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方法論記事

マイヤー・ロキタンスキー・クスター・ハウザー症候群の治療のための膣形成術中の腹腔鏡下卵母細胞回収と凍結保存

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DOI：

10.3791/63634

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2022年5月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Obstetrics and Gynaecology Unit, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 2Vita-Salute San Raffaele University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Fondazione IRCCS Ca' Granda, Ospedale Maggiore Policlinico

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

専任チームは、メイヤー・ロキタンスキー・クスター・ハウザー患者に、腹腔鏡下膣形成術時に制御された卵巣刺激と卵母細胞の凍結保存を行うオプションを提供できます。

要約

腹腔鏡下膣形成術を予定しており、生物学的母性を希望するメイヤー・ロキタンスキー・クスター・ハウザー症候群(MRKHS)患者において、凍結保存のために腹腔鏡下卵母細胞回収を併用することを提案する。卵母細胞回収は腹腔鏡検査の開始時に追求される。左右の5mmのトロカールを配置し、それを通して17Gの卵子吸引針を使用してそれぞれ右卵巣と左卵巣の穿刺を行います。卵胞の露出を容易にするために、卵巣を動員し、腹腔鏡下鉗子で保持する。

複数の卵胞を互いに近く吸引する場合、卵巣皮質がトランスフィックスされる回数を減らすために針先が卵巣に保持され、出血の固有のリスクがあります。その後のステップは、膣形成術のためのDavydov腹腔鏡下修正技術と比較して変更されていません。手術前に、ゴナドトロピンホルモン放出ホルモン(Gn-RH)アンタゴニストプロトコルを使用して制御された卵巣刺激が行われ、卵母細胞回収と膣形成術の付随する手順は、最終的な卵胞成熟トリガーの36時間後に予定されています。卵胞液は、経膣卵母細胞回収時に使用されるのと同じ10 mL滅菌チューブに収集され、加温ブロック(37°C)で生殖補助医療検査室に移され、そこで成熟(中期II)卵母細胞がガラス化されます。

この場合、MRKHの一連の23人の女性、卵母細胞が正常に回収され、すべての患者で凍結保存されました。その後,膣形成術はそのまま施行し,術後入院・外来診療(尿道カテーテル抜去日,退院日,拡張器使用,経過観察時の快適性)は影響を受けなかった.術後合併症は1例(術後5日目に発熱,経腹腔超音波で腹腔内液検出)を合併し,保存的治療後に消失した.このアプローチは、MRKH患者の外科的膣形成術を行い、卵母細胞回収を遅らせるのではなく、両方の手順を1回の腹腔鏡検査に組み合わせることで、外科的侵襲性と麻酔リスクを最小限に抑えます。

概要

4〜10,000人の女性に約1人の発生率で、MRKHSは原発性無月経症例の15%の原因です。MRKHSは、膣および子宮の上部部分の先天性欠如によって特徴付けられるが、尿路および骨格異常はさまざまに関連している。より具体的には、通常、深さ1〜2 cmの膣金庫が存在し、2つの初歩的な子宮角が見つかることがあります1。

過去には、MRKHSの主な医学的関心は正常な性交を可能にすることであり、それは一般的に非外科的または外科的アプローチのいずれかによって新膣を構築することを必要とする2。しかし、生殖医学の進歩により、現在、代理出産3,4または最近では子宮移植5のいずれかによって、MRKHS患者の遺伝的母性が可能になりました。子宮移植はまだ実験的な手順ですが、代理出産は世界中の多くの国で利用可能であり6、報告されている産科および心理社会的結果は、標準的な体外受精および卵母細胞提供の結果に匹敵します7。

