ここでのプロトコルは、擬似瞳孔現象と視細胞の瞳孔機構を用いて、自動装置によってマッピングされたイエバエの目の視覚軸の空間的組織化の測定を記述する。
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この記事について
サマリー
要約
本稿では、昆虫複眼の視覚軸の空間的組織化の自動測定について述べるが、これはオンマチディアと呼ばれる数千の視覚単位からなる。各オンマチジウムは、視軸を中心とするおおよそのガウス分布感度(1°程度の半値幅)で、小さな立体角から光学情報をサンプリングします。一緒に、ommatidiaはほぼパノラマの視野から視覚情報を収集します。したがって、視覚軸の空間分布は、目の空間分解能を決定する。複眼の光学的組織化とその視力に関する知識は、視覚情報の神経処理の定量的研究にとって極めて重要である。ここでは、内在的な 生体内 光学現象、疑似瞳孔、および視細胞の瞳孔機構を使用して、複眼の視覚軸をマッピングするための自動化された手順を提示する。昆虫の目をスキャンするための光力学的セットアップを概説し、イエバエ、 Musca domesticaから得られた実験結果を使用して、測定手順のステップを説明します。
概要
昆虫の視覚システムのコンパクトさとその所有者の敏捷性は、高度に発達した視覚情報処理を実証し、科学的背景と非科学的背景の両方から人々を魅了してきました。昆虫複眼は、急性で汎用性の高い視覚能力を可能にする強力な光学デバイスとして認識されています1,2。例えば、ハエは動く物体に対する反応が速いことでよく知られており、ミツバチは色覚と偏光視力を持つことで有名です2。
節足動物の複眼は、解剖学的に類似した多数の単位、オマチジアで構成され、それぞれがファセットレンズによってキャップされている。双翅目(ハエ)では、角膜として総称されるファセットレンズの集合体は、しばしば半球に近似する。各オンマチジウムサンプルは、半値幅が1°程度の小さな立体角から光を入射します。2つの目のオンマチディアは、ほぼ完全な立体角をサンプリングしますが、オンマチディアの視覚軸は均等に分布していません。特定の目の領域は視覚軸の密度が高く、口語的に中心窩と呼ばれる高い空間的鋭敏さの領域を作り出します。次に、眼の残りの部分は、より粗い空間分解能3,4,5,6,7,8,9を有する。
複眼の光学的組織化の定量的分析は、視覚情報の神経処理の詳細な研究にとって極めて重要である。昆虫の脳10のニューラルネットワークの研究は、しばしばオマチジウム軸の空間分布の知識を必要とする。さらに、複眼はいくつかの技術革新に影響を与えました。バイオにインスパイアされた人工眼を製造するための多くのイニシアチブは、実際の複眼の既存の定量的研究に基づいて構築されています11,12,13。例えば、高空間分解能の半導体ベースのセンサは、昆虫複眼11,14,15,16,17のモデルに基づいて設計されました。しかし、これまでに開発された装置は、既存の昆虫の目の特徴を実際に実装していない。昆虫の複眼とその空間的構成を正確に表現するには、自然の目からの詳細で信頼性の高いデータが必要ですが、これは広くは利用できません。
データの不足の主な理由は、目の空間特性をチャート化するための利用可能な手順の極端な退屈さです。これにより、より自動化されたアイマッピング手順を確立しようとする試みが動機付けられました。昆虫の複眼の自動分析の最初の試みで、DouglassとWehling18 は角膜のファセットサイズをマッピングするためのスキャン手順を開発し、いくつかのハエ種でその実現可能性を実証しました。ここでは、角膜のファセットをスキャンするだけでなく、ファセットが属するオマチディアの視覚軸を評価する方法を開発することによって、彼らのアプローチを拡張します。私たちは、関連する手順を例示するためにイエバエの目の例を提示します。
昆虫の目をスキャンするための実験セットアップは、部分的に光学的、すなわち、カメラおよび照明光学系を備えた顕微鏡である。部分的に機械的、すなわち、調査された昆虫を回転させるためのゴニオメータシステム;部分的に計算された、すなわち、測定および分析を実行するための機器およびプログラム用のソフトウェアドライバの使用。開発された手法は、画像のキャプチャ、カメラチャンネルの選択、画像処理のしきい値の設定から、凸面から反射された光の輝点 を介した 個々のファセット位置の認識まで、さまざまな計算手順を網羅しています。フーリエ変換法は、個々のファセットの検出とファセットパターンの解析の両方において、画像解析において極めて重要であった。
論文の構成は以下の通りです。まず、実験セットアップと疑似瞳孔現象、すなわち生きた目の光受容体の視覚軸を識別するために使用される光学マーカーを紹介する19,20,21.続いて、スキャン手順と画像解析で使用されるアルゴリズムの概要を説明します。
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プロトコル
プロトコルは、大学の昆虫ケアガイドラインに準拠しています。
1.イエバエ、ムスカドメカの準備
- 実験室で飼育された人口からハエを集める。フライを真鍮ホルダーに入れます(図1)。
