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方法論記事

培養骨細胞における脂肪酸酸化の評価

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DOI:

10.3791/63638

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2022年4月28日

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1Department of Orthopaedic Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Research and Development Service, Baltimore Veterans Administration Medical Center

この記事について

サマリー

本プロトコルは、初代骨細胞または関連する細胞株の培養における脂肪酸酸化の能力を評価するためのアッセイを記載している。

要約

骨芽細胞の分化による骨形成には、骨組織を構成する大きな細胞外マトリックスタンパク質を合成し、その石灰化に必要なイオンを濃縮する必要があるため、大きなエネルギー投入が必要になることが予想されます。骨形成の代謝要件に関するデータは急速に出現しています。まだ解明されていないことはたくさんありますが、中間代謝の乱れが骨格疾患の一因となることが予想されます。ここでは、骨芽細胞が 14のC標識脂肪酸を 14のCO2 および酸可溶性代謝物に酸化する能力を評価するためのプロトコルを概説します。脂肪酸は、摂食後または脂肪組織貯蔵庫からの放出後に循環から取り込むことができる豊富なエネルギー貯蔵庫を表しています。このアッセイは、T-25組織培養フラスコで実施され、脂肪酸の利用に対する遺伝子の獲得または機能喪失、および骨量の維持に必要な成長因子またはモルフォゲンの形での同化シグナルの影響の研究に役立ちます。グルコースやグルタミンなどのアミノ酸の酸化を評価するためにプロトコルを適応させる能力についての詳細も提供されています。

概要

骨髄と骨膜に存在する前駆細胞に由来する骨芽細胞は、骨組織を構成する石灰化したコラーゲンに富んだマトリックスの合成と分泌に関与しています。このエネルギー的に高価な努力を実現し、骨格の完全性の生涯にわたる維持に貢献するために、これらの特殊な細胞は、細胞外マトリックスタンパク質1,2の合成に不可欠な豊富な粗い小胞体を維持し、燃料基質3,4から必要な化学エネルギーを収穫するための多数の高膜電位ミトコンドリアを維持しています.この後者の機能の重要性は、骨の成長の停止と、カロリー制限などのエネルギー不足に関連する骨減少症5,6の発症によって例証されます。骨芽細胞が好む燃料源の同一性と、分化中または同化シグナル伝達に応答した骨芽細胞の代謝要件に関するデータが浮かび上がってきています7,8。

長鎖脂肪酸は、血清中に存在し、カロリー摂取量の減少やエネルギー消費の増加に反応して脂肪組織から放出される化学エネルギーを豊富に供給します。細胞膜を横切ってコエンザイムAにライゲーションして溶解度を高めた後、脂肪酸アシルCoAは、ミトコンドリア外膜と内膜上のデュアルカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ酵素とカルニチン-アシルカルニチントランスロカーゼ7によってミトコンドリアマトリックスにシャトルされます。ミトコンドリアマトリックス内では、β酸化機械鎖がアシルCoAを短縮し、TCAサイクル(トリカルボン酸回路)と還元当量に入るアセチルCoAを生成します。動物で最も一般的な脂肪酸であるパルミチン酸(C16)の異化作用は、この経路を介して~131 ATPをもたらし、これはグルコース酸化によって生成される~38 ATPよりも大幅に多い7。

放射性標識脂質を用いた追跡研究は、骨が循環脂質のかなりの部分を占めていることを示しました9,10、一方、脂質異化作用に重要な酵素の遺伝的切除は骨芽細胞活性の低下と骨量減少につながります9,11。ここで紹介するプロトコールでは、14C標識脂肪酸を使用して、培養骨芽細胞が脂肪酸を酸化プロセスの中間ステップであるCO2または酸可溶性代謝物に完全に代謝する能力を評価します。放射能の使用は必要ですが、この方法は簡単で、投資が少なくて済み、他の放射性標識代謝物や細胞タイプの利益に適応できます。

