベートした後、TBS-Tweenで3回洗浄し、シェーカーで室温でそれぞれ5分間洗浄します。
    11. 化学発光基質をメンブレンに加え、シェーカー上で室温で5分間インキュベートします。比色分析および化学発光分析を使用した画像ブロット。補足図4、補足図5、および補足図6は、各ブロットのトリミングされていない画像を示しています。

9. TEMイメージング

  1. グロー放電23 400メッシュカーボン/ホルバーコーティングされたグリッドは、炭化水素を除去し、グリッドを親水性にします。
  2. 5 μLのEVまたはタンパク質画分サンプルをグリッドに追加します。グリッドを室温で3〜5分間インキュベートします。
  3. ろ紙で吸湿して余分な溶液を取り除きます。グリッドを5 μLのナノピュア水で洗浄し、ウィッキングで余分なものを取り除きます。
  4. 5 μLの1%酢酸ウラニル水溶液を塗布し、すぐにウィックオフします。グリッドを乾かします。透過型電子顕微鏡で120kVで画像グリッドを作成し、荷電対デバイスカメラで画像をキャプチャします。

10. ナノ粒子追跡分析(NTA)

  1. EVおよびタンパク質画分サンプルを-80°Cから入手し、氷上で解凍します。
  2. コンピュータとNTA機器の電源を入れます。NTAソフトウェアを開くと、自動的に初期化が開始されます。
  3. 粒子のない水を含む適切なポンプを選択し、[ 機器をすすぐ ]をクリックしてセルをすすぎます。すすぎながら、注射器を使用して機器の前面にある注入ポートに10〜20mLの粒子のない水を注入し、気泡を避けます。
  4. セル品質チェック画面がポップアップします。[ OK ]をクリックすると、セルの品質チェックが開始されます。チェックに合格すると、オートアライメントポップアップ画面が表示され、「セルに100 nmのアライメント懸濁液(希釈1:250,000)を充填してください」と表示されます。
    1. チューブに無粒子水10 mLと10 μLの100 nmポリスチレンビーズを加えて、アライメント懸濁液の希釈液1を調製します(1:1,000希釈)。軽く反転させて混ぜます。希釈液1の貯蔵寿命は4°Cで2〜3日です。
    2. 粒子を含まない水20 mLと希釈液1(1:1,000)80 μLをチューブに加え、アライメント懸濁液の希釈液2を作成し、1:250,000の希釈液を作成します。チューブをそっと反転させて混ぜます。希釈2の貯蔵寿命は室温で30〜60分です。
  5. セルに2 mLの希釈液2(1:250,000)を充填します。[ OK ]をクリックすると、プログラムはオートアライメント(フォーカス)とフォーカスの最適化を完了します。[解析]タブが開き、放物線内の測定セルの清浄度と対称性の結果を提供するプロファイルが作成されます。「ビデオ顕微鏡の表示」というポップアップ画面が表示され、実験の準備が整いました。 [OK ]をクリックすると、プログラムは[セルチェック]タブに戻ります。
  6. 粒子のない水を注入口に注入して細胞からポリスチレンビーズを洗い流し、細胞を洗浄します。検出された粒子の数が0〜10(通常は5〜10 mL)になるまで洗浄を続けます。1 mLの0.22 μmフィルターPBSを加えて、最初のサンプルの細胞をプライミングします。
  7. 最初のサンプルを0.22 μmのろ過PBSで希釈し(1:1000希釈から開始)、希釈係数をプログラムに入力します。1 mLのサンプルをセルに挿入し、粒子の動きが遅くなるまで5分間待ちます。感度とシャッターをそれぞれ75.0と100に設定します。
  8. 理想的なサンプル希釈のために検出される粒子の数は50〜200粒子です。50未満または200を超える粒子が報告された場合は、サンプルの希釈率を調整します。新しい希釈が必要な場合は、0〜10個の粒子が検出されるまで、粒子のない水でセルを洗浄します。理想的な希釈が見つかるまで、希釈サンプルの追加と洗浄を繰り返します。
  9. 11 個のカメラ位置をすべてチェックして、パーティクルの動きが遅くなったことを視覚化し、検出されたパーティクルの数がすべてのカメラ位置間で類似していることを確認します。パーティクルの数がカメラの位置によって大きく異なる場合は、サンプルを追加します。
  10. [ 測定 ]タブをクリックし、[ ビデオ集録]を実行します。ビデオ取得タブで、サンプルのカスタム名を入力し、安全な場所を特定します。 自動保存.txt および 自動保存.pdf チェックボックスをオンにして、データを保存します。
  11. 温度を25°Cに設定し、 488nm をクリックしてレーザーを設定し、 11 をクリックしてカメラの位置を表示します。[ OK] をクリックしてデータ収集を実行します。プログラムは、11の位置すべての粒子の数とサイズの分析を開始します。分析タブの下に、x軸に直径/ nm、y軸に粒子/ mLの棒グラフが表示されます。
  12. データが収集されると、[職位の概要]というタイトルのポップアップ画面が表示され、11の職位のそれぞれのデータが提供されます。分析から2つ以上の位置が削除されている場合は、より多くのサンプルで手順を繰り返します。そうでない場合は、[ 続行 ]ボタンをクリックします。結果を含むPDFおよびtxtファイルが開きます。ファイルを安全な場所に保存します。
  13. 別のサンプルを実行するには、[ セル チェック ] タブに移動し、手順 10.6 から 10.12 を繰り返します。完了したら、検出された粒子の数が0〜10(約5〜10 mL)になるまで、粒子のない水で細胞を洗浄します。1 mLの0.22 μmフィルターPBSで細胞をすすぎ、プログラムを閉じて、コンピューターの電源を切ります。