代理出産と子宮移植はどちらも卵母細胞回収と体外受精を必要としますが、MRKHS患者の採卵方法に関するコンセンサスは存在しません。経膣的アプローチは、膣形成術後でも不十分な膣弾力性8、卵巣の非定型位置9、または卵巣と膣カフ4,10の間の過度の距離のために実行不可能な場合があります。これらの場合、腹腔鏡下卵母細胞回収は、外科的アクセスの観点から最適なアプローチを表しています。しかし、現在、ほとんどのMRKHS患者が腹腔鏡下新膣形成術を受けているため、膣形成術11の手術時に腹腔鏡下卵母細胞回収を行い、その後、将来の使用のために卵母細胞凍結保存を行い、MRKHS患者の有性生殖機能の治療を組み合わせながら侵襲性を最小限に抑えることをお勧めします。

患者の人口統計データ
これまでに23人のMRKH患者がこのプロトコルによる治療を受けました。患者の既往歴、機器、および検査所見を 表1に要約します。. 表1で指定されていない限り、関連する先天異常は見つかりませんでした。

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プロトコル

MRKHSの三次紹介センター(IRCCSサンラッファエーレ大学病院、イタリア、ミラノ)の地元の倫理委員会は、2017年7月に実施される前にプロトコルに通知され、承認されました。すべての患者または保護者は、膣形成術中の腹腔鏡下卵母細胞回収と凍結保存、および科学的目的での匿名化された臨床/検査データの使用について、署名されたインフォームドコンセントを与えました。

1.チーム構成

  1. 経験豊富な腹腔鏡外科医、経験豊富な膣外科医、不妊症の専門家、専任の心理学者、献身的な看護師で構成される専任チームを指定します。
  2. 手順のセットアップと実行全体を通して、チームとして患者を支援します。

2.診断精密検査とカウンセリング

  1. 卵巣の視覚化と胞状卵胞数(AFC)の推定のために、患者に経腹骨盤および腹部超音波検査を実行します。抗ミュラー管ホルモン(AMH)の血中濃度を評価して、制御された卵巣刺激のためのゴナドトロピン開始用量を最適化します。組織/配偶子の凍結保存のための国/地域のプロトコルに従って、感染症(HIV-Ab、HCV-Ab、HBV-Ab、RPR-TPHA)の血清学的検査を実施します。
  2. 非外科的および外科的膣形成術、代理出産に関連する費用と法律、実験プログラムの文脈での子宮移植の視点、卵母細胞回収に利用可能なさまざまなアプローチ、および生児率の観点からの卵母細胞凍結保存のパフォーマンスなど、MRKHSの性的側面と生殖的側面の両方について患者に助言します。
  3. 手順を通じて患者をサポートするための心理的評価を提供し、感情的な安定性とコミットメント、および将来の母性への欲求を評価します。付随する腹腔鏡下卵母細胞回収、配偶子凍結保存、および腹腔鏡下膣形成術について、署名されたインフォームドコンセントを取得します。未成年の患者の場合、親戚のインフォームドコンセントにも署名する両親の前で臨床評価を実行します。

3.外科的処置と制御された卵巣刺激のスケジューリング

  1. 付随する腹腔鏡下卵母細胞回収、配偶子凍結保存、および腹腔鏡下膣形成術の手順を、臨床チーム(上記を参照)および卵母細胞ガラス化を行うラボスタッフの可用性を考慮してスケジュールします。
  2. n = 12日のCOSの計画期間と、排卵誘発から卵母細胞回収およびガラス化までに必要な36時間を考慮して、手術日から-14日目に制御卵巣刺激(COS)を開始します。
  3. COSが予想とは異なる期間を必要とする場合は、それに応じて手術を再スケジュールしてください。

4.制御された卵巣刺激:開始用量、用量調整およびモニタリング、最終的な卵母細胞成熟誘発

  1. 生殖能力維持のための「ランダムスタート」プロトコルのコンテキストで一般的に行われるように、卵巣周期の任意の段階でCOSを開始します。
  2. 患者のAFCとAMHに基づいて卵胞刺激ホルモン(FSH)/ヒト更年期ゴナドトロピン(hMG)の開始用量を選択し、毎日自己投与された皮下注射を継続するように患者に指示します。その後、卵巣反応に基づいて個別の用量調整を実行します。.
  3. 連続経腹部超音波およびE2 およびPの同時測定(1日目、6日目、8日目、10日目、および12日目)による卵巣反応を監視する。
  4. 0.2mLのGn-RHアナログ(トリプトレリン)の皮下投与により、最終的な卵母細胞成熟を引き起こします。

