原発性骨腫瘍および骨転移細胞株に対する5-アミノレブリン酸媒介光線力学療法

サマリー

このプロトコルは、骨転移細胞株と原発性骨腫瘍を5-アミノレブリン酸媒介光線力学療法(PDT)にさらす段階的な方法論的アプローチを示しています。細胞遊走の可能性/浸潤性、生存率、アポトーシス、および老化の可能性への影響も、PDT曝露後に分析されます。

要約

骨転移は、罹患した患者の予後不良と生活の質の低下と関連しています。光線力学療法(PDT)は、局所転移性骨病変を標的とすることができる非侵襲的療法として浮上しています。この論文では、接着細胞株におけるPDT効果を研究する ためのin vitro 法を紹介します。この目的のために、原発性 (巨細胞骨腫瘍) とヒト骨転移性癌細胞株 (原発性浸潤性乳管癌および腎癌に由来) の両方を 5-アミノレブリン酸 (5-ALA) 媒介 PDT に対象とする段階的なアプローチを示します。

5-ALA-PDT照射(青色光波長436nm)の24時間後、治療効果を細胞遊走能、生存率、アポトーシス機能、および細胞増殖停止(老化)の観点から評価しました。5-ALA-PDT照射後、筋骨格由来の細胞株は、同じ用量とPDTの曝露に対して異なる反応を示します。PDT曝露によって引き起こされた細胞損傷の程度に応じて、2つの異なる細胞運命-アポトーシスと老化が認められました。異なる骨がん細胞株間でPDT療法に対する感度が異なるため、臨床現場でより適切なPDT設定を選択するための有用な情報が得られます。このプロトコルは、筋骨格系腫瘍性細胞株の文脈におけるPDTの使用を例示するように設計されています。これは、さまざまながん細胞株やさまざまな光増感剤、光源に対するPDTの治療効果を調べるために調整することができます。

概要

骨転移の治療選択肢は、腫瘍治療の継続的な開発にもかかわらず、依然として限られており、困難です。現在の標準的な方法は放射線療法であり、局所紅斑、内臓への毒性¹、不十分な骨折²などの合併症に関連しています。骨転移のある患者は、痛み、高カルシウム血症、神経学的症状に苦しむことが多く、運動障害や生活の質の低下をもたらすため、代替の抗腫瘍療法が必要です³。最近の知見は、PDTが骨病変を直接標的とするための有望な代替抗腫瘍薬治療オプションを提供し、単独でまたは放射線療法に支持的に使用できることを示しています⁴。

PDTのメカニズムは、基本的に、光励起された感光性化合物(光増感剤)から組織酸素へのエネルギー移動に基づいています。この光増感剤は、ナノスケールレベルでコンデンサと同様に機能します。適切な波長の光を照射すると基底状態でエネルギーを蓄えることができ、励起状態から元の基底状態に戻ると蓄積されたエネルギーを放出します⁵。放出されたエネルギーは、水素や電子を移動させることで酸素が活性酸素ラジカルに変化するという2つの光化学反応を引き起こします。第2は、光増感剤基質から局所的な三重項酸素....

プロトコル

腎細胞がんの骨転移に由来する細胞株「MAM」、浸潤性乳管がんの骨転移巣である「MAC」、骨の巨大細胞腫瘍である「17-1012」の3種類の細胞株を用いた。骨髄由来の間葉系幹細胞(MSC)を対照群として使用した。研究開始前に、機関および倫理的承認が取得されています (プロジェクト番号: 008/2014BO2-がん細胞株用、プロジェクト番号: 401/2013 BO2 間葉系 MSC)。

1. 細胞培養

注:培地は事前に調製することができます。MAMおよび17-1012の培地は、10%(v / v)ウシ胎児血清(FBS)および2 mM L-グルタミンを添加したRPMIで構成されています。MACおよびMSCの培養培地は、グルタミン代替品( 材料表を参照)を含むダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)、10%(v / v)FBSを添加した4.5 g / L D-グルコースで構成されています。

1. 80%のコンフルエントが達成されるまで細胞を採取し、継代します。
2. 5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄し、ピペットを使用してフラスコからPBSを吸引します。
   注:このステップにより、プロテアーゼ阻害剤を含む残留完全な培地を確実に除去します。....