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結果

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ウェスタンブロッティングにより、EVとCCMの適切な分離が明らかになりました
細胞培養培地からEVを分離するためのSECの有効性を評価するために、対照サンプルからの個々の画分を使用してウェスタンブロットを実行し、ネガティブコントロールとして使用された3つの標準的なEVマーカー、CD9、CD63、CD81、およびGM130およびカルネキシン18の発現を調べました(図3)。アルブミン発現18 も、CCM中の細胞外タンパク質がEVから適切に分離できることを確認するためにプローブされました。CD9、CD63、およびCD81の強い発現は画分1〜4で観察され、画分5〜8ではほとんどまたはまったく発現が見られませんでした。GM130もカルネキシンもどの画分でも観察されなかった。アルブミンは画分6〜8にのみ存在した。まとめると、これらのデータは、小胞が主に画分1〜4に溶出し、画分5〜8に細胞外タンパク質が含まれていることを示しています。このため、画分1〜4を結...

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ディスカッション

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SECは、EVをコンディショニングCCMから適切に分離するためのユーザーフレンドリーな方法です。細胞由来EVを特異的に分離するためには、CCMの種類とそのサプリメントを慎重に検討する必要があります。多くの細胞培養培地には、血清を採取した動物由来のEVを含むFBSを補充する必要があります。これらの血清EVは、培養中の細胞に由来するEVによって産生される任意のシグナルを飽和させ、マスクし得る26。したがって、実験を行う際には、EV枯渇FBSを可能な限り使用して、見出されたEVがウシ由来ではなく細胞由来に起因することを確実にすべきであり、これは商業的に購入することも、他の場所でレビューされた様々な技術を通じて社内で製造することもできる26、27。

SEC 列を介してサンプルを実行する場合は、フィルター処理された PBS を使用することが不可欠です。そうしないと、各画分は、細胞由来のEVや細胞外タンパク質だけでなく、PBSから...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

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著者らは、ペンシルベニア州立大学ベーレンドとハモット健康財団の資金提供、およびペンシルバニア州ユニバーシティパークのペンシルベニア州立大学顕微鏡施設に感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2-メルカプトエタノールVWR97064-588
4X Laemmli サンプルバッファーBioRad1610747
Amicon Ultra-15 遠心フィルターユニット、ウルトラセル、3 KDa、15mLシグマ・アルドリッチUFC9003083 kDa カットオフ
アミコンウルトラ-2 遠心フィルターユニット、ウルトラセル-3 メンブレン付きシグマ・アルドリッチUFC2003243 kDa カットオフ
アンモニウム過硫酸塩Sigma-AldrichA3678-100G
抗ウサギ IgG、HRP リンク抗体細胞シグナル伝達技術7074V1:1000
希釈抗カルネキシン抗体Abcam ab225951:500 希釈
抗 CD9 マウスモノクローナル抗体BioLegend3121021:500 希釈
抗 GM130 抗体 [EP892Y] - シスゴルジマーカーAbcamab526491:500 希釈
抗マウス IgG、HRPリンク抗体細胞シグナル技術7076V1:1000
希釈自動フラクションコレクターIzon Science
BCA アッセイキットBio-Rad
CCD カメラGatan Orius SC200
Cd63 マウス 抗ヒトBD5560191:1000 希釈
CD81 抗体Santa Cruz Biotechnologysc-239621:1000 希釈
Cellstar フィルターキャップ 細胞培養フラスコGreiner Bio-One660175
ChemiDoc MPイメージャーBioRad
Clarity Western ECL SubstrateBioRad1705061
deoxycholateSigma-AldrichD6750-10G
dithiothreitolSigma3483-12-3
DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodiumCytivaSH300022.
ウシ胎児血清 プレミアムグレードVWR97068-085
ウシ胎児血清、エキソソーム枯渇型サーモサイエンティフィックA2720801
グリシンBioRad1610718
お得な 無脂肪粉ミルクアマゾンB076NRD2TZ
HOG ヒト乏突起膠腫細胞株Sigma-AldrichSCC163
Izon Science USA Ltd qev Size Exclusion Columns 5pkIzon Science
Methanol >99.8% ACSVWRBDH1135-4LP
Mini-PROTEAN ガラスプレートBioRad16533100.75mm スペーサー付き
Mini-PROTEAN ショートプレートBioRad1653308
NP-40Sigma-Aldrich492016
ペニシリン-ストレプトマイシン、溶液Sigma-AldrichP4458-100mL
リン酸緩衝生理食塩水 PBSフィッシャーサイエンティフィックBP66150
ピアス BCA タンパク質アッセイキットおよび試薬サーモフィッシャーサイエンティフィック23227
ピアス PVDF 転写膜サーモサイエンティフィック88518
ピアス ウェスタンブロッティングフィルターペーパーサーモScientific84783
Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mLBio BasicTB0560
Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)Cell Signaling Technology5872S
Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)]ABCamab1250111:1000 希釈
水酸化スロジウムSigma-AldrichSX0603
アジ化ナトリウムフィッシャーサイエンティフィックBP922I-500
塩化ナトリウムSigma-AldrichS9888-500G
ドデシル硫酸ナトリウム、≥99.0% (GC)、ダストフリーペレットSigma-Aldrich75746-1KG
テトラメチルエチレンジアミンSigma-AldrichT9281-25ML
TGX Stain-Free FastCast アクリルアミドキット、10%BioRad1610183
透過型電子顕微鏡FEI Tecnai 12 Biotwin
TrisBioRad1610716
トリプシン0.25%プロテアーゼとブタトリプシン、HBSS、EDTA;カルシウム、マグネシウムCytivaSH30042.01
TunicamycinTocris3516
Zeta Viewソフトウェア、AnalytikNTAソフトウェア
FSなし、、、

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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