方法論記事

エクソソームベースのドーパミンキャリアシステムの定式化と特性評価

DOI：

10.3791/63624

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2022年4月4日

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1Vocational School of Health Services/İstanbul, Altinbas University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Department of Bioengineering, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Medicine Faculty, Istinye University, 7Vocational School of Health Services, Istinye University, 8The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 9Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

この記事について

サマリー

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ここでは、ウォートンゼリー間葉系幹細胞から幹細胞の単離エクソソームをドーパミン負荷することで製剤を得ることを目指しました。エキソソームの単離と特性評価、得られたエクソソームへの薬物負荷、および開発された製剤の細胞毒性活性は、このプロトコルで説明されています。

要約

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サイズが40〜200nmのエクソソームは、細胞外小胞の最小サブグループを構成します。細胞から分泌されるこれらの生理活性小胞は、細胞間のカーゴやコミュニケーションに積極的な役割を果たしています。エクソソームは、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、羊水、初乳、母乳、関節液、精液、胸膜などの体液に多く含まれています。エクソソームは、その大きさから、血液脳関門(BBB)を通過できることから、中枢神経系疾患において重要な役割を担っているのではないかと考えられます。そこで本研究では、ウォートンゼリー間葉系幹細胞(WJ-MSC)から単離したエクソソームにドーパミンを内包することで、エクソソームを用いたナノキャリアシステムの開発を目指しました。特性評価プロセスに合格したエクソソームをドーパミンとインキュベートしました。ドーパミンをロードしたエクソソームは、インキュベーションの最後に再特徴付けされました。ドーパミンをロードしたエクソソームを、薬物放出および細胞毒性アッセイで調査しました。その結果、ドーパミンがエクソソーム内にうまくカプセル化され、ドーパミンをロードしたエクソソームが線維芽細胞の生存率に影響を与えないことが示されました。

概要

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重要な特徴を持つ生理活性小胞であるエクソソームは、40nmから200nmまでの大きさです。エクソソームは細胞膜に由来し、エンドソーム1の放出によって形成される。これらの構造は、細胞間コミュニケーターとして機能し、隣接する細胞と相互作用して活性分子の移動を促進します。エクソソームは、多くの異なる供給源から単離することができます。これらには、血漿、尿、脳脊髄液、唾液などの体液、および in vitro 条件下で培養された細胞株が含まれます。エクソソームは、脂質、タンパク質、核酸などの生体高分子を含むため、神経損傷の除去に重要な役割を果たします2。神経系の支持細胞であるグリアは3、エクソソーム を介して タンパク質やマイクロRNAをニューロンの軸索に伝達します4。

神経伝導の特徴であるミエリン鞘を形成する脂質も、エクソソームを介してオリゴデンドロサイトから放出される4,5。エクソソームは、シナプス可塑性、ニューロンストレス応答、細胞間コミュニケーション、脳内のニューロン新生などのプロセスにも関与しています6,7。エクソソームはナノ次元を持っているため、BBBを通過することができます。この膜8を貫通した後、間質液から脳脊髄液への特別な移行経路がある。エクソソームは、その表面特性により、薬物送達システムとして標的細胞と効率的に相互作用し、負荷された薬物を能動的に送達することができます。

エクソソームの表面には様々な接着性タンパク質(テトラスパニンおよびインテグリン)が発現しているため、これらの細胞外小胞は宿主細胞膜と容易に相互作用し、融合することができる9。エクソソームは、BBBに浸透する能力とその表面特性により、特に中枢神経系疾患の治療において、薬物送達システムとして使用できると考えられています。間葉系幹細胞(MSC)由来のエクソソームは、同種細胞療法と比較して免疫拒絶反応のリスクが低く、この点で、無細胞治療アプリケーションの重要な要素となり得る10。