結果

5-ALA PDT被ばく後、MSC対照群は5-ALA PDT照射後の移動に関して顕著な影響を示さなかった(図2A、I、V、IX)。対照的に、MAC細胞(図1B および 図2A、iii、vii、xi)および17-1012(図1B および 図2A、ii、vi、x)細胞は、300秒または2,000秒の光曝露の両方で遊走電位の低下を示した。対照的に、MAM細胞株(腎がんの骨転移に由来)では、遊走能に関して顕著な影響は観察されませんでした。しかし、MAC細胞株(p = 0.009)では、2,000秒のばく露時間で生存率の低下が観察されました。対照的に、17-1012細胞株は、300秒のばく露で増加傾向(p = 0.007)を示し、続いて2,000秒で減.......

ディスカッション

現在の治療選択肢にもかかわらず、がんの治療反応はさまざまであり、初期の組織構造を維持しながら骨転移を治療するための新しいアプローチや併用療法が提唱されています。この文脈では、PDTは有望な代替手段です。単純化した観点から見ると、PDTは、(1)光増感剤(PS)と呼ばれる無毒の光感受性色素、および(2)PSの吸収スペクトルに一致し、それを活性化する適切な波長の外部光源¹⁵の2つの基本成分から構成される。この研究では、転移性および原発性骨腫瘍細胞株¹¹に対する5-ALA-PDT曝露の影響を調査しました。

全体として、PDT療法に対する感度は、異なるがん骨細胞株間で観察されました。1 mM 5-ALA PDT曝露は、浸潤性乳管がんの骨転移の遊走能および細胞生存率を損なったが、骨の巨細胞腫瘍については遊走能に関して有意な影響は観察されなかった。さらに、腎癌の骨転移またはMSC群¹¹.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PDT	IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA	n/a	http://www.illuminoss.com
5-アミノレブリン酸 (5-ALA) 光増感剤	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	A7793	10 mg
6 ウェルプレート	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	657160
8 Well Chamber Slides	SARSTEDT AG & Co. KG,Munich, Germany	94.6140.802
96 Well plates (F-buttom)	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	655180
CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS-Assay)	Promega, Fitchburg, Wisconsin, USA	G3580
Cellular Senescence Assay	Biotrend Chemikalien GmbH, Köln, ドイツ	CBA-231	定量的老化関連 ß-ガラクトシダーゼアッセイ
Coomassie Brilliant Blue R250	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	35055	0.5% (w/v)
Culture-Inserts 2Well	ibidi GmbH, Gräfelfing, ドイツ	80209
DMEM (1x) + GlutaMax-I	Life Technologies, Carlsbad, Kalifornien, USA	31966-021
ウシ胎児血清 (FBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	F7524
蛍光マイクロプレートリーダー	Promega, Madison, Wisconsin, USA	GlowMAx®, GM3510
血球計算盤	Hecht Assistent,Sondheim, Deutschland	4042
ImageJ	National Institutes of Health, Be-thesda, Maryland, USA	ImageJ (version: 1.53a)	科学画像を処理および分析するためのソフトウェア; https://imagej.net/
逆位相差顕微鏡	Leica, Wetzlar, Germany	DM IMBRE 100
Methanol AnulaR Normapur	VWR, Fontenay-Sous-Bois, France	20847.307
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	158127	Powder, 95% purity
PDT device (light box and accessories)	IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA	n/a	ブルーライト 436 nm, 36 J/cm2 http://www.illuminoss.com
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	15140-122	10,000 U/mL ペニシリン 10,000 μg/mL ストレプトマイシン
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts,	USA 10010-015
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	21875034
Spectrophotomete/ microplate reader	BioTek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall, Germany	EL800
Trypan Blue dye 0.4%	Sigma-Aldrich, St米国ミズーリ州ルイ	T8154
トリプシン-EDTA 10x	Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA	T4174