5.臨床手順(腹腔鏡検査):卵母細胞回収

  1. 患者を修正された背側結石切開位置に配置することで、腹部と会陰への優れた同時アクセスが可能になります。全身麻酔を誘発し、通常の術中抗生物質予防に従って2gのセファゾリンを静脈内投与します。.膀胱内フォーリーカテーテルを配置します。
  2. 臍帯周囲ベレス針で気腹を確立し、腹腔鏡を挿入するための10mmの臍トロカール1本と左右の上象限に2本の5mmトロカールを配置します。腹腔鏡視下では、経膣的回収に一般的に使用される吸引ポンプに接続された17Gのシングルルーメン針を、左右の卵巣の穿刺のためにそれぞれ左右のトロカールを通して使用します。
  3. 卵胞の露出を容易にするために腹腔鏡下鉗子で卵巣を持ち上げて保持します。互いに近い複数の卵胞を吸引する場合は、卵巣に針先を保持して、卵巣皮質が固定される回数と出血の固有のリスクを減らします。

6.臨床手順(腹腔鏡検査):膣形成術

注:膣形成術の手順は、Davydovの腹腔鏡下修正技術12と比較して変更されていません。

  1. 腹膜を2つの初歩的な子宮角の間を横方向に持ち上げて切開し、次に切開部を前方、横方向、および後方に伸ばして腹膜を解剖します。
  2. 膀胱の上の動員された腹膜から、各半骨盤のポリジオキサノン合成吸収性(PDS)2-0モノフィラメントで、丸い靭帯、卵管峡部、子宮卵巣靭帯、および外側腹膜葉の連続した固定で巾着縫合を開始します。次に、2つの縫合糸に、直腸直腸結腸接合部の直下にある直腸漿膜の外側側面と直腸漿膜の前方側面を含めます。
  3. 会陰アプローチで膣のくぼみを露出させ、H字切開を行い、膀胱直腸腔の鋭く鈍い解剖によって新膣腔を作成します。次に、解剖した腹膜縁を膣前庭の端まで引き下げます。腹膜前庭吻合のためのPDS 3-0の縫合糸を中断した位置。最後に、腹膜コーティングされた新膣にパラフィンコーティングされたガーゼを置きます。

7.体外受精検査室:卵母細胞回収の前日

  1. 予想される卵胞の数に応じて、HEPESを含む9 mLのクインズアドバンテージ培地(5%ヒト血清アルブミン[HSA]を補給)を含む2〜5本の丸底チューブを準備し、37°Cで一晩インキュベートします。
  2. 0.5 mL/ウェルの受精培地(5%HSAを補給)を入れ、胚培養用に0.5 mLのミネラルオイルで覆った1つまたは2つの4ウェルディッシュを準備し、制御された雰囲気(6%CO2、5%O2)で37°Cで一晩インキュベートします。
  3. 6 mLのミネラルオイルで覆われた9滴(30 μL)の連続単一培養(CSCM)培地(10%血清代替サプリメント[SSS]を補充)を含む1つの皿を準備します。制御された雰囲気(6%CO2、5%O2)で37°Cで一晩インキュベートします。

8.IVF実験室:卵母細胞回収手順

  1. クインのアドバンテージ培地にHEPES(5%HSAを補給)と最終濃度10IU / mLのヘパリンを配合し、卵胞吸引液を採取します。
  2. 通常の経膣卵母細胞回収13と同様に、卵胞吸引液を10 mLの丸底チューブに集め、ポータブルインキュベーターで保温(37°C)し、すぐに発生学研究室に輸送時間約10分で輸送します。
  3. 予熱した滅菌90 mmペトリ皿で卵胞液を調べて、積雲-卵母細胞複合体(COC)を特定します。COCが検出されたら、HEPES(5%HSAを補給)を含む1 mLの予熱したクインズアドバンテージ培地で満たされた中央ウェルディッシュですすいでください。
  4. すべてのCOCが収集されたら、それらを受精培地を含む4ウェル皿に入れ、蓋と底に患者の身元に関連するデータのラベルを付けます。
  5. 制御された雰囲気(6%CO2、5%O2)で37°Cでインキュベートします。
  6. 手順の再確認が実験室スタッフの2人目のメンバーによって実行されていることを確認してください。