ドーパミンは、脳内の欠乏がパーキンソン病(PD)の特徴である分子であり、日々悪化します11,12,13。PDは、中脳の黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの変性および運動ニューロン機能の喪失と関連していることが知られている14,15。ドーパミン作動性ニューロンの死は、神経伝達物質ドーパミンの脳線条体への供給を妨げる。その結果、PD特異的な症状が出現する16。PDのこれらの症状は、運動緩慢、姿勢の不安定性、硬直、特に安静時の振戦です12,13。パーキンソン病は2世紀以上前に初めて記述されたが、この疾患の病理学と病因を理解するための研究はまだ進行中であり、現在、パーキンソン病は複雑な全身性疾患であることが認められている17。ドーパミン欠乏症が起こり、神経細胞の80%以上が変性すると臨床的PD症状がみられると予測されている18。この疾患の治療では、運動症状を軽減するために不完全なドーパミン補給が好まれます。In vivo研究では、ドーパミンを脳に直接注入すると、動物の症状が大幅に軽減されることが示されています19。L-DOPA(L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン)やドーパミン受容体薬などのドーパミン前駆体は、ヒトでは脳へのドーパミンの直接注入が不可能であり、体内に入るドーパミンがBBB20を通過できないため、診療所で使用されています。これらのタイプの薬は、時間の経過とともに効果を失います。したがって、疾患の病態生理を明らかにし、PDの患者への影響を軽減するために、新しい治療戦略と治療法を開発することが非常に必要です。

近年、エクソソームを用いた研究は、神経系疾患の治療法と病態の双方に関する情報収集として注目されています。MSC由来のエクソソームは、神経損傷の炎症を軽減し、神経細胞の再生に寄与することが示されています21,22,23。さらに、MSC由来のエクソソームセクレトームは、特にドーパミン作動性ニューロンに対して神経栄養作用および神経保護作用を示すことにより、アポトーシスを減少させることが報告されています24,25。近年、エクソソームを治療用薬物送達システムとして用いるプラットフォームの研究が加速しています。多くの研究において、関連する薬物はエキソソームに容易にカプセル化され、標的細胞、組織、および臓器に安全に送達できることが観察されています26,27。インキュベーション、凍結/融解サイクル、超音波処理、および押出成形などのさまざまな方法を、エキソソームへの薬物ローディングに用いることができる28。

エキソソームまたはエキソソーム様小胞とのコインキュベーションにより、親油性小分子をこれらの送達システムに受動的にカプセル化することができます28,29,30。特に、クルクミン31、カタラーゼ30、ドキソルビシン32、パクリタキセル33などの様々な分子がエクソソームに効果的にロードされました。抗酸化活性を持つカタラーゼ含有エクソソームは、脳内の神経細胞やミクログリア細胞に効率よく蓄積し、強い神経保護活性を示すことが観察されている30。同じ研究では、ローディング効率を高めるために複合体に添加されたサポニンは、インキュベーション中の薬物ローディング率を増加させることがわかりました30,34。しかし、エクソソームへの薬物負荷の基準を確立するには、さらなる研究が必要です。

本稿では、WJ-MSCから単離したエクソソームにドーパミンをカプセル化することで、ナノキャリアシステムを開発した。WJ-MSCの培養、エクソソームの単離と特性評価、薬物ローディング実験、さまざまな技術によるドーパミン負荷エクソソームの特性評価、 in vitro 細胞毒性分析など、すべてのステップが詳細に説明されています。

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プロトコル

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注意: このプロトコルで使用されるすべての材料および機器に関連する詳細については、 部品表 を参照してください。

1. ウォートンゼリー間葉系幹細胞の培養・凍結保存

  1. WJ-MSC(ATCC製)を-80°Cの冷凍庫から取り出します。10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したDMEM-F12培地を含むフラスコに細胞を播種します。5%CO2を含むインキュベーターで37°Cでインキュベートします。
  2. 培地は2日ごとに交換してください。細胞が80%のコンフルエントに達したら継代します。継代する細胞を5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。
    注:トリプシンを添加する前にPBSで洗浄すると、フラスコ表面から細胞を簡単に分離できます。
  3. PBSを除去し、フラスコに5 mLのトリプシン-EDTA溶液を加えます。フラスコを5%CO2を含むインキュベーターで37°Cで5分間インキュベートします。
  4. 上清をチューブに集め、1,500 x g で5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を除去し、ピペッティングにより1mLのDMEM-F12 + 10% FBSをチューブに加えます。



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    4. figure-protocol-2


    3. figure-protocol-3



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結果

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エクソソームの単離と特性評価
ウォートンゼリー幹細胞を培養し、培養が十分な密度に達したら、無血清培地中で48時間インキュベートします。インキュベーション終了後、上清を-20°Cで保存します。 回収した上清をPBSで希釈し、超遠心分離を行います(図1)。得られた溶液は、NTAおよびDLS分析によって分析されます。エクソソームは、0.22μmのフィルターを通すことで滅菌されます。得られたエクソソームの平均サイズは98nmと判定された(動画 1)。遠心分離終了時に約100億個のエクソソーム粒子が得られました。NTA分析とDLS分析で明らかになったナノ粒子の数は、互いに一致しています。さらに、WJ-MSCに由来するエクソソームのゼータ電位は-15.7mVと測定されました(図2 および 図3)。