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プロトコル

このプロトコルは、脂肪酸酸化能力の指標として[1-14C]-オレイン酸を 14CO2 に変換するものを使用します。地元の放射線安全事務所は、実験を開始する前に放射性物質の使用に関するプロトコルを承認しました。すべての放射線治療は、プレキシガラスシールドの背後で適切な個人用保護具を使用して行われました。地元の動物管理および使用委員会は、初代細胞を使用する前にプロトコルを承認しました。

1. 培養骨芽細胞における脂肪酸酸化

  1. 初代頭頭骨芽細胞12 またはMc3t3-E1のような骨芽細胞株を継代培養し、10%ウシ胎児血清、100U/mLのペニシリン、および0.1μg/mLのストレプトマイシンを含むα-MEMでT-25フラスコ(5 x 105 細胞/フラスコ)にプレートします。
    1. 実験で使用するための各処理グループ(すなわち、コントロールおよび遺伝子ノックアウトまたはビヒクルおよび薬理学的治療)の3〜4個のフラスコをシードします。各処理群について、細胞数またはタンパク質濃度に正規化するために、追加の1〜2個のフラスコを播種します。培養フラスコを加湿細胞培養インキュベーターで37°C、5% CO2でインキュベートします。
  2. フラスコがコンフルエントになるまで、細胞を2〜3日間培養します。50 μg/mLのアスコルビン酸と10 mMのβ-グリセロールリン酸( 材料表を参照)を培地に添加して、コンフルエントカルチャーを分化させ、さらに最大14日間培養を続けます。
    注:成長因子治療が計画されている場合、血清欠乏(0.5%〜1%のFBSを追加)一晩が必要です。.FBSの割合を下げると、培養物中の非放射性標識脂質の量が制限され、外因性成長因子の効果が最大限に発揮されます。ホルモンの影響をテストする場合は、木炭で除去されたFBSが使用されます。
  3. 実験の前日に、濾紙、15 mm x 30 mmのゴムスリーブストッパー、ポリプロピレン製のセンターウェル( 材料表を参照)を準備します。
    1. 1 cm x 10 cmの濾紙を扇風機の形に折り、ポリプロピレンセンターのバケツに入れます。ポリプロピレン中心のアームをゴムスリーブストッパーの中心にしっかりと押し込み、ポリプロピレン中心をT-25フラスコにしっかりと下げます。次に、フラスコをスリーブストッパーで密封します(図1)。
      注:ポリプロピレンの中心が培地と接触しないように、ポリプロピレンの中心の配置をしっかりと調整する必要がある場合があります。実験中、ポリプロピレンの中心は濾紙がラベリング媒体に触れるのをしっかりと防ぎ、 14CO2の収集を可能にします。
  4. 実験当日、リン酸緩衝生理食塩水(フラスコあたり5 μL)中の20%ウシ血清アルブミンと0.1 μCi/mLの[1-14C]-オレイン酸(0.6 μL/フラスコ)を1.5 mLの微量遠心チューブに混合することにより、[1-14C]-オレイン酸をウシ血清アルブミン(BSA)に結合させます。
    1. 次に、チューブを50 mLの円錐形チューブに入れ、37°Cで30分間静かに振とうしながらインキュベートします。オレイン酸-BSAコンジュゲート用のフラスコを1〜2個追加で調製し、ピペッティングエラーを考慮します。
  5. 組織培養フラスコから培地を取り出し、1.5 mLの新鮮な血清飢餓培地と交換します(ステップ1.2)。
  6. 各フラスコについて、5.6 μLのオレイン酸-BSA溶液(ステップ1.4)を2 μLの100 mMカルニチン溶液および1 mLの培地と組み合わせ、標識溶液を調製します。ラベリング溶液を培養フラスコに加えます。アッセイに追加された活性の合計カウントを読み取るために、余分な溶液を保持してください。
    注:標識溶液は、細胞数またはタンパク質濃度を定量することを目的とした追加のフラスコには添加されません。
  7. フラスコ内の濾紙が入ったポリプロピレン製のセンターウェルを下げ、ゴム栓でキャップします。
    注:ポリプロピレンセンターウェルが培地に接触しないことが重要です。これにより、濾紙がCO2の代わりに放射性標識脂肪酸で二次汚染されます。
  8. 細胞培養物を5% CO2で37°Cで3時間インキュベートします。
  9. 14CO2を収集するには、150 μLの1 N NaOHをポリプロピレンセンターウェルに注入して濾紙を濡らし、200 μLの1 M過塩素酸を培地に注入します。ゴム栓に針を通してNaOHと過塩素酸を注入します。
    注意: ゴム栓をフラスコから取り外さないでください。これにより、 14CO2 が逃げる可能性があります。注入を容易にするために、フラスコを直立位置に保ち、注入が完了したら培養位置に戻します。
  10. フラスコを55°Cで1時間インキュベートします。
  11. フラスコを細胞培養フードで冷却した後、フラスコを開けます。ピンセットでポリプロピレンセンターウェルから濾紙を取り出し、シンチレーションバイアル内の3〜4mLのシンチレーション液( 材料の表を参照)に入れます。
    注:100μLの過剰な標識溶液をシンチレーション液の3〜4mLに加えて、活性の総カウントを測定します。100 μLの基礎培地([1-14C]-オレイン酸なし)を3-4 mLのシンチレーション液に加えて、バックグラウンド活性を測定します。
  12. 室温で1時間または一晩インキュベートした後、シンチレーションカウンターを使用して放射能をカウント/分(cpm)で測定します( 材料の表を参照)。
  13. cpmの結果を正規化するには、各培養条件で非標識T-25フラスコからタンパク質抽出物を分離します。5 mLのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、各フラスコに1 mLのRIPA細胞溶解緩衝液を加え、細胞スクレーパーで細胞表面をこすり落とします。
    1. RIPAバッファーをピペットで微量遠心チューブに移し、19,000 x g で4°Cで20分間遠心分離します。 ピペットで上清を新しい微量遠心チューブに移し、BCAアッセイプロトコルに従ってタンパク質濃度を決定します( 材料の表を参照)。
    2. シンチレーションカウンターからの生のcpm読み取り値をタンパク質濃度で割って、生成された 14CO2 の正規化されたcpmを求めます(表1)。
  14. シンチレーションバイアル、細胞培養材料、培地、シリンジなどを廃棄するには、地域の要件に従ってください。作業面を除染し、地域の要件に従って放射能拭き取り試験を実施します。