9.卵母細胞の露出

  1. 排卵トリガー後38時間以内に積雲/コロナ細胞の除去を実行します。
  2. クインズアドバンテージ培地にHEPES(5%HSAを補給)とヒアルロニダーゼを最終濃度10IU / mLで調製します。
  3. ヒアルロニダーゼを含むHEPES(5%HSAを補充)を含む1mLの予熱したクインズアドバンテージ培地と、1mLの予熱したHEPES緩衝培地(5%HSAを補充)を含む中央ウェルディッシュを準備します。
  4. 卵母細胞浸出皿に患者識別データでラベルを付けます。
  5. 酵素を含む中央ウェルにCOCを入れて、ガラスパスツールピペットで卵丘細胞を分散させ、COCを含む溶液を最大30秒間静かに上下にピペッティングします。
  6. 卵母細胞をHEPES緩衝培地のみを含む2番目の中央ウェルディッシュに移動し、最小限の量の酵素を置換することを確認します。
  7. 内径(170〜140μm)が減少したデービングピペットを使用して、残りのコロナ細胞を除去します。
  8. 卵母細胞の成熟段階を評価し、第1の極体の押し出しを特徴とする中期II(MII)卵母細胞を中期I卵母細胞(MI)および胚小胞(GV)から分離する。
  9. MII卵母細胞を、6 mLの鉱物油で覆われた9滴(30 μL)の連続単一培養(CSCM)培地(10%血清代替サプリメント[SSS]を補充)を含むIVF培養60 mmペトリ皿に移します。
  10. 制御された雰囲気(6%CO2、5%O2)で37°Cでインキュベートします。

10.卵母細胞ガラス化

  1. 卵母細胞の浸出直後に、ガラス化キットの製造元が提供するプロトコルに従って、MII卵母細胞のガラス化を行います。
  2. 室温(25-27°C):平衡化溶液(ES)、ガラス化保存溶液(VS)、および洗浄溶液(WS)を、手順のほぼ30分前に行います。
    注:メーカーから報告されているように、ESにはM-199HEPES緩衝培地に7.5%DMSO、7.5%エチレングリコール、20%デキストラン血清サプリメント(DSS)、ゲンタマイシンが含まれています。VSはM-199 HEPES緩衝培地中に15%DMSO、15%エチレングリコール、0.5 Mスクロース、20%DSS、ゲンタマイシンを含み、WSはM-199 HEPES緩衝培地中に20%DSS、ゲンタマイシンを含有する。
  3. クライオデバイスの場合、プラスチック製のハンドルに取り付けられた透明なフィルムの細かいストリップで構成されるCryotopを使用します。
  4. クライオデバイスに、患者の名前、生年月日、ID、凍結保存日、および単一のデバイスにロードされた卵母細胞の数をラベル付けします。
  5. ガラス化皿に患者の名前とIDのラベルを付けます。
  6. 立会い人のオペレーターがクライオデバイスとディッシュの正しい患者データをチェックしていることを確認してください。
  7. 冷却ボックスの上部まで新鮮な液体窒素を満たし、分散と蒸発を最小限に抑えるために使用するまで覆います。
  8. 内径170 μmのストリッパーピペットを使用して、操作中に卵母細胞に損傷を与えないようにします。
  9. ES、VS、およびWSの各バイアルを静かに振って内容物を混合してから使用してください。
  10. 50 μLのWS1を1滴入れた60 mmペトリ皿の蓋を準備します(図1A)。
  11. 媒体の蒸発を制限するために、使用直前に滴を置きます。
  12. インキュベーターから卵母細胞ディッシュを取り出し、最小限の培地でMII卵母細胞(一度に最大3つ)を培養皿から50 μLのWSに移します。
  13. WS2、ES1、ES2を50 μL滴分注し、液滴WS1から液滴WS2に卵母細胞を移します(図1B)。
  14. ES1のドロップをWS2にマージし、両方の溶液が自発的に混合されるまで2分間待ちます。
  15. 次に、ES2のドロップを以前にマージしたドロップにマージし、さらに2分間放置します。
  16. 最後に、ES3の新しい100 μLドロップを以前にマージしたドロップにマージし、さらに1分間放置します。
  17. 卵母細胞を100 μLのES4ドロップに10分間入れます(図1C)。
  18. 50 μL滴のVSを2滴分注し、100 μLのVSを1滴分注します(図1D)。
  19. 卵母細胞をVSの3滴に60秒間順番に移動させ、卵母細胞が各滴に~20秒間留まるようにします。
  20. 60秒のインキュベーションが終了する前に約10秒が残ったら、クライオデバイスを顕微鏡の下に置きます。
  21. ピペットの先端で卵母細胞を運び、最小量のVSでクライオデバイスに置きます。
  22. 過剰のVSを吸引し、卵母細胞をVSの薄層で覆ったままにします。
  23. クライオデバイスを液体窒素に直接突っ込み、すばやく動かします。デバイスを液体窒素に保ち、保護蓋で覆います。
  24. クライオデバイスをストレージシステム(visiotubeなど)に保管し、極低温タンクに入れます。凍結保存データをラボのデータベースとシートに記録します。