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ディスカッション

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エキソソームは、ほとんどの細胞タイプ(MSC1など)から分泌される40〜200nmの寸法の小さな膜小胞です。細胞間のコミュニケーションを可能にすることができるエクソソームは、エンドサイトーシス、食作用、ミクロピノサイトーシス、脂質媒介性内在化、融合など、さまざまな方法で細胞に侵入することができます33,44。他のナノキャリア系と比較して、エクソソーム表面に見られる脂質とコレステロールは、親水性と疎水性の両方の分子を運ぶ能力を与え、コレステロール末端の水素結合により、タイトなパッケージングが可能になります45。

本研究では、MSC由来のエクソソームの単離、薬物負荷実験、および細胞毒性アッセイを実施しました。エクソソームは、細胞間のカーゴやコミュニケーションなどの重要な機能に加えて、神経新生、特に脳において重要な役割を担っていることが知られている

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利害関係はないと宣言しています。

謝辞

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この研究は、主にユルドゥズ工科大学科学研究プロジェクト(TSA-2021-4713)から提供された研究資金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22 以上mメンブレンフィルターAisimoプロセス
0.45µに使用されます。m シリンジフィルターアイシモ滅菌工程に使用
15mL ファルコンチューブネスト細胞培養工程に使用
25cm2 細胞培養フラスコ(ファルコン、TPP組織培養フラスコネスト細胞培養工程に使用
50mL ファルコンチューブネスト細胞培養工程
に使用75 cm2細胞培養フラスコ(ファルコン、TPP組織培養フラスコネスト細胞培養ステップで使用
96ウェルプレート(ファルコン、TPPマイクロプレート)メルクミリポア細胞培養ステップで使用
アセトニトリルシグマ271004-1LHPLC分析に使用
オートクレーブNUVE-OT 90L滅菌プロセスに使用
セル培養キャビンHera Safe KS細胞培養プロセスに使用
遠心日立CF16RNエクソソーム分離ステップに使用
CO2インキュベーター Safe Cell UV付きパナソニック細胞培養プロセスに使用
ドーパミン塩酸塩 H8502-10GSigmaH8502-10Gエクソソームドーパミンローディング
に使用ダルベッコ改変イーグルス培地/栄養混合物-F12シグRNBJ7249細胞培養培地として用いた
ウシ胎児血清-FBSカプリコーンFBS-16A細胞培養培地に添加して使用しました。
冷凍庫-80°;CパナソニックMDF-U5386S-PE細胞および得られたエクソソームの保存に
パナソニック 冷蔵庫パナソニック MPR-215-PE細胞培養物および他の材料の保存に使用
高速液体クロマトグラフィー-HPLCAgilent Technologies得られた製剤の含有量からドーパミンの存在を調査した。
顕微鏡 - PrimovertZeiss細胞培養中の細胞を観察するために使用されます。
MTTアッセイBiomatik細胞生存率の測定に使用
NanoSight NS300Malvern panalyticalマルバーンpanalyticalエキソソームの特性評価に使用
Optima XPN-100 超遠心分離機ベックマン・コールターエキソソーム分離ステップに使用
PBS錠剤Biomatik43602PBS溶液の調製に
ペニシリン/ストレプトマイシン溶液CapricornPB-S細胞培養における汚染を防ぐために培地に添加しました。
ピペットエイドIsolab
Precision balance-KernKern-ABJ220-4NM溶液の調製に使用
Q500 SonicatorQsonica, LLCHPLC分析でエキソソームを消化するために使用
サポニンシグマ47036-50G-Fエキソソームドーパミンローディングプロセスで全溶液に添加して使用しました。
Spectrostar-Nano-SpectrophotomettryBMG LABTECHMTTおよび薬物放出分析に使用
SPSS 22統計パッケージプログラム
Vorteks-FinePCRFinePCR-FineVortex溶液を均一に混合するために使用される
ウォーターバス 37 >C-SenovaSenova培養ステップで使用される
Wharton'ゼリー間葉系幹細胞ATCC
ゼータサイザーMalvern Nano ZSMalvern Nano ZSエクソソームの特性評価に使用
滅菌マ 細胞

参考文献

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