- 拘束チューブの上部から6 mm切ります(材料表を参照)。チューブの新しい上部の外径は4mm、内径は2.5mmです(図1A)。生きたフライをチューブの中に置き、フライを傷つけないようにチューブを綿で密封し、頭がチューブから突き出して体が拘束されるようにフライを押します(図1B)。目が覆われていないままになるように、ミツロウで頭を固定します(図1C-E)。
- チューブの長さが10mmになるようにチューブをもう一度切断します(図1C)。フライの入ったプラスチックチューブを真鍮ホルダーに置き、ホルダーが卓上に置かれているときにフライの片目が上を向くようにします(図1D、E)。
- ゴニオメーターの仰角を0°にすると(すなわち、方位角ステージが水平位置にある)、顕微鏡の垂直照明ビームが中央領域、腹側と背側の間、および眼の前縁と後縁の間において眼の表面に垂直になるようにチューブの向きを調整し、セットアップによって許容される方位角および仰角の範囲内で眼全体をスキャンすることができる。
2. ゴニオメーターの回転方位軸と顕微鏡の光軸のアライメント
- アライメントピンを方位角回転ステージに取り付けて、先端のx-y位置が電動ステージの方位軸と一致するように調整できるようにします。5倍対物レンズを備えた顕微鏡で見ながら、z軸ジョイスティックを使用して先端に焦点を合わせます(図2)。
- X軸とY軸のジョイスティックを使用して、方位角軸のx-y調整を顕微鏡の光軸に合わせ、仰角と方位角の回転軸が中央のピンにあらかじめ揃っていることを確認します。
- 方位角ジョイスティックと仰角ジョイスティックを操作して、ピンが両方の自由度に対して中央にあるかどうかを確認します。ピン先を十分に中央に配置すると、方位角と仰角の回転中は、ピン先端はほぼ同じ位置にとどまります。
3. フライアイと電動ステージのアライメント
- 仰角ステージを0°にして、フライとそのホルダーを方位角ステージに取り付けます。顕微鏡でハエの目を観察します。
- 照明LEDを点灯させた状態で、擬似瞳孔の中心が顕微鏡に揃うようにフライの水平位置を調整します。ホルダーの回転スクリュー(図1D)を使用してフライの垂直位置を調整し、深い擬似瞳孔(DPP;図3)19、20、21 は標高軸のレベルでフォーカスが当てられます。
- DPP を視野の中央に配置して、方位角軸と仰角軸に対して DPP を合わせます ( 図 2 参照)。フライホルダーの底部に接着された磁石を使用して、方位角ステージに取り付けられた鉄板にしっかりと固定し、手動でスライド調整することができます。
- 顕微鏡に装着したデジタルカメラに視点を切り替えます。GRACEシステムのソフトウェア初期化を実行します。これには、モータコントローラとArduinoのLEDコントローラの初期化が含まれます(図4)。したがって、MATLAB R2020a以上のバージョンを開きます。MATLAB スクリプト をInitialize_All_Systems 実行します (補足ファイル 1)。
- ハエの擬似瞳孔(図3B、C)がコンピュータ画面に投影された画像の中心にあるかどうかを確認します。
4. オートフォーカスとオートセンタリング
- 角膜偽瞳孔のレベルに焦点を合わせる (CPP;図3B) 19,20,21 Z軸ジョイスティックを使用して手動で。
- オートフォーカスアルゴリズム(補足ファイル1、スクリプトAF)を実行して、角膜レベルで鮮明な画像を取得します。電動Z軸段を調整して、焦点をDPPレベルに戻して確認します。DPP と CPP の間の距離を (モーター ステップ単位で) 格納します。
- オートセンタリングアルゴリズム(補足ファイル1、スクリプトAC)を実行して、疑似瞳孔センタリングを微調整します。フォーカスを CPP レベルに戻します。
- オートフォーカスアルゴリズムを再実行します。電動ステージを現在の位置 (X,Y,Z,E,A) = (0,0,0,0,0,0) でゼロにします (E は標高、A は方位角)。
- スキャンアルゴリズム(補足ファイル1、スクリプトScan_Begin)を実行し、オートセンタリングアルゴリズムとオートフォーカスアルゴリズムを実行しながら、軌道に沿って目の画像を5°ステップでサンプリングします。
- サンプリングが終了したら、LEDコントローラとモータコントローラの電源を切ります。
- 画像処理アルゴリズム (補足ファイル 1、スクリプト ImProcFacets) を適用して画像を処理します。
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結果
動物と光刺激
実験は、フローニンゲン大学の進化遺伝学部によって維持されている培養物から得られたイエバエ(Musca domestica)に対して行われる。測定の前に、ハエは、よくフィットするチューブ内の低融点ワックスで接着することによって固定化される。フライはその後、電動ゴニオメーターのステージに取り付けられます。2つの回転ステージの中心は、顕微鏡セットアップ24の焦点と一致する。落射照明光ビームは、ハーフミラー を介して フライの目で撮像されるダイアフラムに光を集光する光源によって供給される。したがって、それは、制限された光受容体細胞のセットの瞳孔機構を活性化する(図3)。これらの感光体を保有するオンマチディアの光軸は、ハエを小さなステップで回転させ、各ステップの後に顕微鏡にカラーデジタルカメラを取り付けて写真を撮ることによって評価されます(図2)。瞳孔色素顆粒は主に長波長域で反射するため、デジ...