2. 酸可溶性代謝物の収集

注:上記のステップ1.8で使用した3時間のインキュベーション期間は、細胞が取り込んだすべての[1-14C]完全オレイン酸をCO2に酸化するのに十分な時間ではない可能性があります。脂肪酸酸化経路のフラックスは、酸可溶性画分の放射能を測定することによっても評価できます。

  1. 処理した各T-25フラスコから酸性化した培地1 mLを採取し、1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
  2. 60 μL の 20% BSA と 100 μL の 16 M 過塩素酸を添加します。
  3. ボルテックスし、4°Cで一晩インキュベートします。
  4. 次に、ボルテックスし、20,000 x g で4°Cで30分間遠心分離します。
  5. シンチレーション液に上清200μLを加え、活性を測定します(ステップ1.12)。
  6. リードをタンパク質濃度または DNA 測定値に正規化します (ステップ 1.13.1)。

3. グルコース酸化またはアミノ酸酸化の測定

  1. 14個のC標識オレイン酸を14個のC標識グルコースまたは14個のC標識アミノ酸に置き換えて、これらの燃料分子の酸化を測定します。
  2. 手順1.1-1.2に従って骨芽細胞培養物を調製します。
  3. 実験を開始するには、組織培養フラスコから培地を取り出し、1.5 mLの新鮮な血清飢餓培地と交換します。
  4. 1 mLの飢餓培地に0.6 μCiの 14C標識グルコースまたは 14C標識アミノ酸の標識溶液を調製し、フラスコに加えます。
  5. 手順1.6〜1.13を実行します。