11.術後の入院治療

  1. 尿道カテーテルと膣パラフィンコーティングされたガーゼを手術の48時間後に取り外します。
  2. 除去後の患者の新膣をデジタルで探索し、デジタル探索の実行方法を患者に指示します。次に、膣型(長さ9 cm、直径2 cm)をエストロゲンゲル(上皮化を促進するため)でコーティングし、型を挿入して維持する方法を患者に指示します。
  3. 術後3日目から翌日にかけて、金型の配置方法と毎日少なくとも2時間所定の位置に維持する方法を患者に指示します。
  4. 合併症が発生しない場合は、手術後5〜6日目に患者を退院させます。

12.術後外来診療

  1. 入院中に使用したのと同じ型(長さ9 cm、直径2 cm)を使用して2か月間新膣拡張を行う方法を患者に指示し、次により大きな型(長さ11 cm、直径2.5 cm)を使用します。
  2. 3か月の訪問後、患者が性行為を開始できるようにし、性交がない日に型を使い続けるように通知します。

13. フォローアップ

  1. 手順の1、3、6、および12か月後にフォローアップ訪問をスケジュールします。
  2. 各フォローアップ訪問で、拡張運動のコンプライアンスを評価し、日常生活活動、痛み、尿路症状、または性機能障害に制限を経験したかどうかを患者に尋ねます(手術後3か月後の訪問時点)。各フォローアップ訪問で婦人科検査を実行して、付属器の膣の幅、長さ、懸濁液、および可動性を測定します。

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結果

表2には患者の卵巣刺激データが含まれていますが、主な外科的および機能的転帰は表3に記載されています。卵母細胞回収と膣形成術の付随する腹腔鏡手術は、すべての患者でうまく組み合わされました。平均11.4±5.4(平均±SD)の卵母細胞を回収し、9.6±4.3のMII卵母細胞を凍結保存しました(表3)。ARTを受けている患者における卵母細胞の凍結保存に関する私たちの経験では、このガラス化プロトコル(細胞質内精子注入時の形態学的に無傷の卵母細胞の割合として定義される)に従った温暖化後の卵母細胞の生存率は84.5±19.3でした。総平均手術時間は114±17分であり、術中出血はすべての患者でわずか(<50 mL)であり、術中の有害事象は観察されませんでした。.尿道カテーテルと膣ガーゼは、すべての患者で手術後2日目に除去されました。術後3日目に拡張器のデイリー使用を開始し,6.0日目±1.0日目に退院した.術後合併症は1例に発生しました(術後5日目に発熱し、経腹腔超音波で腹腔内液が検出されました)。患者は経口投与された抗生物質で正常に治療され...