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ディスカッション
イエバエの目の視覚軸の空間分布は、複眼の擬似瞳孔現象と光依存の瞳孔機構による反射変化を用いてチャート化することができる。したがって、調査されたハエはゴニオメトリックシステムに取り付けられ、デジタルカメラを備えた顕微鏡セットアップで局所的なファセットパターンを検査することができ、すべてコンピュータの制御下で行われる。画像解析により、アイマップが生成されます。遭遇する本質的な困難は、測定の開始時に眼を慎重に位置決めしなければ、ゴニオメトリック装置の小さな回転であっても、眼と疑似瞳孔の両方の視認位置がかなり変化する可能性があることである。これらの変化は、深い疑似瞳孔が観察されるゴニオメトリック回転中心に眼中心を配置することによって最小限に抑えられる。その後に測定された画像を相関させることによって、ファセットパターンを追跡することができる。重要なのは、ファセットパターンが非常に規則的な領域では、相関手順が誤った結果になりやすいため、回転角度をかなり小さな値に調整する必要があることです。
ここでは、昆虫の目における視力の高度に自動化されたマッピングの実現可能性を示す部分的なアイマップ(
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開示事項
著者らには報告すべき利益相反はありません。
謝辞
この研究は、空軍科学研究局/欧州航空宇宙研究開発局AFOSR/EOARD(助成金FA9550-15-1-0068、D.G.S.)の財政的支援を受けた。多くの有益な議論をしてくれたプリモシュ・ピリ博士、そしてケハン・サトゥ、ハイン・リールトゥーワー、オスカー・リンコン・カルデーニョの支援に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| デジタルカメラ | PointGrey | BFLY-U3-23S6C-C | PCによる増幅画像とデジタル通信の取得 |
| 高出力スターLED | Velleman | LH3WW | 観察とイメージングのための光源 |
| 調査されたフライのための複眼ホルダー | フローニンゲン | 大学のワークショップでは、さまざまなデザインが製造されました | |
| リニアモーター | エレロ | エレロジュニア 1、バージョンC | 上部顕微鏡を上下に作動させます。(負荷300N、ストローク速度15mm/s、公称電流1.2A) |
| 低温融解ワックス | 様々な | 低温融点ワックスは、ハエを固定し、ホルダーに固定 | |
| 顕微鏡 | ツァイス | 任意の代替顕微鏡ブランドは、好ましい目的は、フロー | |
| ニンゲン | Z-o1 | によって設計され、構築され、ArduinoとAdafruitの技術に基づいています。 | |
| 電動ステージ | スタンダ (リトアニア、ビリニュス) | 8MT175-50XYZ-8MR191-28 | 5 自由度を持つように改造された 6 軸電動ステージ。 |
| 光学部品 | LINUS | 落射照明システムを形成するいくつかの図とレンズ (Stavenga, Journal of Experimental Biology 205, 1077-1085, 2002を参照) | |
| MATLAB | フローニンゲン | を実行しているPC PCは、PointGreyカメラの画像を処理し、LED強度を制御し、システムのモーターコトローラーに制御コマンドを送信することができます | |
| 電源(36V、 3.34A) | Standa(リトアニア、ビリニュス) | PUP120-17 | STANDAモーターコントローラー専用電源 |
| んだごて | 各種 | ワックスを溶かすために使用 | |
| ステッパーとDCモーターコントローラー | Standa(リトアニア、ビリニュス) | 8SMC4-USB-B9-B9 | MATLABと通信できるSTANDA電動ステージ専用コントローラー |
| Finntip-61 | Finnpipette Ky, Helsinki | FINNTIP-61、200-1000μL | ピペット用ピペットチップ、400個/箱。ハエの |
| カービングペンのシェーピング/スレッドバーニングツール | マックスワックス | カービングペンの先端は、ハエ | |
| のMATLAB | Mathworks、Natick、MA、 | USAのメインプログラムに加えて、画像取得、画像解析、および機器制御ツールボックス。 | アルゴリズムの実装に使用されるプログラミング言語 |
参考文献
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