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結果

ミトコンドリアの長鎖脂肪酸酸化には、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ-1(Cpt1)とカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ-2(Cpt2)の両方の酵素活性が必要です。Cpt1は代謝経路の律速酵素であるが、哺乳類のゲノムには3つのアイソフォーム(Cpt-1a、Cpt-1b、Cpt-1c)がコードされており、1つのアイソフォームの遺伝的破壊は、別のアイソフォーム13の補償アップレギュレーションにつながる可能性がある。対照的に、Cpt2は単一の遺伝子によってコードされています。図2Aに示す実験では、Cpt2の遺伝的切除により、[1-14C]-オレイン酸の14CO2への酸化が~60%減少し、7日間分化した初代マウス頭蓋骨芽細胞の培養物の対照と比較して、酸可溶性代謝物の標識が~27%減少します。変異体骨芽細胞においてオレイン酸をCO2に酸化する残りの能力は、ペルオキシソーム酸化またはω酸化によるものと予想される。変異細胞における酸可溶性代謝物...

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ディスカッション

上記の手順では、測定された出力がNaOHに浸した濾紙に収集された14CO2と、過塩素酸による培養物の酸性化後に収集された酸可溶性代謝物であるため、脂肪酸酸化の直接評価が可能になります。蛍光標識された脂質分子または脂質類似体を使用する市販のアッセイキットは、脂質の取り込みを測定できますが、エネルギー生成の異化作用を決定するものではありません。13C-代謝フラックス14のような他の異化作用の尺度は、特殊な分析装置を必要とする。このアッセイは感度が高く、14CO2のレベルのみが必要な場合、1日で完了できるため、比較的迅速です(図2)。あるいは、濾紙をシンチレーション液中で一晩インキュベートし、両方の結果の決定が望ましい場合は、酸可溶性代謝物として同時に読み取ることができます。ネガティブコントロールが必要な場合、研究者はカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ-1...

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開示事項

著者は、競合する利益を宣言しません。

謝辞

この研究は、退役軍人省研究開発局の生物医学研究所研究開発サービス(BX003724)からのメリットレビュー賞と、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(DK099134)からの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
[1-14C]-オレイン酸パーキンエルマーNEC317050UC
15 x 30 mm ゴムスリーブストッパーVWR89097-542
1 mL シリンジBD 精密309628
25 G 針 (25 G x 1 1/2 インチ)BD 精密305127
アスコルビン酸Σ AldrichA4403
BCAプロテインアッセイキットサーモフィッシャー23225他のキットも適しています
ベックマンシンチレーションカウンター、または同等のベックマンコールターLS6000SC
ベータグリセロールリン酸Sigma AldrichG6626
ウシ血清 アルブミンSigma Aldrich126609
CarnitineSigma AldrichC0283
細胞溶解バッファープロトコルは、典型的な溶解バッファー(すなわちRIPA)に適しています
解剖鉗子複数のソースから入手可能
DNA定量キット複数のソースから入手可能
Dulbecco'リン酸緩衝生理食塩水コーニング20-030-CV
ウシ胎児血清複数のソースから入手可能
微量遠心チューブ、1.5 mL複数のソースから入手可能
最小エッセンシャル媒体、アルファ修飾コーニング10-022-CV
ペニシリン-ストレプトマイシンギブコ15140122
過塩素酸Sigma Aldrich50439
ポリプロピレン センター ウェルVWR72760-048
水酸化ナトリウムSigma AldrichS5881
T-25 傾斜ネック組織培養フラスココーニング430639
組織培養インキュベーター
トリプシン (0.25%) - EDTAGibco25200056
ウルティマゴールド(シンチレーション溶液)パーキンエルマー6013329
ワットマンクロマトグラフィーペーパーシグマアルドリッチWHA3030917

参考文献

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