方法論記事

CRISPR/Cas9技術を用いた渡りバッタのホモ接合変異体の構築

DOI：

10.3791/63629

⸱

2022年3月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cotton Biology, Key Laboratory of Plant Stress Biology, School of Life Sciences, Henan University, 2Research Institute of Applied Biology, Shanxi University, 3School of Life Science, Shanxi University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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この研究は、CRISPR/Cas9リボヌクレアーゼベースのホモ接合型ローカスト変異体の構築の体系的に最適化された手順と、イナゴ卵の凍結保存と蘇生のための詳細な方法を提供します。

要約

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渡りバッタである Locusta migratoriaは、人類に莫大な経済的損失をもたらした世界的なペストバッタの1つであるだけでなく、昆虫の変態の重要な研究モデルでもあります。CRISPR/Cas9システムは、特定のDNA遺伝子座を正確に特定し、標的部位内で切断し、二本鎖切断を効率的に導入して標的遺伝子ノックアウトを誘導したり、新しい遺伝子断片を特定の遺伝子座に組み込んだりすることができます。CRISPR/Cas9を介したゲノム編集は、イナゴの研究で遭遇する問題に対処するための強力なツールであり、バッタ防除のための有望な技術です。この研究は、移動性バッタにおけるCas9タンパク質とシングルガイドRNA(sgRNA)の複合体を使用したCRISPR/Cas9を介した遺伝子ノックアウトの系統的プロトコルを提供します。標的部位の選択とsgRNAの設計について詳細に説明し、その後、 in vitro 合成とsgRNAの検証を行います。その後の手順には、卵いかだの収集と日焼け卵の分離が含まれ、死亡率の低いマイクロインジェクションの成功、卵の培養、突然変異率の予備推定、イナゴの繁殖、および編集されたイナゴの個体群の安定性を確保するための突然変異体の検出、保存、および通過が含まれます。この方法は、渡りバッタや他の昆虫におけるCRISPR/Cas9ベースの遺伝子編集アプリケーションのリファレンスとして使用できます。

概要

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遺伝子編集技術を使用して、特定のゲノム遺伝子座に挿入または欠失を導入し、目的1で標的遺伝子を人為的に改変することができます。過去数年間で、CRISPR / Cas9技術は急速に発展し、ライフサイエンスのさまざまな分野での適用範囲を拡大しています2,3,4,5,6。CRISPR / Cas9システムは1987年に発見され7、細菌や古細菌に広く見られます。さらなる研究は、ファージ8と戦うためにRNA誘導ヌクレアーゼCas9に依存する原核生物の適応免疫系であることを示しました。人工的に改変されたCRISPR/Cas9システムは、主に単一のガイドRNA(sgRNA)とCas9タンパク質の2つのコンポーネントで構成されています。sgRNAは、標的配列に相補的なCRISPR RNA(crRNA)と、比較的保存されている補助トランス活性化crRNA(tracrRNA)で構成されています。CRISPR/Cas9システムが活性化されると、sgRNAはCas9タンパク質とリボ核タンパク質....

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プロトコル

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1. ターゲット部位の選択とsgRNAの設計

  1. NCBIおよびイナゴデータベース24で文献調査および/または遺伝子のmRNAまたはコーディングDNA配列(CDS)の検索を通じて、目的の遺伝子について可能な限り多くの配列情報を収集します。
  2. 関心のある遺伝子の配列をそのゲノムDNA配列と比較して、エクソン領域とイントロン領域を区別します。
  3. 研究目的に応じて、対象地設計の候補地域を選定します。プライマーペアを設計して候補領域フラグメントを増幅し、PCR産物のシーケンシング解析によってその野生型配列を検証します。
    注:候補ターゲットリージョンの選択にはさまざまな戦略があります。例えば、ほとんどの遺伝子/タンパク質機能研究では、ゲノム編集(すなわち、遺伝子ノックアウト)後にタンパク質/RNA機能全体が失われるように、開始コドンに近いエクソン断片を候補領域として使用します。特定のドメインの関数解析では、ドメインの先頭(または両端)の候補領域を選択します。
  4. E-CRISP Design25 などのオンラインリソースを使用して、ターゲット候補地域の潜在的なターゲットサイトを検索します。
    1. 参照ゲノムのドロップダウンリストで「ショウジョウバエメラノガスターBDGP6」(またはその他の昆虫)を選択し、「入力はFASTA配列」を選....

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結果

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このプロトコルには、Cas9タンパク質と in vitro で合成されたsgRNAからなるRNPを持つ移動性イナゴのホモ接合変異体を生成するための詳細な手順が含まれています。以下は、標的選択、sgRNA合成と検証(図1A)、採卵と注射、変異体スクリーニングと継代、凍結保存、ホモ接合卵の蘇生など、イナゴにおけるCRISPR/Cas9を介した標的遺伝子ノックアウトの代表的な結果です。

本研究では、3つのオンラインプログラム(E-CRISP、CRISPOR、およびZiFit)の結果に従って、CRISPR/Cas9システムのターゲットサイトを選択し、最初のエクソンに配置します(図1B)。 in vitro でのCas9切断アッセイ(表1)によると、CRISPR/Cas9 RNPはPCRフラグメント(標的部位を含む)を約55%の切断率で消化することができました(図.......