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ディスカッション

このプロトコルは、膣形成術と卵母細胞回収の手順を組み合わせることにより、MRKHSの治療における侵襲性を軽減します。そのためには、COS、外科手術、卵母細胞ガラス化のタイミングを効率的にスケジュールするために、専任チームを任命することが重要です。

この併用腹腔鏡法が最も有益であると予想されるMRKHS患者は、骨盤壁に沿って横方向に位置する骨盤外卵巣14、または肝臓や胆嚢9などの臓器の近くに位置する骨盤外卵巣、または骨盤腎臓の存在のために、経膣回収が技術的に困難または実行不可能であると考えられる患者です。これらの患者では、経腹的アプローチが仮説を立てることができ、文献で報告されていますが、それにもかかわらず、平均数は4.92±1.7卵母細胞が収集され15、技術的な制限による最適ではない検索を示唆しています。さらに、腹壁の厚さが著しい患者や、腸16のループが上にあるために卵巣の視界が悪い患者など、...

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開示事項

著者は、開示する利益相反はありません。

謝辞

この作業に対する具体的な資金は受け取られていません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
卵子回収手順
Equipment
CO2 O2インキュベーターSanyo
キュベーターThermo Scientific
Laminar Flow HoodCooper Surgical
ポータブルインキュベータークーパー外科用
実体顕微鏡ニコン
消耗品
14 mL ポリスチレン丸底チューブファルコン352057
4ウェルディッシュNunc144444
60 mm シャーレNuncFA9150270
90 mm ペトリディッシュヌンクFA9150360
ヒト血清アルブミン 100 mg/ml 生理食塩水 (5%)Origio3001
胚培養用ミネラルオイルOrigio4008
ウェル ディッシュOosafeOOPW-CW05
クイン's Advantage 受精培地 SAGEOrigio1020
Quinn'HEPESOrigio1024
滅菌ガラスパスツールピペット
<ストロング>卵子剥離
機器
CO2 O2インキュベーター三洋
フレキシペット 調整可能ハンドルセットクックG18674
インキュベーターThermo Scientific
層流フードクーパー 外科用
実体顕微鏡ニコン
消耗品
4 ウェルディッシュNunc144444
CSCM (Continuos single culture) 培地富士フイルムアーバインサイエンティフィック90165
ヒトアルブミン100mg / mL正常生理食塩水(5%)Origio3001
アルロニダーゼフイルムアーバインサイエンティフィ90101
体外受精培養60mmペトリディッシュNuncFA9150270
胚培養用ミネラルオイルOrigio4008
ウェルディッシュOosafeOOPW-CW05
クイン'HEPESOrigio1024
Serum Substitute SupplementFujifilm irvine Scientific99193
滅菌ガラスパスツールピペット
ストリッピングピペットチップ (140 μm)クックK-FPIP-1140-10BS-5
ストリッピングピペットチップ(170μm)クックK-FPIP-1170-10BS-5
卵子ガラス固化
35 mm シャーレNUNC150255
60 mm シャーレNUNC150270
90 mm シャーレNUNC150360
冷却ラック用コンテナ北里
クライオデバイス/クライオトップ北里81111
電子タイマー
フレキシペットCOOKK- 1000
ギルソン ピペットマンギルソンF123601
ラボ プリンター LabXpertBradyXSL-86-461
ヒント 20-200 & マイクロ;LThermo Scientific2160G
Tips 2-20 µLThermo Scientific2139-HR
VisotubesCryo Bio System20
ガラス固化凍結キット富士フイルム アーバイン科学90133-SO
ガラス化融解キット富士フイルム アーバイン科学90137-SO
イン ワン付き Advantage 培地ヒ富士ックワン

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