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ディスカッション

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イナゴは、人間の文明以来、農業にとって最も壊滅的な害虫の1つです23。CRISPR/Cas9ベースのゲノム編集技術は、バッタの生物学的メカニズムに関するより良い知識と有望な害虫駆除戦略を提供するための強力なツールです。したがって、ホモ接合型ローカスト変異体のCRISPR/Cas9を介した構築の効率的で使いやすい方法を開発することは大きな利益です。いくつかの素晴らしい研究が報告され、バッタのゲノム編集のためのいくつかの基本的なワークフローが提供されましたが18,20,21,22、手順全体の体系的な最適化はまだ不足しています。一般に、CRISPR / Cas9システムの胚注入によって生成されたホモ接合型イナゴ変異体は、3つの主要なステップに分けることができます:a)in vitroでのsgRNAの設計、合成、およびスクリー.......

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開示事項

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著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

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この研究は、中国国家自然科学財団(32070502、31601697、32072419および中国ポスドク科学基金会(2020M672205)の支援を受けました。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10回;NEBuffer r3.1New England BiolabsB7030Sのバッファ  in vitro Cas9切断アッセイ
2xEs Taq MasterMix (Dye)CwbioCW0690遺伝子増幅用
2xPfu MasterMix (Dye)CwbioCW0686遺伝子増幅用
CHOPCHOPsgRNAsを設計するためのオンラインウェブサイト、http://chopchop.cbu.uib.no/.
CRISPORsgRNAを設計するためのオンラインウェブサイト、http://crispor.org.
CRISPRdirectsgRNAを設計するためのオンラインウェブサイト、http://crispr.dbcls.jp/.
電気泳動電源LIUYI BIOLOGYDYY-6D異なるサイズの核酸分子の分離
エッペンドルフチューブエッペンドルフ30125177サンプル収集などに。
細かいブラシAnnigoni1235の洗浄と隔離用。オンラインで購入しました。
フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラーサッターインストゥルメントP97マイクロインジェクション針作成用
ゲル抽出キットCwbioCW2302DNA回収・精製
ゲルイメージング解析システムOLYMPUSGel Doc XR電気泳動結果の観察
GeneTouch PlusBioerB-48DA遺伝子増幅用
ガラス電極キャピラリーガードナーGD-102製作用 注射針付き a マイクロピペット プーラー
インキュベーターMEMMERTINplus55渡りバッタ胚培養用
メタルバスTIANGENAJ-800サンプル加熱用
マイクロオートインジェクターエッペンドルフ5253000068開発初期の胚のマイクロインジェクション
マイクロ遠心分離機AllshengMTV-1試薬の混合に使用
マイクログラインダーナリシゲEG-401注射針の先端を接地する
マイクロローダー エッペンドルフ5242956003注射針に溶液を装填します。
マイクロマニピュレーションシステムEppendorfTransferMan 4rマイクロインジェクション用アルチネーションマニピュレーションシステム
顕微鏡cnoptecSZ780マイクロインジェクション用
モータードライブマニピュレーターナリシゲMM-94マイクロインジェクション先行時のマイクロピペットの位置制御用
マルチサンプルティッシュグラインダーjingxinTissuelyser-64卵を挽いて均質化
卵ポットChangShengYuanYiCS-11イナゴの産卵のための湿った滅菌砂で満たされています。オーシストはこの容器から採取されます。オンラインで購入しました。
パラフィルムパラフィルムMPM996シャーレのラッピングに。
pEASY-T3クローニングキットTransGen BiotechCT301-01TAクローニング用
ペトリ皿NEST752001卵子の培養と保存用。
ピペッター・エッペンドルフ・リサーチ・プラスサンプルローディング用
プラスチック培養カップイナゴを別々に飼育し、十分な大きさ(容量1000mL以上)のプラスチックカップであれば何でも構いません。
精密gRNA合成キットThermoA29377for sgRNA合成
Primer PremierPREMIER BiosoftPrimer Premier 5.00プライマーデザイン用
SnapGeneInsightful ScienceSnapGene®4.2.4分析用  シーケンス
鋼球HuaXinGangQiuHXGQ60サンプル研削用。オンラインで購入しました。
ヒントバイオリーフD781349サンプルローディング用
Trans DNA マーカー IITransGen BiotechBM411-01遺伝子サイズの決定に使用
TrueCut Cas9 タンパク質 v2サーモA36496Cas9 タンパク質
UniversalGen DNA キットCwbioCWY004ゲノムDNA抽出用
VANNAS はさみ電子顕微鏡科学72932-01触角を切断するための
小麦イナゴの餌として小麦の苗を生成します。地元の農家から購入
ZiFiTのウェブサイト sgRNAを設計するため、http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx.
卵します 卵。オンライン

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doudna, J. A. The promise and challenge of therapeutic genome editing. Nature. 578 (7794), 229-236 (2020).
  2. van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, O. J., Murthy, N., Schaffer, D. V. The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing. Nature Biotechn....

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タグ

sgRNA

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